食品毒理学基础

1、食品食品毒理学毒理学基础基础外推外推 毒理学实验的基本原则n在实验动物中产生的作用，可以外推与人n实验动物必须暴露于高剂量高剂量n成年的健康成年的健康的（雄性和雌性未孕）实验动物n与人的暴露途径相同1.外来化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人外来化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人n基本假设为：n人是最敏感的动物物种；n人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与体重（或体表面积）相关。2.实验动物必须暴露于高剂量实验动物必须暴露于高剂量n(1)毒性试验的设计并不是为了证明化学品的安全性，而是为了表征化学品可能产生的毒作用。 n(2)毒理学试验中实验模型所需的动物总是远少于处于危险中的

2、人群。3.成年的健康实验动物成年的健康实验动物n成年的健康（雄性和雌性未孕）实验动物作为一般人群的代表性实验模型。n幼年和老年动物、妊娠的雌性动物、疾病状态作为特殊情况另作研究 。4.与人的暴露途径相同n毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人接触该受试物的方式。毒理学试验的局限性毒理学试验的局限性n实验动物和人的敏感性不同n主观感觉主观感觉无法表述n剂量设置过大n动物数量有限数量有限毒理学试验的基本目的n受试物毒作用的表现和性质n剂量-反应研究n确定毒作用的靶器官n确定损害的可逆性可逆性1.受试物毒作用的表现和性质受试物毒作用的表现和性质n在急性和慢性毒性试验中，观察受试物对机体的有害作用

3、，对有害作用的观察应该是对每个实验动物进行全面的、逐项的观察和记录。n发现有害作用是进行剂量-反应(效应)研究的前提。LogDoseBiological ResponseNOEL: No Observable Effect LevelNOAEL:No Observable Adverse Effect LevelLOEL: Lowest Observable Effect LevelLOAEL: Lowest Observable Adverse Effect LevelFEL: Frank Effect Level2.2.剂量剂量- -反应反应( (效应效应) )研究研究 动物实验的职业道德

4、n给予人道主义的管理和处理n使痛觉和不适减少到最低程度n避免不必要的使用实验动物3R原则原则n替代替代（replacement)：应用无知觉材料代替使用活的有知觉脊椎动物n减少减少（reduction)：在能保证获取一定数量与精确度的数据信息的前提下，减少动物的使用数量。n优化优化（refinement)：在必须使用动物时，要尽量减少非人道程序的影响范围和程度。实验动物物种的选择n在代谢、生物化学和毒理学特征与人最接近最接近的物种n易于饲养和试验操作的物种n自然寿命不太长不太长的物种n经济并易于获得的物种经验性实验动物选择n两个物种：啮齿类、非啮齿啮齿类、非啮齿类n最常用的啮齿类是大鼠和小鼠；

5、非啮齿类为犬n豚鼠常用于皮肤刺激试验和致敏试验n兔用于皮肤刺激试验和眼部刺激试验n遗传毒理学用小鼠；致癌用大鼠n致畸用大鼠、小鼠、兔n迟发神经毒性常用母鸡常用实验动物生理学参数参数 猴 犬 猫 兔 大鼠 小鼠 成体体重 3.5 14 3.3 3.7 0.45 0.035寿命 (year) 16 15 14 6 3 1.5断乳体重 4.4 5.8 3 0.1-1.5 0.045 0.012妊娠期 168 63 63 31 21 20生殖年龄 54 9 10 6 3 2实验动物品系的选择n品系品系（strain):用计划交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物。n遗传学分类：近交系、杂交群、封闭群

6、、近交系、突变系动物、转基因动物近交系动物（近交系动物（Inbred strain animals） 又叫纯系动物。是采用同胞兄妹或亲子交配， 连续繁殖20代以上所培育出来的遗传上达到 高度一致的动物群。 基因纯合程度可达99.8%。 主要指啮齿动物；可出现近亲交配衰退。 亲子交配与兄妹交配不能混用。 亲子交配时必须采用年轻的双亲同其子女交配。 较大动物纯种培育很难获得成功，因为世代间 隔较长，费用较大，所以成功率低。 禽类和兔的血缘关系达到80%以上 （相当于兄妹交配四代）时，即可称 为近交系。1 基因位点纯合性n在人工控制下有系统地进行近亲交配，使杂合型祖代基因逐代地基因分离，从而逐渐提高

