不可忽视的转膜和封闭WesternBlot专题(经验篇)(共26页)

1、不可忽视的转膜和封闭(fngb):WesternBlot专题(经验篇) 生物通技术专题：既可以定性(dng xng)，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。Western印迹要想做的好，当然每个步骤都不能马虎，看看这张图，从电泳，转膜，封闭，一抗，二抗到最后的检测，就像“发现号”升空的120万个步骤那样(nyng)一个也不能少。如果忽视了其中的一步，结果做不出来，也是令人非常头痛的。 “工欲善其事，必先利其器”，要想有好的实验结果，好仪器是相当重要的，因此让我们先来看看什么样的仪器能让我们无后顾之忧，顺利痛快的一步到位。 Western 印迹的仪器主要就是电泳系统

2、和电转移系统了，最好的品牌当然是Bio-Rad和Amersham（GE Healthcare）的Hoefer系列了，现在国内出品的物美价廉的电泳系列产品，也是不错的选择，几乎每个实验室都需要至少一套Mini Cell吧？如果还没有你该怎么挑选呢。一、Bio-Rad经典Mini系列 Bio-Rad Laboratories由 David Schwartz 先生和妻子化学家Alice Schwartz于1957 年创建，总部位于加州 Hercules，下设三大部门生命科学部，临床诊断部和工业材料部，其中生命科学部成功跻身世界排名前五名。在2004年，Bio-Rad还低价收购了因侵犯知识产权限于困境

3、的MJ Research，使得伯乐在PCR领域的市场份额骤然扩大。Bio-Rad生命科学部产品包括蛋白组研究产品、层析仪与填料、蛋白质和核酸电泳产品等，不过最为普通实验室熟悉的莫过于蛋白电泳Mini系列和层析仪。只要是提到SDS，Bio-Rad绝对是每个实验室首先考虑的品牌，经典就是经典呀。 Mini-PROTEAN3电泳系统与Mini Trans-Blot转移系统这一套Mini系列可谓是Bio-Rad最多人熟悉和称道的产品了。自上个世纪50年代Raymond利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛性质来延缓蛋白质的迁移率从而达到分离蛋白的目的以来，经过这么多年来的发展， SDS电泳技术已经基本成熟了。而且

4、在操作手段方面也越来越简便，越来越准确。Mini Protein Cell的出现使得Western的制胶和电泳的消耗成本更经济、操作更简便快速这种简便也间接促进了Western技术的更广泛采用。而Mini-PROTEAN 3 自被生产出来那天就可以说是“踩在巨人的肩膀上”，因为它吸取了Bio-Rad之前第一代和PROTEAN 2微型垂直电泳仪的优点，并在其基础上进行了优化，所以获得了全球实验人员广泛的认同与喜爱。 Mini-PROTEAN 3的优点可以概括为8个字用途广泛，操作简便。由于Mini-PROTEAN 3可以用于SDS变性电泳、非变性电泳、Tric-Tricine电泳、等电聚焦和酶谱

5、分析，以及dsDNA、ssDNA和RNA的电泳分离，因此可以说只要实验室有一套Mini-PROTEAN 3，足以应付常规垂直电泳需要了。Mini-PROTEAN 3体现了Bio-Red不断改进的努力方向设计人性化，令操作更简便这在各个细节都可以体现，比如说为了防止制胶过程出错，Mini在玻璃板，夹合器（固定玻璃板的装置）以及电泳槽里等处分别都有注明正反位、夹板高度或正负极；方便的夹子取代了以前需要拧4个螺丝来固定玻璃板的麻烦。由于未交联的聚丙烯酰胺本身是神经毒素，因此每个实验者都希望操作能简单快速，尽可能减少讨厌的意外“事故(shg)”漏胶的发生。Mini-PROTEAN 3巧妙的设计使得配胶

6、快速方便的同时更大大减少漏胶的几率。除此之外，Mini的加样容量也是可以多样选择的，包括10-well (30 l)，15-well (15 l)，10-well (50 l)，12-well (20 l)，9-well (30 l)，IPG comb (7 cm IPG strip)。 电泳结束后就要转膜。同系列的Mini Trans-Blot可以说是Mini-PROTEAN 3的“完美拍档”，它们组合在一起就是做Western印迹实验的最好选择之一了。说它好，当然是有原因的，由于Mini Trans-Blot在转移过程当中的三个关键步骤里设计巧妙，帮助转移顺利进行，提高了转膜效率，因此才会

