一种能够用于降低有机磷杀虫剂残留的红色荧光标记的安全基因工程菌(共12页)

1、 一种能够用于降低有机磷杀虫剂残留的红色荧光(ynggung)标记的安全基因工程菌摘要(zhiyo)：为了有效地生物降解有机磷杀虫剂在自然界中的残留，我们构建了一种基因(jyn)工程菌，它不仅能释放出红色荧光，还能降解有机磷农药的残留物，并且这种基因工程菌当被需要的时候也可以自杀。两种带有不同功能的基因被置于不同启动子的控制之下。一种基因是双基因表达载体pL-DsRed-pL-OPH，在这种基因中，编码DsRed和有机磷水解酶的基因被独立地定位于两个pL启动子下游。只要基因工程菌是活的，这些基因能够自由地表达。另外一个基因是条件型自杀质粒pDS，包含当他们探测到有果胶糖的时候，两个自杀盒被设计

2、用来自杀。被用于自杀质粒的致死基因是灵感菌不带前导编码序列的核酸酶基因。这被置于T7启动子的控制下。在降低农药和污染方面，应用这种安全型的基因工程菌是一种潜在地带有更少危险性的环境策略。关键词：安全模型；基因工程微生物；自动荧光标记蛋白；监测；有机磷污染物；杀虫剂降解简介 有机磷复合物（OPs）是一种(y zhn)广泛的毒害神经的化学物质，能够被用作杀虫剂或者战争手段。有机磷复合物的广泛应用造成了多种环境污染并越发引起人们对于杀虫剂残留的关心。能够降解有机磷复合物的基因工程菌的发展与应用将会成为降低有机磷复合物残留的有效方法。有机磷化合物水解酶（OPH）是一种发现于土壤微生物假单胞菌属小型菌M

3、G和黄质菌属spp的有机磷三酯的水解酶类（Munnecke 1980）。OPH能够水解很多OPs，包括的底物有P-S键，并且是用于基因工程微生物降解有机磷农药残留的最普通的酶类。 尽管有很多基因工程微生物，包括那些有能力降解有机磷农药并已经被构建(u jin)的微生物，但是他们的利用，通常被面临释放它们到环境中的相关风险所限制，这些风险包括：来自基因工程微生物的基因从它们自身转移到其他生物体，并且相反地也面临本地微生物的潜在影响。为了降低这些风险，被设计释放进入环境的基因工程微生物必须能够被有效的监视，它们的分布必须被多种生物抑制系统所限制。 最近，生物技术，如基因探针、PCR、单克隆抗体、自

4、发荧光蛋白（AFPs）等已经被应用于监测基因工程微生物。通过这些，AFPs是唯一不需要条件底物、辅因子或蛋白质的技术。GFP，被发现于太平洋西北部的水母体内， DsRed，是一种发现于Discosoma sp珊瑚礁的红色荧光蛋白，在1999年被广泛应用于自发荧光蛋白（AFPs）。尽管很多含有绿色荧光蛋白的基因工程菌已经被构建起来(q li)，相对来说，很少有被构建起来去表达DsRedDsRed在某些方面更优于GFP-GFP对于光漂白有更大的抵抗力，对于pH范围为5-12的吸收和荧光有着极微小的pH独立性-DsRed有一个(y )具有重要意义的红移荧光普段，它可以减少和细胞光分散及自发荧光相关的

5、问题。这篇文章描述的是构建一种GEB，他能够发出红色荧光，降解有机磷复合物，同时能通过带有两种不同基因和启动子的质粒的相互转化来进行有效的生物限制。一种是携带DsRed和OPH的基因，它们被分开定位于两个lambdaPL启动子下游。其他的基因是亲和的条件型自杀质粒pDS，它包含灵感菌两个致死基因的复制子而没有前导编码序列。材料(cilio)和方法质粒的构建(u jin)已经添加两个附加终止密码子的基因DsRed，通过PCR从pDsRed-N1扩增，并且在质粒pBV220的限制性酶切位点EcoRI和BamHI处克隆。合成的质粒被称作pBVDsRed.编码蛋白质OPH的基因opd，从乔博士获得的p

6、GEM-T Easy-opd基因的得到扩增。PCR扩增的opd基因然后插入(ch r)到质粒pBV220的限制酶切位点BamHI和PstI位点，以获得质粒pBV-OPH。设计引物来扩增整个pBV-DsRed和pBV-OPH的基因序列，除去在质粒pBV220转录调控中编码阻遏蛋白的基因cIts857.扩增的片段然后自我环化来构建质粒pL-DsRed和pL-OPH。然后整个pL-DsRed片段再一次扩增，同时和来自带有启动子序列、opd基因和rrnBT1T2启动子的基因pL-OPH的扩增片段连接在一起。最后组合的质粒被定名为pL-DsRed-pL-OPH。 基因工程(jyn gngchng)菌的构

