南师大细胞生物学考研课件第3章+细胞生物学研究方法

1、第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法1 1细胞形态的结构结构的观察方法细胞形态的结构结构的观察方法2 2细胞及其组分的分离、显示鉴定及定量技术细胞及其组分的分离、显示鉴定及定量技术3 3细胞体外操纵技术细胞体外操纵技术知识点：知识点：第一节第一节 细胞形态结构和观察方法细胞形态结构和观察方法细胞的形态观察细胞的形态观察 细胞的大小和计量单位细胞的大小和计量单位鸵鸟卵鸵鸟卵 =12-15cm人卵细胞人卵细胞 =0.1mm多数细胞多数细胞 =10-30m血细胞血细胞 =7m 显微镜观察范围显微镜观察范围 肉眼观察范围肉眼观察范围显微镜观察范围显微镜观察范围& &肉眼观

2、察范围肉眼观察范围细胞生物学及成像技术发展史细胞生物学及成像技术发展史1717世纪中叶的滑竿显微镜世纪中叶的滑竿显微镜荷兰眼镜商詹荷兰眼镜商詹Zaccharias Zaccharias JanssenJanssen制造的第一台复合制造的第一台复合式显微镜式显微镜 Robert HookeRobert Hooke于于16701670年年制造的显微镜制造的显微镜现代显微镜现代显微镜 简洁紧凑的设计节省了镜座占简洁紧凑的设计节省了镜座占用空间用空间 人机工程学设计，操作简单人机工程学设计，操作简单 方便地安装各种方便地安装各种CCDCCD数码成像数码成像装置装置 出色的光学性能与系统的优良出色的光学

3、性能与系统的优良品质品质 最新的最新的UIS2UIS2光学系统赋予显微光学系统赋予显微图像前所未有的优异对比度图像前所未有的优异对比度价格：几万至几十万元！价格：几万至几十万元！一一. .光学显微镜技术光学显微镜技术体式光学显微镜体式光学显微镜光学显微镜光学显微镜（一）普通复式光学显微镜技术（一）普通复式光学显微镜技术 目镜目镜 光学放大系统光学放大系统 物镜物镜 光源光源1. 1.组成组成 照明系统照明系统 折光镜折光镜 聚光镜聚光镜 机械和支架系统机械和支架系统光学显微镜的成像原理光学显微镜的成像原理 使用两个凸透镜，一个凸透镜把另外一个所成的像进一步放大，使用两个凸透镜，一个凸透镜把另外

4、一个所成的像进一步放大，这就是复合式显微镜的基本原理。如果两个凸透镜一个能放大这就是复合式显微镜的基本原理。如果两个凸透镜一个能放大1010倍，另一个能放大倍，另一个能放大2020倍，那么整个镜片组合的放大倍数就是倍，那么整个镜片组合的放大倍数就是101020=20020=200倍。复合显微镜中通常有两级串联放大系统，一级为倍。复合显微镜中通常有两级串联放大系统，一级为物镜，另一级为目镜。物镜，另一级为目镜。2. 2.分辨率分辨率：能够区别开的两个物点之间的距离能够区别开的两个物点之间的距离 0.61 D= N.Sin( /2) 最大分辨率最大分辨率= =0.2m3. 3.制样方法制样方法 固

5、定、脱水、包埋、切片、染色、观察固定、脱水、包埋、切片、染色、观察正置光学显微镜正置光学显微镜倒置显微镜光路系统倒置显微镜光路系统正置显微镜与倒置显微镜光路比较正置显微镜与倒置显微镜光路比较（二）荧光显微技术（二）荧光显微技术什么是荧光什么是荧光 ? ? 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光度辐射光冷光。即：物质吸收短波光，发射冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。出的长波光。 显微镜荧光利用光源激发显微镜荧光利用光源激发光化荧光光化荧光 Specim

6、en absorbs light at one wavelength (the excitation wavelength) and emits light (fluoresces) at a specific and longer wavelength. Most fluorescent dyes emit visible light. 将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。免疫荧光免疫荧光 技术技术l Revealing Specific Proteins in Fixed Cells l Reve

7、aling Specific Proteins in Living Cellsl Determining the Intracellular Concentration of Ca2+ and H+ Ions l The fluorescent properties of certain dyes, such as fura-2, facilitate measurement of the concentration of free Ca2+ in the cytosol. （三）激光扫描共聚焦显微镜技术（三）激光扫描共聚焦显微镜技术价格：几百万元！价格：几百万元！传统的光学显微镜使用的是场光