7、得到如此多的用户的赞赏。第一就是在夹板盒，由于转膜过程中的气泡问题对于实验结果有很大的影响试想一下，在特异带显色处正好有一个气泡，那么本来可以很漂亮的结果就付之一炬了，甚至可能会造成假阴性结果。Mini Trans-Blot的夹板盒通过两块海绵与封口式设计帮助减少气泡的存在，同时夹板盒多孔的设计也可以在压制过程中使缓冲液均匀的渗出，减少气泡。其次，转膜槽的人性设计。试问一下，在转膜中最怕什么，我想大部分人都会说是正负极弄错，Mini Trans-Blot为了防止这种造成整个实验完全失败的情况出现，在转膜槽的正负极上明确的用大范围的红与黑这两种颜色标志出来了，这样出错的可能性就大大降低了。第三，

8、就是Mini Trans-Blot的冷却装置。Mini Trans-Blot有一个冷却盒，听起来好像很复杂，其实就是一个塑料盒子，但是这个盒子在转膜过程中却可以起重要作用，众所周知，转膜过程中发热不仅会造成气泡的形成，而且很有可能会影响蛋白的正常转移，因此大多数转移是在冰上进行的，但由于空气(kngq)的隔热现象往往效果不是很明显，利用Mini Trans-Blot，实验人员可以在冷却盒中装入缓冲液将其冰冻起来，转膜时就可以起到冷却的作用。除了以上这些，Mini Trans-Blot还有一次可以转两块膜，低电压过夜转膜以及令人放心的外观设计等方面的优点。Mini-PROTEAN 3加上Mini

9、 Trans-Blot一套价格不便宜，要1000多美元呢。现在那个(n ge)超薄硬质玻璃板也可以单买了，以前可是十套打包的。 Bio-Rad除了这个(zh ge)“镇店之宝”外，还有适合于13.3 x 8.7 cm gels的Criterion系列(xli)（Mini系列是8.6 x 6.8 cm），这一系列无论是电泳系统还是转移系统都和Mini相似，但是(dnsh)它可以容纳更多块胶，为蛋白质组分析提供便利。而且有线电极和板电极两种方式供选择。除此之外，还有更大尺寸的the Trans-Blot Cell(16 x20cm，26.5 x28cm)适合特别的需要的实验来选择。二、电泳世家Ho

10、efer 也许国内的研究人员不那么熟悉Hoefer，但是这个1967就成立的公司在电泳产品领域可谓赫赫有名。多年来一直专注于核酸和蛋白电泳分离技术，使得其产品质量和设计一直处于领先地位，在国外真正属于“顶级”口碑的电泳产品。被GE收购了的Amersham则是大家非常熟悉的品牌（包括独步天下的原法码西亚的蛋白纯化王国），而多年为Amersham代工生产单向电泳产品的正是Hoefer。2003年Hoefer成为著名的哈佛生命科学全资子公司，GE（Amersham）目前继续销售Hoefer的各种产品，而且8月期间还有 HYPERLINK /custom/ge/web/1.htm t _blank 6

11、到7折的特别优惠，很值得看看（点击这里）。老实说GE的这一单向电泳系列一直算是良心价，和美国Hoefer的价格差不多，如果算上这么大的折扣优惠，在美国也买不到这个价格呢！ GE（通用电气公司）有一个很有名的创始人托马斯爱迪生，自1896年爱迪生电灯公司和休斯顿电气公司合并成立GE公司以来，GE秉承着“梦想启动未来”的理念逐渐成为了一家多元化的科技、媒体和金融服务公司。2004年4月，GE宣布成功收购Amersham公司所有股票，自此GE Healthcare在生命科学领域的发展生机勃勃，充满朝气，继续拓展Amersham在基因组，蛋白质组，分离纯化，检测试剂等领域打下的王朝。 在蛋白电泳与印迹

12、系统方面，Amersham做得标准全面，有各种的可以放置不同凝胶数目、凝胶面积和厚度的电泳槽可供选择，通常可以分成三类：微型、中型和大型，另外电转印迹系统也有多种选择，比如说如果你想做半干转移，那么就可以选择Hoefer TE70或Hoefer TE77，如果是要做全湿转移，那么Hoefer TE22或TE62是可以考虑的购买对象。所以如果你刚开始接触蛋白电泳和Western印迹，那么可以考虑一下GE公司（Amersham）的产品，因为这些产品不仅购买放心，而且在产品服务方面也相当不错，能够找到众多有用的资料。别具一格Hofer MiniVE Amersham在电泳仪器方面挑选范围广，而在蛋白