7、个体与群体的基因纯合率，在通过连续20代兄妹交配的培育之后近交系动物任何一个基因位点上的纯合概率高纯合概率高达986以上，品系内各个体在遗传上同属一种基因类型，因而能繁殖出完全一致的纯合子后代，并且动物群中不再携带未知的隐性基因，品系保留和表现所有的遗传性状，个体相互支配繁殖不会出现性状分不会出现性状分离离。 2 遗传组成的独特性 n在一个近交品系内，所有动物个体都可追溯到其原始的一对共同祖先。但它们只是从祖先的整个基因库里获得极少部分基因，这些基因的组合构成了品系的遗传组成。近交品系内的所有个体在遗传上完全相同，具有独特的表型特征，而不同的近交系之间的差异又非常明显，由于近交系的遗传同源性，

8、若对近交品系中的某一个体进行基因分析可得知整个品系的基因类型。 3长期遗传稳定性n 近交品系由于遗传组成的高度纯合性和同源性使其具有长期遗传的稳定性遗传的稳定性。 4均一性 n近交品系内个体间在表型上具有均一性均一性这是遗传同源性的结果，尤其是那些由遗传决定的生物学特征。杂交群动物及其特点n杂交群动物：指两个不同的近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代第一代动物。n例如：C57BL/6JDBA/2B6D2F1 B6为 C57BL/6J的缩写，D2 为 DBA/2的缩写。 1 具有杂交优势n杂种一代动物具行较强的生命力，对疾病的抵抗力强，寿命长，容易饲养，在很大程度亡克服了因近交繁殖引起的近交

9、衰退现象，适合于进行各种长期慢性实验。 2 遗传和表现型上的均质性n杂交群动物与一般的F1代动物不同，它虽然为杂合体，但具有与近交系相似的个体均质性，具有较高的一致性，不容易受环境因素变化的影响。3具有杂合的遗传组成 n F1代动物是杂合体同时具有两个亲本品系的基因，个体之间的基因型又是同一的，因其具有两个亲本的特点，可接受两个亲本品系的细胞、组织、器官和肿瘤移植，适用于免疫学和发育生物学等领域的研究。封闭群动物及其特点n封闭群：一个种群在5年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所随机交配繁殖的动物群。封闭群又称远交群。n封闭群动物的杂合性，避免了近交衰退的出现，因此具有较强的繁

10、殖力和生活力；n封闭群动物的遗传组成具有很高的杂合性；n封闭群动物常因基因突变而导致动物某些方面异常突变系概念及其特点n突变系是指正常染色体的基因发生了突变，从而具有某种特殊性状表型的各种遗传缺陷的品系。n突变系动物有助于认识生命的复杂性；n突变系动物可以作为人类疾病的动物模型在基础医学和临床医学中应用。n裸鼠裸鼠转基因动物n转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。实验动物按微生物分类n按微生物学控制标推或微生物净化程度，目前国际上一般将实验动物分为四个等级，即无菌无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物和普通动动物、悉生动物、无特定病原体动物和

11、普通动物。物。无菌动物n在自然界中并不存在，是在隔离器中经人工取得仔体，用无菌母体代乳或人工哺乳，经净化培育得到。无特定病原体动物n饲育在屏障或隔离系统中，通过无菌动物、悉生动物、无特定病原菌动物获得的。笼具、饲料饮水要经过特殊处理，并有严格的检疫、消毒隔离制度。悉生动物悉生动物n又称清洁动物，种系清楚，没有该动物特有的病原菌。饲养在屏障系统中，空气要经过净化、饲养室套保持正压，进入室内的一切物品要经过消毒灭菌，工作人员进入要洗澡和穿灭菌工作服，动物饮灭菌水。普通动物n是在微生物控制上要求最低的动物，饲养在开放系统，空气未净化，可饮自来水，房舍要求有通风设施，人员进入要穿工作服专用鞋帽。实验动

12、物设施的分类n开放系统：饲育环境与外界相同；有强力通风设施、饲料饮水和垫料要求不被污染，应防鼠和防昆虫措施。n屏蔽系统屏蔽系统：洁净度万级万级，环境封闭，送入的空气要过滤。饲料饮水和垫料要灭菌，饲养人员要经过淋浴、穿无菌工作服，戴口罩手套。n隔离系统：洁净度百级洁净度百级，以隔离器为主体，送入的全新风达百级以上，一切物品经严格灭菌，饲养人员不得入内。【上海斯莱克实验动物有限责任公司】【中国科学院上海实验动物中心 】【国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心】 实验动物个体的选择实验动物个体的选择n性别：一般雌雄各半，特殊？特殊？n年龄和体重：急性毒性用成年，慢性用年幼或初断乳的实验动物。n生理状态