8、源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。 基本原理基本原理激光扫描共聚焦成像系统激光扫描共聚焦成像系统共聚焦显微镜的优点共聚焦显微镜的优点l用激光作光源，逐点、逐

9、行、逐面快速扫描。l能显示细胞样品的立体结构。l分辨力是普通光学显微镜的3倍。l用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。Fluorescent MicroscopeObjectiveArc LampEmission FilterExcitation DiaphragmOcularExcitation FilterObjectiveLaserEmission PinholeExcitation PinholePMTEmissionFilterExcitation FilterConfocal Microscope3D Image Reconstructionzxyzxyzyy3D I

10、mage Reconstructionxyzyyz3D Image Reconstruction.Islet of LangerhansTriple labelled islet of Langerhans extracted from Pancreas. Labelled with FITC-anti-isnsulin (green), CY3-ant-somatostatin (red) and CY5-anti-glucagon (blue).Mouse Oocytes -calcium.Demonstrates nuclear Calcium fluctuations in mouse

11、 oocytes at the onset of meiotic resumption. NuCa green (Mol Probes Inc) has been used as the Calcium probe.t3 colour projection of 18 optical sections through a living leaf. Visualised by auto-fluorescentLCSM Image of a Xenopus Melanophoremicrotubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue)http:

12、//（四）数字成像显微技术（四）数字成像显微技术摄像机随机摄取同一区域的多幅图象，信号摄像机随机摄取同一区域的多幅图象，信号通过计算机放大，多幅图相加并平均，使信号通过计算机放大，多幅图相加并平均，使信号反差增强。反差增强。图象数字化处理技术提高信图象数字化处理技术提高信/ /噪比噪比An example of the images produced by todays improved microscopes is presented in Figure 1, which illustrates a digitally captured multicolor

13、fluorescence image of tissue culture cells taken on an Eclipse E600 microscope using the CFI60 40fluorite objective and Nikons new DXM 1200 digital camera.暗视野显微镜暗视野显微镜（dark field microscope）的聚光的聚光镜中央有挡光片，使照明镜中央有挡光片，使照明光线不直接进入物镜，只光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边的背景是黑

14、的，物体的边缘是亮的。利用这种显微缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至镜能见到小至 4-200nm的的微粒子，分辨率可比普通微粒子，分辨率可比普通显微镜高显微镜高50倍。倍。（五）暗场显微技术（五）暗场显微技术Darkfield MicroscopyDictydium cancellatumThe photomicrograph below illustrates the slime mold fungus Dictydium cancellatum under dark field illumination, imaged with a 10objective on a Nikon Optip

15、hot microscope.（六）、相差显微镜（六）、相差显微镜 相差显微镜（相差显微镜（phase contrast microscope）由）由PZernike于于1932年发明，并因此获年发明，并因此获1953年诺贝尔物理年诺贝尔物理 奖。这种显微镜最奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折

16、射，偏离了原来的光路，变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了同时被延迟了1/4（波长），如果再增加或减少（波长），如果再增加或减少1/4，则光程差，则光程差变为变为1/2，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处：在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处：1. 环形光阑（环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光作用是使透过聚光器的光线形成空心光 锥，焦聚到

17、标本上。锥，焦聚到标本上。2. 相位板（相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。分为两种：。分为两种： A+相板：将直射光推迟相板：将直射光推迟1/4，两组光波合轴后光波，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。（或称负反差）。 B+相板：将衍射光推迟相板：将衍射光推迟1/4，两组光线合轴后光波，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构

18、比周围介相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。质更加变暗。图图2-6 相差显微镜照明原理相差显微镜照明原理图图2-7 一种介壳虫的染色体（一种介壳虫的染色体（PCM照片）照片）（七）、微分干涉差显微镜（七）、微分干涉差显微镜 1952年，年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜分干涉差显微镜 (differential interference contrast (DIC) microscope)，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一

19、点，折射率差别更大，故相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。影像的立体感更强。调节调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。感，类似大理石上的浮雕。DIC显微镜使细胞的细微结构，特别是一些较大的细胞器，如显微镜使细胞的细微结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移