7、建质粒pL-DsRed-pL-OPH和条件型致死质粒pDS相继被导入E.coli核酸链BL21-AITM中，它使用的是氯化钙法产生的基因工程菌。这种菌能够释放红色荧光，降解有机磷复合物，同时当被诱导的时候能够自杀(zsh)。pDS是一种条件型质粒，它包含两个自杀基因盒。他们被设计成当监测到果胶糖的时候，它们就会诱导菌体自杀。应用于自杀基因的是S.marcescens的核基因，它不包含前导编码序列。它处于T7启动子的控制之下。BL21AI-ROSs红色荧光和降解有机磷复合物的能力不需要诱导，但是细胞自杀的限制系统必须通过添加果胶糖到培养基中才能够被激活。荧光密度和基因工程(jyn gngchng

8、)菌生长曲线的监测 经过整个晚上的培养之后，菌体被转移至液态LB培养基，其中加有适当的抗生素、氨苄青霉素和卡那霉素，并培育在30C的摇床中。当光密度值达到生长中期阶段（0.5-0.8）的时候，菌体被分离成两部分。一半被添加的0.01%的果胶糖所诱导，同时另一半不加任何物质。两部分菌体继续培养在30C条件下。样本每2小时收集一次，时长14小时，之后在30C条件下不用摇床培养同时每天取样，时长9天。分别(fnbi)地，利用贝克曼（Beckman）DU-800分光光度计和日立F-450荧光分光光度计测量所有样本的OD600值和荧光度。 第一个14小时内收集的样品被用于如下平板实验：样品被非选择性的B

9、L培养基稀释，直到OD600值达到0.2 ，然后稀释1：200用同样的培养基培养。最后的150l的稀释液平铺在不同的选择性培养基上。在30C条件下培养16-24小时并在日光下用leitzDMIRB显微镜每天监测荧光且持续(chx)5天后，记录平板上克隆体的数量。总细胞蛋白(dnbi)的准备工作将通过每分钟10000转（？）的离心过滤的细胞置于50mM的tris-HCl（pH=7.8）条件下洗涤后，再悬浮于同样的缓冲液中（200l），然后如下条件的超声波加工中进行超声波降解标本大约2分钟：能量(nngling)水平2-3，幅度频率40Hz。所有细胞蛋白质的最终混合物作为被实验分析的蛋白质的原样本

10、。在标态下，用牛血清蛋白利用Bradford方法测定蛋白质浓度。有机磷复合物水解酶活力(hul)实验十微克的总细胞蛋白再悬浮与50mM包含50mM硝苯对硫磷酯3l的tris-HCl缓冲液中。通过测定在400nm处p-硝基苯OD值的信息来测定水解的比例。反应在30C条件下持续1.5小时(xiosh)后，用Beckman DU-800的分光光度计测量测量400nm处的光吸收值的改变。结果(ji gu)和讨论在这项研究中，允许基因DsRed和OPH同时表达的双基因表达载体被构建，并且应用于GEB BL21-PLROS中。通常，基因工程菌中目的基因的表达需要一种诱导物，它置于目的蛋白表达的额外成本，所

11、以降低了基因工程菌的成本效用。然而，通过克隆目启动子lambda PL下游序列，从质粒pBV220上删除阻遏物基因lambda cIts857的复制子，并选择一种合适的宿主。，我们构建了一种组成型蛋白表达单元单位。幸运的是，宿主的代谢并没有因为额外增加的两个表达单位而过于严重超载。这种双基因表达载体的模型拓展了生物工程菌构建载体所用质粒的应用前景。 为了降低(jingd)基因工程菌释放的无意识和有意识的潜在风险，由于有一个不同的复制子条件型自杀质粒随着质粒pL-DsRed-pL-OPH同时被转化到相同细胞。为了提高这种自杀型质粒的有效性，自杀基因盒在其中复制。 图二展示的是GEBs BL21A

12、I-PLROS、BL21AI-DS、BL21AI-RO、BL21AI-R、BL21AI-O和BL21AI的生长曲线和荧光强度，在指数(zhsh)生长期，它们分别地，与同时含有基因pL-DsRed-pL-OPH和pDS一起、pDS、pL-DsRed-pL-OPH、pL-DsRed、pL-OPH或者没有质粒的菌体生长相一致。这表明，由于当质粒pL-DsRed-pL-OPH和pDS共同转化进入宿主后造成的宿主菌的代谢负荷，宿主菌的生长速率降低。然而，这种不利条件并非是致死的，并且没有牵连到基因BL21AI-PLROS的功能。加入果胶糖之后，BL21AI-PLROS型菌的生长速率变得比最终完全控制控制

13、停止的更加缓慢。为了核实自杀机制的效率，在第一个14小时收集的样本均分置于不同的选择性培养平板上。没有被诱导的BL21AI-PLROS细胞的培养平板被多于20000的克隆体所覆盖。被诱导的BL21AI-PLROS细胞在含有卡那霉素、卡那霉素和氨苄青霉素的培养平板上没有发现克隆体，但是在含有氨苄青霉素的培养平板上发现155（38）数量的克隆体。平板实验的结果显示，双自杀系统是非常高效的；然而，明显的是质粒的丢失是一个问题。用果胶糖诱导之后，一些克隆体仍存活于含有氨苄青霉素的培养条件下，而没有存活于含卡那霉素的培养条件的。卡那霉素抗性是pDS自杀质粒的一个特征，因此在含有卡那霉素的培养平板上出现B

