RNA干扰技术在生物医药发展的意义与前景

1、L/O/G/ORNA干扰技术在生物医药发展干扰技术在生物医药发展的意义与前景的意义与前景梅洛梅洛(Craig Mello)生于生于1960年，是被恐龙骨引入科学世界的。年，是被恐龙骨引入科学世界的。梅洛童年时经常跟着父亲在美国梅洛童年时经常跟着父亲在美国西部寻找化石。从那时起，他就西部寻找化石。从那时起，他就迷上了远古时代、地球历史和人迷上了远古时代、地球历史和人类生命的起源等问题。高中时代，类生命的起源等问题。高中时代，梅洛的兴趣逐渐转移到了基因工梅洛的兴趣逐渐转移到了基因工程方面。程方面。法尔法尔(Andrew Fire)1959年出年出生在美国加利福尼亚州，本科在生在美国加利福尼亚州，本

2、科在加利福尼亚大学伯克利分校主修加利福尼亚大学伯克利分校主修数学，仅用数学，仅用3年时间就拿到学位。年时间就拿到学位。与梅洛类似，他逐渐对涉及生命与梅洛类似，他逐渐对涉及生命奥秘的遗传学产生兴趣，并将其奥秘的遗传学产生兴趣，并将其作为自己终身的学术追求。作为自己终身的学术追求。Craig MelloAndrew Fire1.RNAi的发现的发现90年代初，美国和荷兰的两个转基因植物实验组Rich Jorgensen和同事在对矮牵牛(petunias)进行的研究，发现一个奇怪的现象：(cosuppression)野生型试验预测19951995年，康乃尔大学的年，康乃尔大学的Su GuoSu Gu

3、o博士博士在试图阻断秀丽新小杆线虫在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)(C.elegans)的的par-1par-1基因时，发现基因时，发现了一个意想不到的现象。了一个意想不到的现象。利用反义利用反义RNARNA技术特异性地阻断上技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义中给线虫注射正义RNARNA以期观察到以期观察到基因表达的增强，但得到的结果是基因表达的增强，但得到的结果是二者都同样地切断了二者都同样地切断了par-1par-1基因的基因的表达途径。这是与传统上的解释正表达途径。这是与传统上的解释正好相反。该研究小组一直未能给这

4、好相反。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。个意外以合理解释。 1.RNAi的发现的发现1998年，fire和mello对以上实验进一步研究：1.RNAi的发现的发现正义正义RNA，反义，反义RNA对对unc-22基因的表达基因的表达表现轻微的干涉作用，而二者混合物却表现轻微的干涉作用，而二者混合物却引起了高效的沉默作用引起了高效的沉默作用基因沉默。基因沉默。正义RNA、反义RNA、二者混合物C.elegans，以干涉unc-22基因的表达电泳结果显示上述的正义和反义RNA混合物的主要成分是dsRNA。进一步研究表明只有与靶基因mRNA有同源序列的dsRNA才具有干涉作用。l由此他们认为，

5、Guo实验中令人意想不到的结果是由于对照组正义RNA中混有少量dsRNA的缘故。l于是，Fire和mello提出在Celegans体内dsRNA对有其同源序列的mRNA表 达具有高效的干涉作用。并将这一现象称为RNA干扰。1.RNAi的发现的发现1.RNAi的发现的发现 在1999年短短的一年间,发现RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物细胞中。2000年，又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在RNA干扰现象。 推 测RNA干扰是自然界中生物体抵抗外源基因或病毒侵入、 抑制转座子活性，保持基因自稳的一种方式。 2.RNAi

6、的机制的机制 RNAi：RNA interference（RNA干扰）； dsRNA：double-stranded RNA(双链RNA)，包含正义链和反义链； Dicer：RNase 家族成员，是dsRNA的特异性核酸内切酶 siRNA：Small interfering RNA (小干扰性RNA)， RNAi的关键效应分子，21-23nt大小的双链RNA； RISC： RNA-induced silencing complex（ RNA诱导沉默复合物），具有核酸内切、外切以及解旋酶活性； RdRP：RNA-dependent RNA polymerases，依赖RNA的RNA聚合酶，是RN

7、Ai的调节因子，使RNAi可以在生物体内传递；2.RNAi的机制的机制RISCRNAi：是指在进化过程中高度保守的、由dsRNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，也就是序列特异性的转录后基因沉默基因沉默。2.RNAi的机制的机制2.RNAi的机制的机制转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)TGS是转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基因沉默。这种类型的基因沉默，可能是因为基因特异的甲基化而导致；PTGS 则是指基因能够

8、在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA 存在这一现象。基因沉默1、siRNA的形成的形成2.RNAi的机制的机制siRNAs（21-23nt）long dsRNADicer 2、siRNA介导的介导的mRNA 降解降解 3、RNAi效应的放大效应的放大2.RNAi的机制的机制RISC: RNA-Induced Silencing ComplexExdonucleaseHomology search activityEndonucleaseHelicase53Target mRNAOH35P形成RISC复合物，降解目的mRNACapAAAAAACapAAAAAACapAAAAAA

9、循环复制酶Dicer切割3.RNAi在生物医药方面的应用在生物医药方面的应用12333在功能基因组学中的应用在功能基因组学中的应用在基因治疗中的应用在基因治疗中的应用在神经性疾病中的应用在神经性疾病中的应用3.RNAi在生物医药方面的应用在生物医药方面的应用目的：确定特定基因的功能方法：使其功能丧失或降低应用：利用RNAi技术证明ag-1基因与拟南芥花的发育有关（1）在功能基因组学中的应用）在功能基因组学中的应用AIDS（获得性免疫缺陷综合征）（获得性免疫缺陷综合征）HIV（人体免疫缺陷病毒）（人体免疫缺陷病毒）CorecepterCCR-5设计合成的设计合成的lenti病毒载体引入病毒载体引