20、植、转基因动物等生物工程的显微操作常在这种显注入、核移植、转基因动物等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。微镜下进行。Fig. 1-2: A fibroblast in tissue culture visualized with four types of light microscopy. The image in (A) was obtained by the simple transmission of light through the cell, a technique known as bright-field microscopy. (B) Phase-contrast m

21、icroscopy; (C) DIC microscopy; and (D) dark-field microscopy.四种观察方式比较四种观察方式比较（七）录像增加反差显微技术（七）录像增加反差显微技术录像机录像机+ +图象处理技术图象处理技术高度光敏感摄像机高度光敏感摄像机 获取信号可以数字化后输入计算机获取信号可以数字化后输入计算机计算机计算机弥补光学系统的缺点而达到理论上的分辨率弥补光学系统的缺点而达到理论上的分辨率 0.61分辨率分辨率 D = N=1, Sin180/2=1 N.Sin( /2) 越小分辨率越高越小分辨率越高 人们寻找更短波长的照明物质以提高分辨率人们寻找更短波长

22、的照明物质以提高分辨率光学显微镜光学显微镜的分辨率在理论上不能小于的分辨率在理论上不能小于0.2nm, ,这是因这是因为受光波波长的局限为受光波波长的局限, , 即可见光的波长不能小即可见光的波长不能小400nm。电镜电镜是利用电子束对样品放大成像的显微镜，是利用电子束对样品放大成像的显微镜， 电子束电子束波长为波长为0.01-0.9nm，因而分辨率大大提高。因而分辨率大大提高。二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术（一）电子显微镜的基本知识（一）电子显微镜的基本知识1. 电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数分辨本领：分辨本领：电镜在最佳状态下的分辨率可达电镜在最

23、佳状态下的分辨率可达0.2nm放大倍数：放大倍数：电镜比光镜观察到更加细微的结构，主要是电镜比光镜观察到更加细微的结构，主要是因为电镜具有更高的分辨率而不是通常所说的放大倍数因为电镜具有更高的分辨率而不是通常所说的放大倍数高。高。2.电镜与光镜的基本区别电镜与光镜的基本区别 光镜光镜 电镜电镜光源光源 可见光（可见光（300-700nm） 电子束电子束 紫外光（紫外光（200nm）分辨率分辨率 100-200nm 0.1nm透镜透镜 玻璃透镜玻璃透镜 磁透镜磁透镜真空真空 无要求无要求 1.3310-310-5 PaTEM3.电镜的基本构造电镜的基本构造电子照明系统电子照明系统 电子枪电子枪

24、（高频电流加热钨丝发出电子）（高频电流加热钨丝发出电子） 聚光镜（静电透镜）聚光镜（静电透镜）汇聚电子束汇聚电子束电磁透镜成像系统电磁透镜成像系统 物镜、中间镜、放大镜物镜、中间镜、放大镜真空系统真空系统 保持电子枪、镜筒和记录系统的高真空保持电子枪、镜筒和记录系统的高真空记录系统记录系统 荧光屏和荧光屏和 感光胶片感光胶片电源系统电源系统 供给高压、恒电电压和电流供给高压、恒电电压和电流电镜的类型电镜的类型透射电镜透射电镜 TEMTEM（Transmission ElectronMicroscope） 内部结构观察内部结构观察扫描电镜扫描电镜 SEM SEM （Scanning Electr

25、on Microscope）外部形态观察外部形态观察扫描透射电镜扫描透射电镜 STEMSTEM（Scanning Transmission Electron Microscope）外部形态及内部结构观察外部形态及内部结构观察超高压透射电镜超高压透射电镜 （Ultra-voltage Transmission Electron Microscope）活体观察活体观察扫描电镜扫描电镜结构和原理结构和原理扫描电镜利用从块状扫描电镜利用从块状样品表面收集到的信号电子成像样品表面收集到的信号电子成像, ,因此因此相当于一种相当于一种“反射式反射式”显微镜显微镜( (个别情个别情况下也可采用透射模式况下也

26、可采用透射模式) )。This mold was growing on a block of Romano cheese in my refrigerator. It was bluish green, and is probably a Penicillum. The parts of mold you usually see are the reproductive structures; the hyphae underneath them are the parts that feed on whatever its growing on. In this picture the ye

