分子生物学实验技术ppt课件

1、分子生物学实验.目 录实验一、植物染色体DNA的提取及纯度鉴定实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取实验三、琼脂糖凝胶电泳实验四、的限制性酶切实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备及外源DNA的转化实验六、PCR基因扩增技术.实验一、植物染色体DNA的提取 及纯度鉴定.一、实验目的掌握真核植物基因组染色体DNA的一种提取方法学习运用紫外分光光度法鉴定DNA的纯度，估计相对含量。.二、实验原理用低温机械研磨和高浓度、SDS等破坏细胞壁及膜，使蛋白变性使DNA与蛋白分别，用一定浓度的溶液将DNA提取出来，用高浓度乙醇沉淀DNA，氯仿/异戊醇等去除杂质，RN ase降解核酸，得到纯度较高的DNA样品。根据核酸与

2、蛋白质分别在OD260和OD280有吸收峰分别测定之，比较OD260/OD280比值在1.8附近程度估计纯度，根据阅历公式计算DNA含量。.三、实验资料与试剂物品1.资料香椿Toona sinensis黄花苗.2、试剂提取缓冲液预冷SSCRNase液.3、仪器设备高速冷冻离心机8-316制冰机8-312紫外可见分光计8-316冰箱-86度在8-312，-20度，4度在8-312水浴锅电子天平玻璃仪器等.四、实验操作流程采摘芽苗，洗净剪小段，擦干外表水分放-86度冰箱冻30分钟以上冰浴研磨匀浆分次加提取液以下见讲义.五、结果与处置纯度含量.思索题：影响本实验结果的要素有哪些，要得到高纯度的DNA

3、需求在实验中留意哪些问题？.实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取.目的与要求 经过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学惯用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。.2. 相关知识及原理质粒(Plasmid) ：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。.DNA超螺旋构造.常用的质粒载体是经过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19(500700.细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制本身基因组DNA

4、的同一组酶系。 .严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严厉控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只需一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，假设用一定的药物处置抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处置才干到达更高拷贝数。质粒类型：.载体(Vector)：用于携带重组DNA，并且可以使外源DNA一同复制与表达的质粒(运载工具)。具备的条件：易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；易于挑选；易于导入受体细胞。.InsertEcoRIXhoI1.9kb.抗性

5、基因Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)启始复制子ori, Origin of replication)；多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)；标志基因(Marker gene, such as LacZ gene)。载体的构造：.Ampr抗性基因Ampr抗性基因编码一种周质酶-内酰胺酶可特异地切割Amp的-内酰胺环，从而使其失去杀菌才干.二、实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染

6、色质在拓扑学上的差别来分别它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎一切纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作缘由提取的质粒可有三种构造：线形、开环、闭环超螺旋。 .DNA 是具有一定构造的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。.SDS是一种阴离子外表活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白量变性，所以SDS处置细菌细胞后

7、，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性NaOH环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子宏大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA那么与细胞碎片一同沉淀到离心管的底部。经过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。.细菌裂解的方法： 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,普通用于质粒大量提取。.提纯的思绪质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白基因组DNA脂类及小分

8、子杂质RNA .测定DNA浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于粗略检测DNA浓度的方法是经过凝胶电泳，与规范分子量相比较。DNA浓度的测定：.紫外光吸收法：由于组成核酸的碱基(G,A,T,C在260nm处具有强吸收峰，所以经过测定260nm的吸收峰即可对DNA进展定量。但有时也会由于所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，普通在中性pH值左右的环境中进展测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。.3. 资料与试剂资料:含有质粒大肠杆菌JM83+。.三、实验仪器、资料与试剂 一仪器：

9、恒温培育箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅二资料：含有质粒的大肠杆菌JM83+、LB液体培育基三试剂： 溶液I作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液II作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白量变性。溶液III作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白SDS线性DNA沉淀，K可中和DNA.溶液1GET缓冲液： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。溶液20.2mol/L NaOH, 1%SDS溶液3乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2OTE缓冲液或水+ 20g/

10、ml RNase : 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70乙醇.平衡酚：氯仿：异戊醇25：24：1作用：氯仿可使蛋白量变性并有助于液相与有机相的分别。平衡酚pH7.8酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大，可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA.四、实验步骤接含质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培育基中370C，190rpm振荡培育过夜取1.5菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、离心2min，弃

11、上清，搜集菌体100uL溶液I悬浮菌体充分振荡，室温或冰浴10min参与200uL溶液II悄然混匀，冰上静置5min裂解菌体.参与150uL溶液III悄然混匀，冰上静置15min质粒DNA复性12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇振荡混匀12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管可省略上清加等体积的氯仿：异戊醇振荡混匀12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加2倍体积的无水乙醇充分混匀，冰浴 30min.12000rpm，离心15min沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次振荡混匀、离心12000rpm，离心10min沉

