三质粒与载体

1、第三章 质粒与载体11. 质粒概述质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。21.1 质粒的分子结构通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；疏螺旋体、链霉菌和酵母菌31.2 质粒的检测 提取所有胞内DNA后电镜观察； 超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；通常用碱裂解法提取质粒41.3 质粒的命名第1个字母(小写)： p， 质粒（plasmid）;第2，3 个字母（大写）：人名，实验室名，表型性状或其他特征的英文缩写;编号（阿拉伯数字） ：区别同一类型的不同质粒例： pUC18, pU

2、C1951.4 质粒的主要类型质粒与宿主的关系：质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。6质粒的主要类型（ P202）质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应致育因子(Fertility factor，F因子)抗性因子(Resistance factor，R因子)产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）毒性质粒(virulence plasmid)代谢质粒(Metabolic plasmid)隐秘质粒(cryptic plasmid)71.5 质粒的一般特性 非必要遗传物质一般控制次

3、要性状，能自我复制并稳定遗传。质粒的存在一般也有助于生物在特殊环境下的生长； 在细胞内的大小和数量不相同一般大质粒（分子量60M道尔顿）拷贝数少，小质粒（分子量15M道尔顿）拷贝数较多。氯霉素等可抑制染色体DNA复制而使质粒拷贝数扩增；8 互不相容性属于同一组并具有共同阻遏物的质粒不能在同一细胞并存； 具有可转移性及稳定性以较高频率（10-6），通过细胞间的接合作用或其它机制从供体转移至受体，在细胞分裂前复制，均等分配至子细胞中； 可整合性在一定条件下，质粒可以整合到染色体DNA上，并可重新脱落下来9 可重组性不同质粒或质粒与染色体上的基因可以在细胞内或细胞外进行交换并形成新的重组质粒； 可消

4、除性经高温、吖啶橙或丝裂霉素C等可以消除质粒，宿主细胞同时也失去质粒所携带的表型性状； 耐碱性与染色体DNA相比，质粒有较高的耐碱性，调pH至12.4 ，可使染色体DNA变性，通过离心将其与质粒分离102. 质粒的复制和调节2.1 质粒的大小常见质粒大小的范围为1200kb，个别大质粒可达8001000 kb质粒的大小常用分子量MD或碱基对数kb来表示。1MD的双链DNA1.65kb。未知质粒的大小通常可以在相同条件下与已知其大小的几个标准质粒比较并依其电泳距离作图来估算。最精确的测定需要对质粒DNA作序列分析，然后从所含碱基数目来直接推算出其大小和分子量。112.2 质粒的拷贝数质粒的数量亦

5、称为质粒在每一细胞中存在的拷贝数(copy number)不同质粒在细胞中的拷贝数各异。一般而言，质粒的拷贝数与其分子量成反比关系，分子量大的拷贝数低，分子量小的拷贝数高。如F因子这一类质粒，每个细胞中只有12个拷贝的质粒，它们的复制受到严格控制，称为严紧型质粒(stringent plasmids)或低拷贝质粒。分子量小的(如ColE1质粒)拷贝数高，每个细胞中有10100个拷贝的质粒，说明它们的复制不受到严格控制，称为松弛型质粒(relaxed plasmids)或高拷贝质粒。基因工程中为获得大量的基因产物所用的载体质粒便是这类松弛型质粒。122.3 质粒复制的模型复制子(replicon

6、)是一个复制单位，细菌染色体是一个复制子，每一个质粒也是一个复制子。复制起点是复制子起始复制的部位，作为一个复制子,至少需要有一个复制起点,即ori位点。大肠杆菌染色体的复制起点称为oriC，质粒的复制起点叫做oriV。质粒的复制主要是通过型复制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以型复制为主。在型复制中，有单向复制和双向复制两种类型，如R1、R100等的复制是单向的，而F和R6k是双向复制类型。13 质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质。而复制所需要的其它蛋白，如DNA聚合酶、连接酶、引物酶、连接酶、RNA-H酶、解旋酶(gyrase)和拓扑异构酶I、dnaB 和dnaC基因产物(沿链延

7、伸的DNA合成酶)等都是利用寄主的复制酶体系。复制起点(ori)区的功能 ori位点周围的小范围DNA是质粒复制所必需的在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于它们的作用位点-ori序列附近将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引入原核细胞后,该重组DNA具有自主复制能力。14pBR322是最早人工构建的质粒载体。通过将下面几部分不同来源的DNA片段连接起来而构成的环状质粒：来源于ColE1的衍生质粒pMB1 的DNA复制起点(ori) 及rop区；来源于质粒pSC101的四环素抗性基因(tetr)；来源于转座子Tn3的氨卞青霉素抗性基因(ampr)。 15 ori区域常决