27、llow parts are called conidiophores, and the green spores are called conidiaUnstained bacteriophage T4.A freeze-dried preparation of bacteriophage T4 and TMV. The virus consists of a head (normally full of double-stranded DNA), a tail tube, a baseplate at the end of the tail tube and thin tail fiber

28、s attached to the base plate. The particle at the lower right has lost its DNA. The mass per unit length of a tail fiber is 866 +/- 76 kDa, indicating it is a trimer. The full-scale of the dark-field micrograph is 0.512 microns. （二）主要电镜技术介绍（二）主要电镜技术介绍生物样品电镜技术的特殊要求生物样品电镜技术的特殊要求样品薄样品薄 ultrathin sectio

29、n精细结构好精细结构好 fixation具反差具反差 staining主要电镜技术主要电镜技术1. 超薄切片技术超薄切片技术 2. 负染技术负染技术3. 冰冻电镜技术冰冻电镜技术4. 金属投影技术金属投影技术5. 冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术6. 暗场电镜技术暗场电镜技术7. 整装细胞电镜技术整装细胞电镜技术8. 包埋包埋去包埋剂超薄切片电镜技术去包埋剂超薄切片电镜技术9. 高分辨率电镜技术高分辨率电镜技术10. 扫描电镜技术扫描电镜技术1. 超薄切片技术超薄切片技术 固定固定 包埋包埋 切片切片 染色染色 观察观察2.负染技术负染技术重金属盐包埋重金属盐包埋Elect

30、ron micrograph of negatively stained synthetic actin filaments. Actin filaments are double-helical polymers consisting of two linear strands of 42-kD actin subunits that are helically twisted around each other. The inset reveals a 3-D volume-rendered representation of a filament 3-D reconstruction.负

31、染就是用重金属盐如磷钨酸或负染就是用重金属盐如磷钨酸或醋酸双氧铀对铺展在载网上的样醋酸双氧铀对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达辨力可达1.5nm左右左右Several of the T bacteriophage viruses3. 冰冻电镜技术冰冻电镜技术避免化学固定剂、包埋剂等有机溶剂的影避免化学固定剂、包埋剂等有机溶剂的影响，最大限度地保持样品真实性响，最大限度地保持样品真实

32、性Fig. 1-7: Traditional thin section of a cultured fibroblast that was quick-frozen by slamming it onto a liquid helium -cooled copper block, and then freeze-substituted. Within the stress fibers (SF; see also Fig. 1-3), individual actin filaments (see also Fig. 8) are clearly resolved. The unaggrega

33、ted, wider filaments (MT) are microtubules, and the small dark particles (R) represent ribosomes4. 金属投影技术金属投影技术铂、钯、铬等在真空中加热蒸发铂、钯、铬等在真空中加热蒸发Fig. 1-9: Electron micrograph of a mixture of myosin and nuclear lamin (L) dimers after glycerol spraying/rotary metal shadowing with platinum. Both molecules ar

34、e composed of two globular heads linked to a common rod-like tail, approximately 100 nm long in the case of myosin and 52 nm in the case of nuclear lamin.Fig. 1-12: Surface topography of metal-coated bacteriophage T4 polyheads recorded by STM (a, c) and by TEM (b, d). Raw data, topograph recorded in

35、 the STM (a), and shadowgraph in the TEM (b). Surface reliefs (c, d) computed (c) from STM topograph in (a), and (d) from TEM shadowgraph in (b).5. 冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术冰冻蚀刻冰冻蚀刻 冰冻蚀刻冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。标本置于。标本置于-100度的干冰或度的干冰或-196 度的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断度的液氮中，进行冰冻。然后

36、用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出了开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面断裂面 的结构。冰升华暴露出标本内部结构的步骤的结构。冰升华暴露出标本内部结构的步骤称为蚀刻称为蚀刻（etching）。蚀刻后，再向断裂面上喷涂。蚀刻后，再向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于电镜下观察。电镜下的标本蚀刻面的形态，可置于电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。影像即代表标本中细胞