10、入siRNA，激发，激发RNAi抑制了抑制了coreceptor-CCR5进入人体外周淋巴细进入人体外周淋巴细胞。由此治疗胞。由此治疗HIV-1病毒感染性疾病的可行性大大病毒感染性疾病的可行性大大增加。增加。（2）在基因治疗中的应用（）在基因治疗中的应用（AIDS）3.RNAi在生物医学方面的应用在生物医学方面的应用Lieberman J成功地利用成功地利用RNAi技术治愈了实验鼠技术治愈了实验鼠的肝炎的肝炎HBV（乙型肝炎病毒）（乙型肝炎病毒）Fas基因基因实验：给实验鼠尾部静脉注入实验：给实验鼠尾部静脉注入siRNA，以，以“沉默沉默”Fas基基因因结果结果：90%肝细胞接受这种肝细胞接受

11、这种RNA分子，并且使得分子，并且使得Fas蛋白蛋白含量降低到含量降低到10%；接受治疗的小鼠成活率为；接受治疗的小鼠成活率为82.5%；而未；而未接受治疗的小鼠有接受治疗的小鼠有40%在在3d内死亡。内死亡。不能用于人类。不能用于人类。（2）在基因治疗中的应用（）在基因治疗中的应用（HBV）3.RNAi在生物医学方面的应用在生物医学方面的应用 肿瘤 传统技术：单个癌基因 RNAi：针对具有同源性的多个基因 Kras基因 抑制血管生成（2）在基因治疗中的应用（肿瘤）在基因治疗中的应用（肿瘤）3.RNAi在生物医学方面的应用在生物医学方面的应用用RNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的

12、过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新的手段治疗各种恶性肿瘤。 慢性疼痛 RNAi是一种有潜力的新方法 ，通过导入可选择性降解疼痛相关蛋白的siRNA，从而解除疼痛，而且作为新的基因敲除手段，可用于发现疼痛通路中的新基因。 2003年，有人向鞘内注射靶向P2X3受体siRNA，有效降低了机械性痛觉过敏和触觉超敏。 这个结果表明RNAi可作为慢性疼痛研究与治疗一条新的途径。（3）在神经性疾病中的应用（慢性疼痛）在神经性疾病中的应用（慢性疼痛）3.RNAi在生物医学方面的应用在生物医学方面的应用3.RNAi在生物医学方面的应用在生物医学方面的应用 阿尔茨海默病（AD） 淀粉样前

13、体蛋白基因(App)、早老素1基因(PS1)、早老素2基因(PS2)、载脂蛋白E 4基因(apo E 4)； 通过RNAi阻断与AD发病有关的基因，可达到防治和治疗AD的目的（3）在神经性疾病中的应用（阿尔茨海默病）在神经性疾病中的应用（阿尔茨海默病）一般技术路线一般技术路线4.RNAi的研究方法的研究方法4.RNAi的研究方法的研究方法siRNA序列的设计序列的设计siRNA的一般结构：的一般结构： 21-23nt dsRNA dTdT（UU）（UU）dTdT （1）siRNA的序列应当选择靶基因的外显子序列，而且要避免距离起始密码和终止密码很近的地方； （2）避免连续的3个G； （3）不要

14、针对5和3端的非编码区； （4）GC含量最好在4555%之间；4.RNAi的研究方法的研究方法siRNA序列的设计序列的设计siRNA设计的原则：设计的原则：4.RNAi的研究方法的研究方法 序列同源性分析序列同源性分析：将siRNA序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列 / EST同源的序列。 阴性对照阴性对照：通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。siRNA序列的设计序列的设计4.RNAi的研究方法的研究方法l以核苷酸单体为原料，通过化学方法合成两条互补的长约 2123 nt的RNA单链，然后退火形成

15、双链复合体，这种方法所获得的产物纯度、干扰效率高，合成简单，但是制备周期长，作用时间短，而且价格昂贵，限制了其应用和推广。l是最贵的方法，但是却是最方便的。l许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。l最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究；l不适用于：筛选siRNA等长时间的研究。化学合成化学合成siRNA4.RNAi的研究方法的研究方法体外转录合成体外转录合成siRNAT7聚合酶和目标序列正反两条链聚合酶和目标序列正反两条链退火退火DNA双链双链正、反两条正、反两条RNA链链转录转录杂交

16、后用杂交后用RNA酶消化酶消化siRNA4.RNAi的研究方法的研究方法 siRNA表达载体在细胞中表达表达载体在细胞中表达siRNAs 以以PCR制备的制备的siRNA表达框进行体内转录表达框进行体内转录体内转录合成体内转录合成siRNAsiRNA表达载体表达载体BD Clontech公司推出的RNAi-Ready pSIREN 载体选用RNA聚合酶III家族的启动子，可在其下游插入一小段编码发夹结构的RNA的DNA模板构建成表达载体。siRNA表达框架表达框架(siRNA expresion casetes，SECs)是一种由是一种由PCR得得到的到的siRNA表达模板，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到表达模板，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。载体中。 siRNA表达框表达框表达框架包括：表达框架包括：一个RNA pol III启动子一段发夹结构siRNA一个RNA pol III终止位点优点：优点：SECs不需要载体克隆、测序等颇不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由为费时的步骤，可以直接由PCR得到。得到。SECs成为筛选成为筛选siRNA最有效工具。最有效工