13、垂直电泳系统中一定要提及的就是Hofer MiniVE了，这一设计完整、使用方便的新一代电泳仪器融合了蛋白电泳与Blot两方面装置配备，设计独特，而且在前一段时间GE公司大减价活动中，全套MiniVE只要560美元，只用花一套仪器的钱就可以用作两种用途，这么著名的品牌，真是难得物美价廉啊（如果连同电泳电源还可以再打折哦，晕.）。 说它是好货，那么到底MiniVE是好在哪儿呢？其实在众多电泳仪器倍出的江湖，MiniVE有三招让其独步武林，第一招就是操作简便，节省时间。由于有时蛋白电泳使用频率很高，所以实验人员当然会希望操作简单啦。MiniVE配胶过程就三步：load clampcast，只需把玻

14、璃板放上去，夹紧，然后灌胶就完事了。漏胶？那是极少发生的事。细微之处见真功，MiniVE的设计有一些过人之处。比如Spacer有T边，大大减少侧边漏胶的几率；而将玻璃装到模块上的时候，两边底部的玻璃/Spacer/玻璃处都有Guide Foot，顶一下“三件套”的上面就可以保证足部完全对齐防止底部漏胶。装玻璃的时候如果传统的“插进模块”就容易导致Spacer和玻璃之间“走位”，MiniVE的模块两个侧边和底部都可以打开，将装好的玻璃平放，合上夹边再拧螺丝就行；底部的封边也很特别，有3档，一个是密封档，可以密封底边后直接倒胶；一个是半开的电泳档，允许电泳液均匀连通胶底部，另一个当然就是完全打开以

15、便装卸玻璃了。所以MiniVE并没有单独的倒胶架子，将底部封条推到密封位置后就可以将模块“挂”在电泳主槽的边上倒胶了，不用担心胶面不平哦。Amersham产品做工精良，值得信赖的。第二招，高品质大容量。MiniVE与一般蛋白电泳相比，有个很大优势，就是其蛋白胶可薄至0.5mm，而且凝胶大小是1010.5cm(WH)，比一般的108cm要长了30%，这样的好处就是增加了蛋白分辨率，使一些“难舍难分”的蛋白组分“分道扬镳”，达到更好的分离效果。 HYPERLINK /feedback/newsforms/buyform.aspx?subid=2&companyname=Promega&compan

16、yid=146&proname=ViaFect%2526%238482%3b%d7%aa%c8%be%ca%d4%bc%c1&extraEmail= t blank ViaFect转染试剂(shj)第三招，Western印迹，MiniVE采用的转移槽是“盒式”的，润湿的转移膜和滤纸(lzh)、海绵组成“三明治”结构夹在“盒式”的转移模块中，闭合后每个转移模块只用350毫升的缓冲液，放入主槽中；而电泳主槽里只放预冷的去离子水作为降温，就可以直接转膜了。这种转移方法不用整个电泳主槽装满电泳转移缓冲液，可以节约不少缓冲液（1.21.7升）呢，而且可以减少不均匀的发热。Amersham除了这种微型的电

17、泳系统，还有Hofer其它系列，比如SE250垂直电泳仪，这种电泳系统配有热交换模块，可以消除smile现象（一种由于热量交换不及时而引起的蛋白带波动现象，生物通注）。再比如凝胶大小为1816cm的SE600 Ruby，以及为了蛋白质组学研究的需要开发的Ettan DALT six和Ettan DALT twelve，这两种电泳系统分别可以进行6块和12块凝胶的电泳，这可以说是“库斯拉级”的电泳系统啊！三、国产品牌 国产电泳仪，国内的老牌六一是大家非常熟悉的产品，价格的绝对优势令其历时数十年而屹立不倒。电泳仪这玩意本来技术含量不比芯片扫描仪什么的，只要设计合理(hl)好用，电极丝笔直耐用分离效

18、果好，塑料槽晶莹剔透美观易清洗，价格合理就好。国内品牌现在材料都没话说，高透明度聚碳酸脂注塑成型，铸造模具非常精密。关键就是设计，好不好用，分离效果好不好。最近新冒头的后起之秀，北京百晶生物技术有限公司的产品就值得关注-越是新出品的电泳槽，在设计上就越值得期待，无他，只因具体设计上可以参考其他著名品牌优缺点，扬长避短，结合更多使用人多年的心得和期望进行改进-站在巨人的肩膀上自然有高度。 这个百晶其实是美国海湾基因集团公司在中国设置的以出口为主兼顾国内市场的外向型生产加工基地，专业研发和组装生产“Baygene”品牌电泳及配套仪器，将美国工程师的人性化设计理念和国外制造的高精度模具组合起来，核心