37、断裂面处的结构。ABC透射电镜照片与冰冻断透射电镜照片与冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜照片裂和冰冻蚀刻电镜照片比较比较三、扫描隧道显微镜三、扫描隧道显微镜利用量子力学中的隧道效应，利用量子力学中的隧道效应，当原子尺度的针尖在不到当原子尺度的针尖在不到1 1纳纳米的高度上扫描样品表面时，米的高度上扫描样品表面时，针尖与样品之间产生隧道效针尖与样品之间产生隧道效应，并且隧道电流应，并且隧道电流(I)(I)与针尖、与针尖、样品间距样品间距(d)(d)有一指数关系，有一指数关系，这样这样d d转化为转化为I I的函数可以测的函数可以测定，针尖的位置就可以测定，定，针尖的位置就可以测定，由此样品的表面形貌可以测

38、由此样品的表面形貌可以测定。定。Figure 1-3. Comparison of constant-heightand constant-current mode for STMFigure 1-2. Schematic of tip and sample interactionHere is a STM image showing iron atoms (Fe) adsorb on a copper (111) surface forming a “quantum corral” in a very low temperature (4K). Actually, the image sho

39、ws the contour of the local density of electron states. The corral is about 14.3 nm in diameter.原子力原子力显微镜显微镜ATOMIC FORCE MICROSCOPY一种利用原子与分子间的相互作用力来观察物体表面微观形貌的新型实验技术。它有一根纳米级的探针，被固定在可灵敏操控的微米级弹性悬臂上。当探针很靠近样品时，其顶端的原子与样品表面原子间的作用力会使悬臂弯曲，偏离原来的位置。根据扫描样品时探针的偏离量或振动频率重建三维图像，就能间接获得样品表面的形貌或原子成分。基本原理基本原理提供真正的三维表面

40、图 不需要对样品的任何特殊处理 在常压下甚至在液体环境下都可以良好工作 One of the advantages of AFM is that it can image the non-conducting surfaces. So it was immediately extended to the biological systems, such as analyzing the crystals of amino acids and organic monolayers.第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一一. . 细胞及细胞组分的分离与纯化细胞及细胞组分的分离与纯化（

41、一）细胞的分离技术（一）细胞的分离技术1. 破坏细胞外基质及细胞连接破坏细胞外基质及细胞连接 （蛋白水解酶和（蛋白水解酶和EDTA）2. 从混合细胞群体中分离出不同类型细胞从混合细胞群体中分离出不同类型细胞 物理物理（沉降、离心（沉降、离心 / / 粘附能力）粘附能力） 免疫免疫（耦联材料：胶原、多糖小珠或塑料）（耦联材料：胶原、多糖小珠或塑料） 荧光荧光染料耦联抗体标记，流式分选染料耦联抗体标记，流式分选（二）超离心技术（二）超离心技术细胞群体细胞群体细胞崩解细胞崩解（低渗、超声粉碎、强制过滤或研磨）（低渗、超声粉碎、强制过滤或研磨）差速离心差速离心亚细胞组分和各种颗粒亚细胞组分和各种颗粒细

42、胞内组分分离细胞内组分分离（三）细胞的选择性抽提（三）细胞的选择性抽提 化学抽提法选择性地抽提细胞的某些成分化学抽提法选择性地抽提细胞的某些成分如：研究细胞骨架如：研究细胞骨架Cell Triton等非离子去垢剂抽掉等非离子去垢剂抽掉CM+可溶性成分可溶性成分骨架蛋白质体系骨架蛋白质体系 进一步抽提进一步抽提核骨架核骨架-核纤层核纤层-中间纤维体系中间纤维体系 蛋白酶消化蛋白质蛋白酶消化蛋白质 核骨架核骨架+DNA （四）柱层析技术和电泳技术分析蛋白（四）柱层析技术和电泳技术分析蛋白质与核酸分子质与核酸分子可溶性细胞提取液中的蛋白质可用柱层析方法纯化可溶性细胞提取液中的蛋白质可用柱层析方法纯化

43、 蛋白质蛋白质 分子量分子量 带电性带电性 分子亲和性分子亲和性蛋白分子量和亚基组成可用蛋白分子量和亚基组成可用SDS( (十二烷基磺酸钠）十二烷基磺酸钠）- -聚聚丙烯酰胺凝胶电泳丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定测定分子量较大的不同核酸序列用琼脂糖凝胶电泳分析分离分子量较大的不同核酸序列用琼脂糖凝胶电泳分析分离二二. . 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖、脂细胞内核酸、蛋白质、酶、糖、脂等的显示方法等的显示方法 DNA Feulgen反应 Shiffs试剂 紫红色 多糖多糖 PAS反应 Shiffs试剂 脂肪脂肪 四氧化锇四氧化锇+ +不饱和脂肪酸不饱和脂肪酸= =黑色黑色 苏丹苏丹（深红色）（深