8、定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。质粒如ColE1类型的质粒，包括pBR322、pET和pUC具有较窄的寄主范围，这些质粒只在E. coli 及一些亲缘关系较近的如沙门氏菌(Salmonella)和克氏杆菌(Klebsiella)中复制。RP4、RK2和RSF1010及从G+细菌中分离的滚环复制的质粒都属于广寄主范围(broad host range)质粒。广寄主范围的质粒一般是编码与复制起始有关的所有蛋白，这样就不依赖于寄主的功能。162.4 质粒复制的调控 质粒的复制机制同染色体基本相同 质粒的复制的调控主要是控制拷贝数 质粒的复制复制调控机制一般采用直接或间接 的负调控

9、机制。 负调控因子可以是蛋白质、RNA或DNA重复序列。抑制物-靶位调控(inhibitor-target regulation)其特点是依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物，通过它与目标RNA的互补结合以阻止质粒复制的起始。17目标RNA是质粒DNA复制的引物或是用于编码复制所需的Rep蛋白的mRNA。属于这一复制调控类型的质粒包括ColE1、pT181、p15A、pMB1、RSF1010、loDF13 、R1等ColE1质粒复制调控 ColE1质粒复制调控 6.6kb的小质粒，拷贝数10-20 复制不需要质粒编码蛋白质，而是依赖于宿主的复制酶体系 从一个固定原点oriV开始，进行单向复制。

10、 18ColE1的复制需要一个RNA引物。RNA是质粒复制的引物前体,PRNA是编码RNA的启动子, RNA转录是在RNA聚合酶作用下，从复制原点上游方向555bp 处起始转录(将RNA与DNA的转换处定为复制原点)。当这个RNA延伸至复制原点oriV时，由RNAase H 将RNA切断，从而产生3-OH末端。然后DNA聚合酶以此为引物合成DNA，复制从起始点oriV开始向右进行。193553oriVL or Light strandH or Heavy strandNew L Strand synthesised firstONLY 580 bps needed for plasmid to

11、 replicate in host cell- 555RNAIIRNAI-445RNA PolymeraseRNAII starts at -555 on H strandColE1的复制20-445- 5553-445Transcription beyond oriVHybridisation at/near oriV- 55533RNAaseH cleaves at oriV2/3 bp accuracy-445ONLY 580 bps needed and ONLY 13 after oriV21质粒编码的两个负调控因子Rop蛋白质和反义RNA (RNA) ，控制了DNA复制过程中所必

12、需的引物的合成。在ColE1复制原点上游方向445 bp处(相当于RNA的第111个碱基的位置)处起始转录另一个RNA分子，其转录方向与RNA相反，它是由双链DNA链上的另一条链(C-链)为模板进行转录的，这个RNA分子称为RNA I，属于反义RNA。22上节课的总结1. 原核生物基因组的特点2. 质粒及载体1）.质粒的概念及种类2）.质粒复制模型3）.质粒复制的调控抑制物-靶位调控23这个反义RNA I 有111个碱基与RNA的5末端互补，这样,RNA I与RNA互补形成双链RNA结构,使之不能为RNAase H所识别(人们通常认为RNAase H只识别DNA-RNA杂合双链，而不识别双链R

13、NA结构)。RNA的转录继续进行，不能在分子原点区域产生有活性的引物而对复制起负调控作用。因此，RNA I控制着质粒的拷贝数。这个机理解释了ColE质粒的拷贝数调控,由于RNA I是由质粒编码合成的,当质粒的浓度高时,就会产生较多的RNA I分子,而高浓度的RNA I就会来又干扰RNA的加工,从而抑制复制。24一般当一个细胞中ColE的拷贝数达到16时,就会几乎完全抑制质粒的复制。调控蛋白,rop基因位于 ColE1复制原点下游方向不远处。Rop蛋白增强了RNA1和RNA2的相互作用，从而加强了RNA I的抑制作用。反义RNA对质粒复制的抑制作用，控制着质粒的拷贝数，反义基因发生突变将会增进引