12、淀超净台中风干沉淀用20uL RTE溶解，-200C保管.留意： 用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在参与溶液II 和III后，一定不要猛烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！.培育细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培育基，37培育1216小时;取液体培育液1.5-2ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，参与100l溶液1(GET) ，充分混匀放置3-5分钟;参与200l新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS变性液，加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;质粒小量提取的方法手工提取：.参与

13、150 l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min;用冷冻高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml 100乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液;沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次， 12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然枯燥;参与30-50l含有20g/ml RNase的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需求酚:氯仿抽提);将分别出的质粒DNA置于-20保管备用。.B. 用分光光度计法定量DNA取2l提取的质粒DNA，

14、参与98l蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释);蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调理紫外分光光度计读数至零。.参与DNA稀释液，测定260nm 及280nm的吸收值。260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50g /ml双链DNA，33g /ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值OD260/OD280估计核酸的纯度。普通DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值阐明有蛋白质或其它杂质的污染。.记录OD值，经过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下: dsDNA=50(OD260) 稀释倍数以上浓度单位为g /ml.实验三、琼脂糖

15、凝胶电泳.一、实验目的经过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。.二、实验原理 DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。核酸为两性分子，在PH3.5时，整个分子带正电； PH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 在碱性环境下，一样碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向挪动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进展分别。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。可以分别相对分子质量一样，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNAcccDNA直线DNALDNA，2条链发生断裂开环的双链

16、环状DNAocDNA，1条链发生断裂。 .三、仪器、资料与试剂 一 仪器二资料1.自已提取的质粒DNA2.相对分子质量规范品三试剂 15 TBE储液(PH8.0)运用时稀释 10倍成0.5TBE 1TBE也可。 2凝胶加样缓冲液0.2%溴酚蓝，50%蔗糖 3. 琼脂糖 4.10mg/ml溴化乙锭溶液EB，4保管。用时稀释成5ug/ml的EB。 .四、实验操作步骤 琼脂糖凝胶的制备配制浓度按照所提质粒的大小来确定.凝胶板的制备 加样加样体积在1030ul电泳 染色结果察看 .C. 凝胶电泳检测DNA的浓度0.8%的琼脂糖凝胶，100V,40分钟。NEB 规范分子量片段(1kb DNA Ladde

17、r).1 kb DNA Ladder虽然不能对DNA质量进展准确定量分析，但可以经过与相近的条带进展比较估算出大约的数据。每条带大约的量如下按0.5g上样量计。应按13条带计算，由于3kb的量是其它片段量的近三倍： 片段碱基对质量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*0.5kb 的条带由500bp和517bp组成，这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一。 .相关知识电泳：泳动速度决

18、议于？ 琼脂糖凝胶天然琼脂Agar是一种多聚糖，主要由琼脂糖Agarose ，约占80及琼脂胶Agaropectin组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗景象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分别效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进展平板电泳。 .核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系琼脂糖浓度 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0线状DNA大小/kb 5-601-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3.核酸构型与琼脂

19、糖凝胶电泳分别的关系 不同构型DNA的挪动速度次序为：共价闭环超螺旋DNAcccDNA直线DNALDNA，2条链发生断裂开环的双链环状DNAocDNA，1条链发生断裂。 .影响迁移率的要素DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压 普通5V/cm、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。.常用染料EB:溴化乙锭 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐EthidiumBromide，EB，EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传送给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色

20、。EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中可胶中。EB是诱变剂，运用时一定要戴手套。 EB废液要经过处置才干丢弃。SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，参与样 品中，价钱较昂贵。.五、实验结果与讨论根据察看结果，绘图。分析自提质粒的情况。 .实验四、的限制性酶切 .一实验目的及背景核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等动物的免疫系统， 用于抗击外来的侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的片段端为，端为。.限制酶的类型根

21、据限制酶的识别切割特性， 催化条件及能否具有修饰酶活性可分为、型三大类。类和类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。 类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进展随机切割，很难构成稳定的特异性切割末端。类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故类和类酶在基因工程中根本不用。.型酶型酶就是通常指的限制性内切酶. 它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进展切割，产生特异的片段； 型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反响的辅助因子，识别顺序普通为个碱基对的反转反复顺序； 型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出；端突出