44、红色） 蛋白质蛋白质 Millon反应反应 红色红色 酶酶 如碱性磷酸酶的格莫瑞(Gomori)方法 三、特异性蛋白抗原的定位和定性三、特异性蛋白抗原的定位和定性（一）免疫荧光技术（一）免疫荧光技术 免疫学方法免疫学方法+ +荧光标记技术荧光标记技术 主要程序主要程序 荧光抗体制备、标本处理、免疫染色、观察记录荧光抗体制备、标本处理、免疫染色、观察记录（二）免疫电镜技术（二）免疫电镜技术 免疫学方法免疫学方法+ +电镜标记技术电镜标记技术 主要程序主要程序 同上同上（三）免疫印迹技术（三）免疫印迹技术（Western Blotting) )聚丙烯酰胺凝胶电泳过的蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳过的蛋白

45、质转移到硝酸纤维素滤膜上转移到硝酸纤维素滤膜上1. 与某蛋白抗原的第一抗体反应；与某蛋白抗原的第一抗体反应；2. 与酶相连的抗第一抗体的第二抗体反应；与酶相连的抗第一抗体的第二抗体反应；3. 酶与对应底物反应，显色。酶与对应底物反应，显色。( (四）放射免疫沉淀分析四）放射免疫沉淀分析(RIPA)技术技术可以对目的抗原（蛋白质）进行定性定量分析可以对目的抗原（蛋白质）进行定性定量分析1. 靶蛋白的同位素标记靶蛋白的同位素标记2. 裂解细胞裂解细胞3. 抗原抗体反应形成免疫复合物抗原抗体反应形成免疫复合物4. 收集与分离免疫复合物（通常用固化的收集与分离免疫复合物（通常用固化的protein A

46、)5. 对分离的免疫沉淀物中的标记化合物进行分析，用对分离的免疫沉淀物中的标记化合物进行分析，用聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS或发射自显影技术或发射自显影技术优点：优点：1.特异性高；特异性高；2.灵敏度高；灵敏度高； 3.运用脉冲标运用脉冲标记追踪可进行目的蛋白的动态分析。记追踪可进行目的蛋白的动态分析。四、细胞内特异核酸的定位与定性四、细胞内特异核酸的定位与定性（一）原位杂交技术（一）原位杂交技术用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸顺序用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸顺序光镜光镜电镜电镜( (二）二）Southern印迹技术印迹技术 Southern印迹技术：印

47、迹技术：把凝胶电泳上分离开的把凝胶电泳上分离开的DNA片段，通过扩散或电泳转移到硝酸纤维片段，通过扩散或电泳转移到硝酸纤维膜上，做成一个凝胶复制品。使该膜与放射性膜上，做成一个凝胶复制品。使该膜与放射性DNA探针杂交，通过放射自显影可辨认出与探针杂交，通过放射自显影可辨认出与DNA探针互补的特殊核苷酸顺序。探针互补的特殊核苷酸顺序。Northern印迹技术印迹技术：放射性探针与放射性探针与RNA杂交杂交过程过程。六、利用同位素技术研究生物大分子在细六、利用同位素技术研究生物大分子在细胞内的合成动态胞内的合成动态放射自显影：放射自显影：利用放射性同位素的电离辐射利用放射性同位素的电离辐射对乳胶对

48、乳胶( (含含AgBr或或AgCl) )的感光作用，显示样的感光作用，显示样品中同位素的研究方法。品中同位素的研究方法。灵敏度高灵敏度高如：如：1. 首次证明核仁是合成首次证明核仁是合成RNA的场所（尿嘧啶核苷的场所（尿嘧啶核苷首先掺入到核仁）；首先掺入到核仁）；2. 染色体的半保留复制。染色体的半保留复制。主要步骤：主要步骤：同位素标记的大分子前体的掺入同位素标记的大分子前体的掺入细胞内同位素所在位置的显示细胞内同位素所在位置的显示（一）显微放射自显影（一）显微放射自显影 仓鼠细胞核的仓鼠细胞核的3 3H-TdRH-TdR（二）电镜放射自显影（二）电镜放射自显影七、定量细胞化学分析技术七、定