14、物的形成和质粒的复制，即增加其拷贝数。野生型ColE1的拷贝数约是20个 / 每个细胞，当反义基因发生缺陷时，其拷贝数超过250，25+600 +400 -500 Rop/Rom Dimer5353RNAase cut3oriVSummary of ColE1 replication controlRNA IRNA II26R1质粒复制调控R1质粒约90kb，拷贝数为每个细胞1-2个。RepA蛋白是质粒复制起始必需的因子。由repA基因编码，有两个转录启动子，PcopB和PrepA。从PcopB转录产生CopB和RepA两个产物。从PrepA 转录仅产生RepA。CopB为PrepA的阻遏蛋白

15、。 R1质粒复制区还有copA 基因，转录产物为反义RNA，能与repA基因产物RNA互补，形成双链RNA，被RNaseIII降解，RepA无法合成，抑制质粒复制。 复制区有tap基因，其产物Tap蛋白为转录活化蛋白，能促进RepA的合成。27copB copA tap repA oriV 5335RepressorRNA I antisenseRNA IIShine-Delgarno repARepA initiatesreplicationTap28重复子-竞争结合调控(iteron-binding regulation)最常见于质粒如：F、P1、R6k 、RK2、RP4和pSC101等，

16、是通过蛋白质即RepA蛋白进行复制调控。这些质粒在复制的起始位点(ori)和复制基因(rep)附近存在着多个长度为17-22 bp的DNA短片段(叫做重复子, iteron)，它们能与复制必需的Rep蛋白竞争性结合，从而抑制了质粒的复制和拷贝数的增加。29由于含有重复子序列，这些质粒也叫重复子质粒(Iteron plasmids)，通常在ori区有3-7个重复子。除此之外,通常在不远处还有这些重复序列。pSC101是最简单的重复子质粒。pSC101质粒复制调控repA基因编码的RepA蛋白是复制起始所必需的，在ori区有3个重复子序列，R1、R2和R3，RepA就是通过与它们的结合而控制质粒的

17、拷贝数。RepA蛋白是pSC101和许多其它重复子质粒复制所需的唯一由质粒编码的蛋白质。寄主染色体编码的其它蛋白如DnaA, DnaB, DnaC 和DnaG与ori区结合后，质粒的复制才起始。30第二种调控机理是由于重复子序列间的相互作用使两个质粒偶联在一起,从而抑制了质粒复制的起始,这种调控方式被叫做偶联模型(coupling or handcuffing model）。重复子质粒的复制是通过两种机制进行调控的第一,RepA蛋白通过与自身的启动子区的结合而抑制自身的合成,这种调控方式被叫做转录自体调控(transcriptional autoregulation)。质粒的浓度越高,合成的R

18、epA蛋白就约多,相应地就越多的抑制自身的合成。因此, RepA蛋白的浓度总是维持在一定的范围内,复制的起始受到严格的调控31323.质粒的稳定性 (细胞分裂中的质粒分配)在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配, 是导致质粒不稳定性的重要原因。要使质粒能够保持稳定的遗传,至少需要满足下面两个方面的条件:第一是每个世代每个质粒平均都必须至少发生一次复制；第二是当细胞分裂时,复制产生的质粒拷贝必须平均分配到两个子细胞中去。质粒分配到子细胞的途径可分成随机分配(random distribution)和主动分配(active distribution)两种不同方式。33主动分配的机理对低拷贝质粒而言

19、，则需要某种特定机制，将细胞分裂与质粒复制协调起来，以保证每个细胞至少获得一个拷贝。如：FR1和P1。这些质粒的稳定性：(1)质粒结构中还存在编码主动分配体系的par区 。(2)质粒编码的致死蛋白来抑制不含质粒的分离子Par区,又叫做分配区(partition regions)或分配座位(partition locus) 是指在细胞分裂过程中使质粒拷贝数均等的分配到子细胞中的质粒DNA序列。在F质粒中par区是同复制起点紧密相邻的，而在R1质粒中则是远离其复制起点。质粒的复制与分配是分开独立进行的。34在F质粒中，par区由sopA和sopB两个基因及sopC区组成,这三个因素是质粒分配的基本

20、因素,其中sopA和 sopB 叫做反式作用基因(trans-acting genes)编码反式作用蛋白,sopC叫做顺式作用位点(cis-acting site)。顺式作用位点sopC由12个43 bp的正向重复序列组成,在每个43 bp的正向重复序列中,又有一对7 bp的反向重复序列。SopC区的功能类似于真核染色体上的着丝粒,所以 sopC区也叫类着丝粒位点(centrmere-like site)。反式作用蛋白SopB与顺式作用位点sopC区结合,形成蛋白-核酸复合体,称为分配复合体(partition complex),参与质粒的分配。35质粒DNA在位于细胞中央的复制体(repli