19、进口器件及不同程度的国产化率集成的国产货。包括高、中、低压电泳仪电源；垂直、水平电泳仪；可整支高温消毒的移液器；超薄型磁力搅拌器；手掌式、台式离心机；高精度恒温循环器；常温、低温干式恒温器；显微镜数码图像系统等。其中最为值得称道的就是Baygene BG-verMINI 迷你垂直电泳仪。因为设计更人性化，操作更简便。1首先，跑蛋白电泳最重要是必须效果好。 BG-verMINI 迷你垂直电泳仪（标配）凝胶尺寸是8297mm(WH)，分离长度比一般迷你型凝胶8273cm长25%。由此增加了蛋白分辨率，分离了粘连的蛋白组分。同时又可以兼作8273cm迷你型凝胶，达到省时省液、快速方便的效果。兼顾到了

20、多种使用习惯。2：其次，只是效果好就可以吗？在当今越来越讲究效率的今天光是效果好还不够，还得必须操作简单不漏胶。那么让我们来看看 BG-verMINI 迷你垂直电泳仪如何实现简单方便的。它具有独特的灌胶装置，可同时灌1-2块胶。制胶过程只需三步：把带固定垫条的玻璃固定在主槽上，再将主槽放在独特的灌胶装置上，即可完全放心的灌胶。任何人都能在1分钟内操作完成，没有任何漏胶的可能。凝胶制成后卸掉灌胶装置，凝胶板无需二次移动（不用拆下玻璃板），将主槽整个放入壳体中即可电泳。最大限度避免了玻璃板移动过程的失误以及凝胶渗漏等等。在国内外相关产品都需二次移动的情况下，此特点更加彰显突出和有效。3液体搅拌：槽

21、体底部留有1cm空间，便于电泳或转印时放置磁力棒进行搅拌，以使温度和离子强度均匀，实现电泳或转印的最好效果。若不用此功能时，可放置减液板（电泳配件）填充其空间，以减少缓冲液量。4充分接触：电极的正极结构为V字形设计，两侧有气泡出孔，电泳时不会有气泡在电极周围存留，保证了电极与缓冲液的充分接触，达到了散热的良好效果。5缓冲液量自由放置：槽体宽大，充分达到了足量缓冲液带来的极佳散热效果。既避免了用户自制“冰盆”冷却的尴尬， 又避免了凝胶谱带的“笑脸”现象。需要节省缓冲液时，减液板又可以发挥作用啦。上下槽合计最低缓冲液量为400ml。6多板制胶：需要提前制成大量凝胶板冷藏保存的用户，我们也准备了多板

22、制胶器供选择，每次可制4块凝胶。7转印电泳：配套的聚碳酸脂模具成型BG-blotMINI迷你转移槽，内置冷却装置冰盒，其快速吸收了转印过程的热量，克服了无冰盒转印的发热现象。具有限位功能的转移槽，配以颜色明显的转印夹和电极，确保了转印过程的正确定向。生物通Western Blot技术(jsh)专辑之PAGE胶电泳(din yn)和转膜 PAGE倒胶的仪器我们(w men)在前面 HYPERLINK /newsf/2005-8/2005825181619.htm t _blank WesternBlot仪器之选已经介绍过了，除了顺手的工具能防止漏胶，PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当

23、然有决定性的影响，这个配胶的比例，在分子克隆上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，小气病发作的后果往往是得不偿失胶凝不好多半是这里疏忽（或者混合不匀），因为相对配胶的其他组分，AP算最活跃分子如果还有诸如漏加某组分或者配比错误或者Buffer搞错，那绝对是你自己找骂，不值得同情。水要用去离子的纯水，MilliQ级更好。Cambrex(原来的FMC)有商品化的丙烯酰胺母液，很贵，也很好配出的胶对200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE胶，条带

24、清晰漂亮，可惜一直没有搞清楚配方的奥秘；但是数十倍于丙烯酰胺粉剂的价格令人却步，不过，对接触丙烯酰胺粉尘严重过敏的人可以选择这个。更加豪华的选择是已经凝好的预制胶，各种配方各种比例各种梳孔大小多少任君选择，打开即用，当然更直接方便，更吸引人的是结果漂亮，分辨率高，特别是重复性好，条带真正是razor sharp啊！平时都能用这么豪华的东西心情当然超爽啊，实验紧凑又轻松，效率也更高啊！如果实验都能这么“好马配好鞍”，想必更容易出结果，也就更容易拿经费吧！什么时候我们的实验才能实现这种良性循环啊！Invitrogen旗下的Norvex和Cambrex（原来的FMC）PAGEr都是首选预制胶。可是在