49、量细胞化学分析技术（一）显微分光光度测定技术（一）显微分光光度测定技术Figure G.2. Schematic light transmission显微分光光度测定显微分光光度测定Spectrophotometry Use of the Spec 20（二）元素分析电镜技术（二）元素分析电镜技术电子束电子束 非弹性散射非弹性散射 样品样品 X射线射线非弹性散射电子非弹性散射电子失去的能量是一个特征值，用失去的能量是一个特征值，用它成像便能反映出元素的性质它成像便能反映出元素的性质. 能量损失谱成像技术能量损失谱成像技术(ESI)直观显示样品中某直观显示样品中某元素的分布元素的分布X射线也是一

50、个特征值射线也是一个特征值 X射线微区分析射线微区分析不直观不直观显示元素分布显示元素分布（三）流式细胞术与流式分选（三）流式细胞术与流式分选流式细胞术流式细胞术在流动的状态中检测细胞或颗粒的各项特性在流动的状态中检测细胞或颗粒的各项特性特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析分析可检测的样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿可检测的样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，实体组织，培养细胞刺液，洗脱液，实体组织，培养细胞流式分选流式分选以流动状态的单个细胞的各项特性进行细胞分离以流动状态的单个细胞的各项特性进行细胞分离也叫作也叫作 Fluo

51、rescence-Activated Cell Sorting (FACS)1、概念、概念2、流式工作原理、流式工作原理 通过激光激发高速流动的单个细胞所携带的各种通过激光激发高速流动的单个细胞所携带的各种荧光素和荧光染料，并检测由此产生的散射光和荧光素和荧光染料，并检测由此产生的散射光和荧光的发射光，通过各种光信号的强弱来反应细荧光的发射光，通过各种光信号的强弱来反应细胞的各种特征。胞的各种特征。Flow CellInjector TipSheath fluidPurdue University Cytometry Laboratories3、流式分析的类型、流式分析的类型荧光标识荧光标识

52、Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)机械力分选机械力分选 Mechanical Sorting电荷分选电荷分选 Electrostatic Sorting 488 nm laser+-Fluorescence Activated Cell SortingCharged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFSC SensorFluorescence detectorMechanical Sorting:Takes place within a Flow cellWhen a sort decision

53、“Green cell” has been made it is diverted into a catcher tube either by moving the tube into the stream:Laser beam interrogates cellso oooooooooo ooooor by applying an acoustic pulse to the stream to divert the cell into the tube.ooooooooooooooo ooo oHydrodynamic focusingtakes place within a flow ce

54、ll. o oooo ooo ooo o o oo oo ooo o oo o oooo o o oo o ooooo o o o o o o oooooElectrostatic Sorting : Stream-in-airLaser interrogation and signal processing followed by sort decision : white sort right, blue sort left, green or black no sort. oooo oooo oooo left waste rightVarious collection devices

55、can be attached :tubes, slides, multi-well plates.Hydrodynamic focusing in a nozzle vibrated by a transducer produces a stream breaking into droplets.o o o o oo o o o o o o o o o o o o o o o o o o oElectronic delay until cell reaches breakoff point. Then the stream is charged : + if white - if blue.

56、- +Charged droplets deflect by electrostatic field from plates held at high voltage (+/- 3000 volts). o- o+ o o+o- o o+-+第三节第三节 细胞培养、细胞工程与显微技术细胞培养、细胞工程与显微技术一、细胞培养一、细胞培养（一）原核生物培养（一）原核生物培养 细菌培养细菌培养（二）真核单细胞生物培养（二）真核单细胞生物培养 酵母、四膜虫酵母、四膜虫（三）动物细胞培养（三）动物细胞培养（三）动物细胞培养（三）动物细胞培养原代细胞原代细胞 110代以内的细胞代以内的细胞传代细胞传代细胞 在体外培养条件下持续传代培养的细胞在体外培养条件下持续传代培养的细胞接触抑制接触抑制 贴壁生长细胞分裂生长到表面接触时停止贴壁生长细胞分裂生长到表面接触时停止分裂生长的现象分裂生长的现象细胞株细胞株 (Cell strain) 极少数细胞可以在传极少数细胞可以在传10代后可渡代后可渡过危机而传下去过危机而传下去40-50代次并仍保持原