13、：避免妊娠反应，特殊？n健康情况：将康 在实验前观察5-7天实验动物的管理n动物的管理：接收、饲养、来源、鉴别等记录n环境条件控制：温度、湿度、通风、光照、噪音、垫料等n设施管理：清洁卫生、废弃物管理等实验动物的准备n实验动物前的准备：观察、性别辨认n实验动物的抓取和固定n实验动物的编号n实验动物随机分组实验样品的制备n了解样品的纯度和杂质n化学结构和理化性质n挥发性、溶解性、酸碱度、稳定性n所需样品总量的计算总量=（A B C D) 1.2A ：每组动物数；B：各处理组的计量和C： 染毒次数： D：动物的平均体重溶剂和助溶剂的要求n无毒或实际无毒n与样品不起反应n不影响样品的毒效n无特殊刺激

14、性气味n遗传毒理学用小鼠；致癌用大鼠n致畸用大鼠、小鼠、兔n迟发神经毒性常用母鸡制备样品制剂时的要点n加热样品时不应接近改变样品化学性质或物理性质的温度n如样品为固体评价其对皮肤的毒性时，应保持其形状和颗粒大小n多成分的样品应按配方配制n如可能，制剂pH应为5-9n不应用酸或碱使样品解离n如应用非胃肠道途径，终溶液尽可能接近等渗染毒途径n静脉注射、吸入、肌内注射、腹腔注射、皮下注射、口服、皮内注射、经皮经口染毒特点n喂饲：动物自行摄入，一般最高含量5%，营养成分可更高，不适宜于口感差，易挥发水解的样品，实际染毒量计算需单笼饲养。n灌胃：操作前禁食空腹，大鼠隔夜，小鼠4个小时，均不停饮水，灌胃后

15、2-4小时提供饲料，经口多次染毒一般不禁食。n吞咽胶囊：适用于易挥发水解和有异味的样品。操作要点n喂饲：动物自行摄入，一般5%, 一些有营养价值的事物成分可更高，但应注意不要造成营养成分失衡而影响动物的生长发育。不适于口感性差的样品；易挥发或水解的样品；若要计算实际染毒量需单笼饲养。n灌喂：灌喂前应禁食空腹，大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小时，均不停饮水，灌喂2-3小时后提供饲料。若经口多次染毒经呼吸道染毒n静式吸入染毒：染毒时间一般为两小时，要求样品在10分钟内挥发完毕。n动式吸入染毒：每天的染毒时间为6小时，保证氧气的浓度为19%。n气管内注入：建立急性中毒模型。注射染毒n皮下注射：注射时以左

16、手拇指和食指提起皮肤将注射器刺入皮下，注射部位一般为大腿外侧 小腹部、背部或耳根部。n皮内注射：需局部脱去背毛，消毒后用左手拇指和食指按住皮肤并使之绷紧在两指之间紧贴皮肤表层刺入皮内。n肌内注射：选肌肉发达无大血管通过的部位一般为臀部，注射时垂直迅速刺入肌肉。n腹腔注射：注射时左手抓住动物，腹部向上右手于左下腹部刺入皮下。n静脉注射：一般采用尾静脉还有耳部，犬可采用头静脉。染毒途径与染毒量经口20ml/kg（对空腹动物）；经皮2ml/kg；静脉1ml/kg；肌内注射0.5ml/kg（每一部位）；每眼0.01ml/kg；吸入2mg/L;鼻孔0.1ml生物标本采集n血液采集n尿液采集n胆汁采集n粪

17、便采集血液采集n终末取血：以动物死亡为实验结束n非终末取血：麻醉或清醒的实验动物身上单次或多次采血。n血液总量取决于物种、性别、年龄、健康及营养状况，一般总循环血量为55-77ml/kg体重。n单次取血量低于动物总血量的15%，取血量在1520%血压降低30%，3040%引起缺血性休克，40%时引起50%实验动物死亡。单次采血不超过动物总血量的15%，可在34周后重复采血。多次采血每24h不应超过总血量的1%，取血量不超过0.1ml时，可通过尾尖取血，也可以通过眼眶取血。不赞成在无麻醉条件下取血。尿液粪便采集n可用代谢笼下部有粪尿分离器，取粪便分析时n剔去表层，取内层分析。麻醉n麻醉分为四个时

18、期：痛觉丧失期、兴奋期、耐受期、窒息期。n痛觉丧失期：从药效开始发挥到意识丧失n兴奋期：从意识丧失开始出现到规则呼吸结束，呼吸不规则，瞳孔扩大，运动反射增强，眼球震颤n耐受期：从规则呼吸开始到自主呼吸结束，分为四段（1）规则呼吸，瞳孔缩小（2）骨骼肌松弛，瞳孔缩小，呼吸平稳，痛觉缺失，是进行手术的最佳时期（3）只有角膜反射，呼吸困难，瞳孔扩大（4）呼吸平稳，瞳孔扩大n窒息期：没有反射没有呼吸，濒临死亡，需立即用解毒剂防止死亡n意识丧失，痛觉丧失，肌肉松弛是手术的最佳时期，将麻药分为长效（长于120min）、中效（120min） 、短效（30min）。n麻醉时和麻醉后必须检查动物的体温，体温降低