22、和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和运用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进展改造，从而极大地推进了分子生物学的兴隆和开展。.酶切反响中应留意以下几个问题：内切酶：不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 留意内切酶的识别位点及构成的粘性末端；内切酶的用量 根据内切酶单位和用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解ug特定底物所需求的限制性内切酶量，运用中普通以ug DNA对u酶短时间为宜。同时内切酶体积不能超越反响体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超越会抑制内切酶活力；运用时防止操作中对内切酶的污染。.：作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、

23、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些要素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制可经过：添加酶作用单位数1020U/ug DNA、增大反响体积以稀释能够的抑制剂或延伸反响时间加以抑制。.反响缓冲液：反响缓冲液主要由TrisHCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；TrisHCl维持反响体系pH值在7.2-7.6之间；NaCl浓度不同构成种级别的离子强度：低盐10mM NaCl)中盐50mM NaCl高盐100mM NaCl 不同的内切酶选择特定的反响缓冲液。.酶解温度与时间：大多数限制酶反响温度为，如EcoR, Hind, BamH, Pst等，也有如B

24、cl需在下进展反响，反响时间根据酶的单位与用量之比来定，原那么是酶：=：小时即可，充分酶解。.二、实验试剂限制性内切酶和质粒buffer:50mM Tris HCl pH7.5100mM NaCl10mM MgCl2无菌水.三实验方法按下表分别参与各试剂留意限制性内切酶最后参与且在冰上操作于Eppendorf管中。DNA 10buffer 2l无菌水 20l内切酶 2总体积： 25l. 将反响体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。Eppendorf管封上封口膜于水管中反响1小时。反响终了后参与4l的10XLoading buffer以终止反响。混匀后0.8琼脂糖凝胶上60伏电泳小时。紫外透射

25、仪上检查实验结果。.四结果与分析记录紫外透射仪上察看到的结果。分析实验结果的成因。问题与讨论：在整个酶切反响过程中应留意哪些问题？如何选择和限制性内切酶的用量？反响体系中为何内切酶用量不能超越整个反响体系的？.实验五、 大肠杆菌感受态细胞的制备 及外源DNA的转化.实验目的1.了解转化的概念及其在分子生物学研讨中的意义。2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并挑选转化体的方法。 .实验原理转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研讨

26、的根本实验技术。 .转化中的受体细胞 转化过程所用的受体细胞普通是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。 .转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法感受态细胞处置后，细胞膜的通透性发生变化，成为能允许外源 DNA 分子经过时细胞的形状。转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。 实验原理.实验原理本实验以 E.coli JM83- 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处置受体菌使其处于为感受态，然后与 质粒共保温，实现转化。 因质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因此使接受了该质粒的受体菌具有抗氨

27、苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过顺应稀释，在含氨苄青霉素的平板培育基上培育，只需转化体才干存活，而未受转化的受体细胞那么因无抵抗氨苄青霉素的才干而死亡。 .抗Amp宿主细菌含Amp培育基.影响转化率的要素 细胞生长形状和密度。 转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。 .实验仪器 .实验试剂 大肠杆菌JM83- LB培育基， 0.1mol/LCaCl2溶液预冷 氨苄青霉素 JM83+质粒 .实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备 外源DNA的转化.实验步骤 菌株活化1用接种环直接取冻存的大肠杆菌JM83-，在LB培育基平

28、板外表划线，于37培育16小时2挑取一个单菌落，转到35mlLB培育基中，于37培育35小时3将培育液全部转到100mlLB培育基中培育23小时，到OD6000.30.4.实验步骤 感受态细胞制备4将培育液转入1.5ml离心管中，在冰上放置1530min54000rpm离心5min,弃上清6参与0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min74000rpm离心5 min,弃上清8参与0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可运用。也可参与总体积15的甘油 在70长期保管.实验步骤 转化9、取目的DNA参与大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min1

29、0、于42水浴90S11、冰上放置2min12、参与800lLB液体培育基于37培育1小时13、将培育液均匀涂布在含Amp+的培育基平板上14、将平板放置于37恒温培育箱中培育12-14个小时，然后察看结果.对照组 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水替代DNA溶液,其它操作与上面一样。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水替代DNA溶液,但涂板时只取5l 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。.转化率统计每个培育皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公

30、式如下： 转化子总数菌落数稀释倍数转化反响原液总体积涂板菌液体积 转化频率转化子数每mg质粒DNA转化子总数质粒DNA参与量(mg) 感受态细胞总数对照组菌落数稀释倍数菌液总体积涂板菌液体积 感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数 .实验结果.实验报告写明实验目的、实验原理、仪器、资料与试剂详细列出实验步骤；画出实验结果的表示图并做分析，计算转化效率。.实验六 PCR基因扩增技术.实验目的经过本实验学习PCR反响的根本原理与实验技术。.实验原理聚合酶链式反响(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火