21、some)的作用下进行复制。质粒复制后,分配蛋白与类着丝粒位点结合形成分配复合体。 然后,一种尚未知的结构很快地将质粒拷贝移向细胞的两极,使复制后的质粒DNA均等的分配到两个子细胞中。接着可能是在分配蛋白的作用下,使分配后的质粒限定于细胞的特定区域。36寄主致死体系F质粒基因组中控制寄主致死功能的基因ccdA 和ccdB,属于同一个自我调节的操纵子,分别编码分子量为8.3 kDa 和11.7 kDa的两种蛋白。在含质粒的细胞中,CcdA蛋白作为解毒剂专门与毒剂CcdB蛋白结合,并使之失效。在没有CcdA蛋白的情况下,CcdB蛋白通过抑制DNA解旋酶的活性,或是通过引发解旋酶诱导寄主染色体DNA

22、发生双链断裂从而使染色体在细胞分裂过程中无法进行正确的分配。在新产生的无质粒的子细胞中,开始的时候是含有CcdA和CcdB这两种蛋白。但由于无ccd操纵子可发生进一步的转录,因此随后这两种蛋白质的浓度便逐渐下降稀释。37毒剂CcdB和解毒剂CcdA具有不同的稳定性,是导致分裂后细胞致死的关键因素。也就是说,CcdA蛋白质不稳定,易被蛋白水解酶 (protease)降解,于是较稳定的 CcdB蛋白质便可行使其对寄主细胞的致死作用。随机分配机制ColE1等多数高拷贝质粒一般没有专门的par基因，它们可以依赖于高拷贝质粒的随机分配来实现分裂过程中的稳定性。384.质粒之间的不相容性不相容性通常是指亲

23、缘关系相近的两种质粒，在非选择性条件下常常不能稳定地存在于同一个细胞中，经过若干代的培养，只含有同一种质粒的细胞越来越多，而含有两种质粒的细胞相对减少。两个质粒如果不能同时稳定地共存于一种细菌细胞中，则这两个质粒属于同一不相容群，即Inc groups；如果能够稳定地存在于同一种细胞内，则它们属于不同的不相容群。RP4和RK2为IncP质粒，不能稳定地共存于大肠杆菌细胞中，而RSF1010属于IncQ，因此能与RK2共存大肠杆菌细胞中39 质粒的不相容性与质粒复制起始密切相关不同的不相容群的两质粒40相同的不相容群的两质粒41 质粒的不相容性与质粒分配也有关系42435. 质粒的转移性根据质粒

24、的转移性，质粒可分为转移性和非转移性两类转移性质粒是指质粒能自动的从一个细胞转移到另一个细胞,甚至还能带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移,这类质粒常常被叫做自主转移质粒(self-transmissible plasmid)。如：F质粒。有些质粒虽然不能自主转移,但能被其它一些自主转移质粒所转移,这类质粒又被叫做可移动质粒(mobilizable plasmids)。如ColE1质粒44自主转移质粒的特点大肠杆菌的F质粒、R1、R100、ColV、ColIb-P9、R6k、RP4 ，天蓝色链霉菌的致育质粒SCP1和SCP2，粪链球菌的致育质粒 pAD1和豌豆根瘤菌的共生质粒 pJB5JI

25、等均属于自主转移质粒。G细菌中的转移质粒多是低拷贝的大质粒，其中较小的R6k质粒也有38 kb。 G 细菌如链霉菌，除SCP1是巨大质粒外，很多转移质粒都是10 kb左右的小质粒，而且真正参与质粒转移的区域只有2 kb。F质粒为代表的G-细菌的自主转移性质粒特点F质粒的转移操纵子（tra）含23个基因，大小为33kb。45tra基因产物与性菌毛形成和杂交对形成有关；有些编码作用于oriT位点的核酸内切酶；有些基因产物调控质粒转移。oriT 位点：质粒转移的起点，质粒必须有oriT位点才能自主转移。可移动质粒的特点可移动质粒的转移必须利用同一细胞中自主转移质粒编码合成的性菌毛才能进行。可移动质粒

26、的转移需要两种元件：bom位点和mob基因。bom位点 ：类似于F质粒的oriT序列mob基因 ：功能类似于tra基因，负责质粒转移。46mob基因象许多tra基因一样，mob基因也编码特异的核酸内切酶，在oriT位点进行切割，还编码其它一些与DNA转移有关的蛋白质可移动质粒的转移不需要自主转移质粒的共转移47广寄主范围质粒的特点所谓广寄主范围质粒是指质粒能通过接合转作用转移到很多不同种甚至不同属的寄主内，并能稳定地存在于这些寄主细胞内。IncP、IncN、IncQ、IncW组的质粒寄主范围广泛，属于广寄主范围质粒(broad host range plasmid)。F质粒为窄寄主范围质粒。