19、时需使用加热灯、加热垫n麻醉终止后动物要经历和麻醉过程相同但顺序相反的几个时期。常用的麻醉药物n短效：对啮齿类多用乙醚，大动物用硫喷妥钠1025mg/kg静脉或腹腔注射n中效：推荐用赛拉嗪+氯胺酮肌内注射n长效：常用戊巴比妥钠静脉或腹腔注射安死术n具有保证动物中枢神经系统立即达到失去痛觉的早期抑制作用，应是无痛苦、不引起兴奋，能快速导致一时丧失和死亡。推荐的安乐死方法n小鼠：断头、脱颈伴放血、80%的二氧化碳、适宜挥发性麻醉剂、戊巴比妥钠伴放血。n大鼠：撞击，脱颈、断头、 80%的二氧化碳、适宜挥发性麻醉剂、戊巴比妥钠伴放血。n兔子：猛击，并用脑定位打击、撞击伴放血、戊巴比妥钠伴放血1.1.对

20、照原则对照原则在动物实验中，要求相比较的各组间动物的种类、性别、年龄、体重等尽可能地一致。对照组与实验组同等重要，两组的动物数应相等。 (1)空白对照：又称正常对照(2)标准对照：又称有效对照或阳性对照(3)组间对照： (4)自身对照：科研设计遵循的三原则科研设计遵循的三原则2.2.重复原则重复原则(1)足够的实验样本数： (2)实验结果的可重复性： 3.3.随机原则随机原则 为了减少个体差异这种非处理因素的干拢，应于实验前将实验动物依统计学原则进行随机分组，以此达到尽可能降低非处理因素的混杂效应，从而提高每组动物间均衡性的目的。 随机分组方法：随机数字表法；计算机软件（如SPSS、SAS、E

21、xcel等）三、毒理学动物实验设计内容三、毒理学动物实验设计内容1. 1. 实验动物选择：实验动物选择：2. 2. 实验动物分组与剂量选择、实验期限：实验动物分组与剂量选择、实验期限：LogDoseBiological Response低剂量组：低剂量组：NOAEL中剂量组：中剂量组：LOAEL高剂量组高剂量组3. 3. 实验观察指标选择：实验观察指标选择：实验指标（观测指标）是指在实验观察中用于反映研究对象中某些可被检测仪器或研究者感知的特征或现象标志。 n特异性 n客观性 n灵敏度 n精确度 n可行性 n认可性 实验指标选择的基本条件 实验指标选择依据n根据实验的目的、任务和内容选择指标。

22、n根据化学物的种类和用途来选择国家标准、部委和各级政府发布的法规、规定和行业规范中相应的程序中的实验方法要求来选择指标。4. 统计学处理方法统计学处理方法数据类别和统计学要求数据类别和统计学要求统计学方法统计学方法1“有或无有或无”数据：数据：动物间的比较动物间的比较个别组的比较个别组的比较Fisher精确分布检验精确分布检验(不分层的数据不分层的数据)22校正的卡方检验校正的卡方检验(分层或不分层的数据分层或不分层的数据)非均匀性非均匀性 2K卡方检验卡方检验(分层或不分层的数据分层或不分层的数据)与剂量相关的趋势与剂量相关的趋势 Armitage检验检验(分层或不分层的数据分层或不分层的数

23、据)动物内部比较动物内部比较个别组的比较个别组的比较McWemar检验或符号检验检验或符号检验非均匀性非均匀性Cochran检验检验变量问的相关性变量问的相关性Fisher精确分布检验精确分布检验2X2校正的卡方检验校正的卡方检验2分级数据：分级数据：动物间的比较动物间的比较个别组的比较个别组的比较Mann Whitney u检验检验非均匀性非均匀性KruskalWallis单向方差检验单向方差检验与剂量相关的趋势与剂量相关的趋势非参数趋势检验非参数趋势检验动物内部的比较动物内部的比较个别组的比较个别组的比较Wilcoxon配对符号秩和检验配对符号秩和检验非均匀性非均匀性Friedman双向方差分析双向方差分析与剂量相关的趋势与剂量相关的趋势Page检验检验变量间的相关性变量间的相关性Spearman等级相关系数等级相关系数3连续数据：连续