14、L21AI-PLROS的克隆体说明，在培养期间，有一些BL21AI-PLROS基因工程菌丢失了这种基因。为了避免自杀质粒的丢失，更好的办法是把缩短的核基因的双自杀系统置于染色体中，或者一种新的质粒稳定系统。通过偶联细胞生存和死亡基因的表达来构建的控制E.coli数量浓度(nngd)的细胞间联系的方法，自由抗体质粒的选择和保存可能是克服这些缺点的好办法。 第一个14小时的样本显示，在荧光强度在40-150的范围内几乎没有变化（图2B），这种变化可以归因于光密度的改变。14小时以后，所有的样品被置于30C无摇床的条件下长达9天，以允许红色荧光蛋白成熟，达到OD600值并测量每天的荧光度。在这9天期

15、间，样品的光密度几乎没有改变，除了那些被诱导的显著衰退的样本（图2C）。同时，样本的荧光戏剧性地改变了（图2D）。所有含有带DsRed基因的样本的荧光度在9天时间内都在增加(zngji)。几乎在9天后BL21AI-R型和BL21AI-RO型的两次对比中，BL21AI-ROS型的荧光度最强。在9天的时间内，缺乏基因DsRed的BL21AITM型的荧光度表现地没有增加。2天之后，当用荧光显微镜检测细菌克隆体的时候，强烈的红色荧光从BL21AI-PLROS型、BL21AI-R型和BL21AI-RO型克隆体中被检测到（图2.a）。5天之后，这些克隆体发出的明显的红色荧光可以在白天用裸眼看到(图2,c)

16、。无论用荧光显微镜还是用裸眼观测，在BL21AITM型克隆体中没有红色荧光被检测到。 在能够利用荧光显微镜观测到BL21AI-ROS型、BL21AI-R型和BL21AI-RO型发出的红色荧光之前，大概要经过两天的时间，而要直接在白天用裸视看到荧光，则要经过大约5天的时间。尽管这是一段相当长的时间，但是一旦发出荧光，GEB就可以相对容易地被监测的特点比他的缺点更有价值。例如，BL21AI-ROS的个别克隆体可以在不含特殊(tsh)光源的琼脂培养平板上被鉴别出来，这是一个可以简化微生物克隆体的特点。 采用添加果胶糖的BL21AI-ROS型克隆体的生长比那些没有被诱导的克隆体的生长要缓慢，这是一个(

17、y )反映在荧光强度曲线上的趋势。推而广之，这个结果证实荧光可以被用来监测GEMs这一有价值的研究。 GEM的OPH的酶活力通过计算硝苯对硫磷酯分裂频率而被测定。硝苯对硫磷酯可被OPH水解成p-硝基酚，反应的产物p-硝基酚，在pH为7.8、400nm处表现出强的吸收带。这种在400nm处的光密度吸收值和产生的p-硝基酚和硝苯对硫磷酯水解的摩尔数是成比例的。正如图4所显示的，BL21AI-ROS型、BL21AI-RO型和BL21AI-O型的所有细胞蛋白，所有的都有催化活力，并且至少在第一个8天以内，会随着细胞置于30C条件下而增加(zngji)。在这些菌体中，BL21AI-ROS有最强的退化能力

18、；BL21AI-RO第二。在整个观测过程期间，对照组的400nmOD值几乎没有改变。 BL21AI-RO型的荧光度和OPH酶活力比那些携带pL-DsRed-pL-OPH，单独携带pL-DsRed或pL-OPH质粒的更强。这可能是由于基因拷贝数的不同所导致(dozh)的。这些结果显示，至少起作用的BL21AI-ROS型要比只含有pL-DsRed-pL-OPH的细胞效果更好。 和先前的研究相比，这项研究中的BL21AI-ROS有独特的荧光特征。DsRed和pL-OPH通过使用双基因表达载体在BL21AIROS中独立地表达而不是融合蛋白表达。和GFP相比，DsRed对于极端pH环境和光致褪色有着更优越的抵抗能力，这些特征可以使红色荧光在田地里更易传导以追踪和监测GEMs。包含有机磷复合物水解酶（OPH）特征的BL21AI-ROS型的特点(tdin)，红色荧光和主动的生物保持系统（ABC）不仅增加了它在生物治理领域应用的安全性，而且显示出了跟在先前研究的同样的不足，这些研究是自杀功能的范围诱导和抗体阻遏标记基因，此外还有自杀质粒的丢失。 结论(jiln) 总的来说，我们的结果说明了，构建一种包含两个自由表达单位的质粒是可能的，这两个表达单位被两个独立的PL启动子和一个被设计的GEM用来表达特殊的蛋