27、IncP组的质粒常见的有RK2、RP1和RP4等 IncP组的质粒的寄主较广, IncP质粒自身或带动其它质粒能从大肠杆菌转移到几乎所有的G- 细菌中。 IncP质粒还能接合转移到G+ 细菌、酵母、植物中。48IncP质粒虽然能通过接合作用转移到酵母、植物等这些寄主中,但质粒却不能在这些寄主中复制,属于转移寄主。49这类质粒的大小为60kb,在大肠杆菌中的拷贝数为47个，oriV是质粒的营养复制区,这类质粒也具有与接合转移有关的tra 基因和oriT位点，含有氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性及四环素抗性。另外,质粒上还携带有转座子Tn1和插入序列IS21。6. 克隆载体载体：人工构建的负责将外源基

28、因运送到宿主细胞中并进行复制与扩增的运载工具构建载体的基本要求： 为一个独立的复制子，含有复制位点，能够自主复制50 含有多个克隆位点，便于外源基因的插入 含有选择性标记，便于对阳性克隆筛选和鉴定 具有生物安全性6.1 质粒载体分子克隆中绝大多数的克隆载体是由质粒经人工修饰改造而成质粒作为克隆载体的特点：1）具有独立的复制起点2）具有较小的相对分子量，利于体外分子操作3）具有较高拷贝数4）具有便于选择的标记5）易于导入细胞51克隆质粒：快速连接外源目的片段表达质粒：高效表达外源基因测序质粒：又称T-载体自杀质粒：携带外源片段进入细胞后即消解温敏质粒：对某种温度敏感穿梭质粒：在真核细胞与原核细胞

29、间转移载体根据研究目的分为：52克隆质粒pBR32253测序质粒成品为线性，双链DNA3端有突出的T碱基，与由Taq酶PCR扩增产物直接连接。在插入位点两侧，有多个酶切位点，便于后续操作。在插入位点两侧，有M13载体通用引物，可直接测序。54多克隆位点：NcoI，多克隆位点表达质粒55核糖体结合位点T7噬菌体的启动子引物1组氨酸标签引物2NcoI位点：CCATGGNdeI位点：CATATG此系列载体主要用于外源蛋白在大肠杆菌的高效表达，同时表达的蛋白可用Ni-NTA Agarose进行亲和层析分离纯化目的蛋白该载体使用的宿主菌为Bl21(DE3)，其染色体上克隆有T7噬菌体的RNA聚合酶，且受

30、IPTG诱导。56该载体同样设计有核糖体结合位点，使用阿拉伯糖操纵子中的启动子，且受阻遏蛋白AraC的调控，在有阿拉伯糖存在时克隆的基因表达。57自杀质粒1) 使用pBR322的复制子，保证质粒的正常复制2) 携带质粒RK2的转移位点，可以发生接合转移3) 携带经改造的Tn5，使得接合转移后发生转座子随机突变4) Tn5中有荧光基因，可以使突变菌株产荧光5) Tn5中携带质粒(p15V）的复制子，可发生质粒拯救，快速克隆Tn5插入的DNA片段58温敏质粒复制子为OriR101复制蛋白RepA为温敏突变携带由AraC调控的噬菌体重组酶系统由于大肠杆菌的基因敲除59广寄主范围质粒载体研究大肠杆菌以

31、外的细菌，通常需要广寄主范围的质粒载体。这样便于在大肠杆菌中进行基因操作，然后在转移进目的菌株中，进而研究目的菌相关基因的功能。广寄主范围质粒载体构建的理论依据是自主转移质粒能自主转移，并能带动可移动质粒转移。一般把RP4或RK2质粒中DNA转移位点即oriT DNA序列称为mob-site。常用的大肠杆菌质粒载体如pBR322、pBR325或pACYC184，既不能自主转移也不能被高效诱动。如果这些质粒上带有RP4或RK2的mob-site，则能被RP4质粒诱动转移到不含质粒的大、肠杆菌或其他细菌中。60pK18mobsacB复制子pMB1，oriV质粒RP4的mob-site枯草芽孢杆菌的sacB:提供负筛选标记，即革兰氏阴性细菌如果携带此基因，在5%蔗糖培养基上不