25、“社会主义初级阶段”这种奢侈品平时流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了新的优惠活动， HYPERLINK /custom/Invitrogen/10/index.html t _blank 买3盒NuPAGE预制胶就送电泳仪或者电转移，面对这种诱惑，你难道就没有一点非份之想的冲动？上样电泳(din yn)：上样前蛋白样品(yngpn)最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer（别小气，重复使用会降低缓冲能力的），好像基本不会出问题了。当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经

26、到达最佳分辨区分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。电泳结果(ji gu)检查：如果要做Western Blot，是否需要先检查电泳结果呢？能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng蛋白。可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot实验，很多人会选择省略掉这一步同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一般也可以说明问题。如果想在转膜前看看电泳结果，你需要用SYPRO Tangerine这种金色荧光蛋白染料灵敏度很高检

27、测4ng-8ng蛋白，接近银染，但使用非常简单，最重要的是由于不用酸碱或者有机溶剂固定，不干扰蛋白活性，特别适合Western转膜前的染色，或者非变性胶的活性蛋白的检测（比如染色后还需要在胶上进行活性检测等等）。可惜SYPRO Tangerine价格挺贵的，500ul（5000 x）要2000元，即使很节约的用只够大概100多次呢。所以最经济实惠的方法是：丽春红S，直接染色转移膜，检测转膜效果，充分脱色后不干扰Western结果。丽春红的检测灵敏度和考马斯亮蓝差不多。转膜：经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤从PAGE胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行Western Blo

28、t的检测和显色，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转移要尽快进行转膜的首要是选膜。在转移膜上显色其实就像是画家在画布上作画一样，不光要有好的画笔和颜料，适合的画布也是相当之重要。Western Blotting亦是如此，没有选择好合适的转移膜是无法做出漂亮的结果的。因此，选择适合的转移膜，要让转移“膜”高一尺，帮衬而不是阻碍到我们的实验。 Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride） ，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白

29、印迹。具体哪种膜适合于哪些实验呢？选择的根据主要有：a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜，就像国画要选择宣纸，油画要挑亚麻布或薄棉扣布一样。首先(shuxin)来比较下这几种膜的特点NC膜尼龙膜PVDF膜灵敏度和分辨率高高高背景低较高低结合能力80110 ug/cm2400 ug/cm2125200 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）材料质地干的NC膜

30、易脆软而结实机械强度高溶剂耐受性无无有操作程序缓冲液润湿,避免气泡缓冲液润湿使用前100%甲醇润湿检测方式常规染色，可用放射性和非放射性检测不能用阴离子染料常规染色，比较于NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫检测。适用范围0.45um一般蛋白0.2um一分子量小于20kD蛋白0.1um一分子量小于7kD蛋白低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖(主要用在核酸检测中)糖蛋白检测和蛋白质测序价格价格较便宜便宜较贵1. 硝酸(xio sun)纤维素膜 硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光（Lumino

31、l类）、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；比如NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间， Schleicher & Schull公司的一个实验表明，转移到NC膜上的几种蛋白4度条件下保存5年依然保持免疫识别特性，依然可以得到清晰可信的Western Blot结果。不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途因为经不起多次“折磨”。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通

32、常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话最好选择0.1um的膜。另外还要注意选择纯的NC膜混有含醋酸纤维（CM）的NC膜结合力会有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果最好）。 硝纤膜最为大家熟悉和认可的品牌就是 Schleicher & Schull；Millipore；PALL，另外罗氏、Invitrogen、GE（Amersham）、Santa Cruz等公司都有提供各式的硝纤膜（估计OEM的可能性比较大

33、，不过有时挺奇怪的，OEM的有时比生产厂家卖的还便宜）。 Schleicher & Schull的名字拗口那大概需要舌头在口腔里经过若干次不同弧度和不同速度的上下往返精确运动再配合适当的吐气才能读得准确优雅，不过作为第一个提供硝纤膜的厂家依然广为人知，其NC膜分为纯NC膜和强化NC膜两种：Protran nitrocellulose membrane和Optitran nitrocellulose membrane。前者Protran一直是 Schleicher & Schull自豪的产品，这种“100% Pure Nitrocellulose Membranes”。一般而言，NC膜越纯，其蛋

34、白结合能力就越高，所以要增加WB的灵敏度和分辨率，提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。如果NC膜搀杂一些醋化纤维素这在前面已经提到，会影响蛋白质结合。而Protran在制作过程中去除了各种杂质，保证了其纯度，从而增加了蛋白结合能力。除了这一点以外，Protran还有低背景、多孔径选择（0.45, 0.2, 0.1um）和保存时间长（实验证明膜上蛋白辨认时间可长达5年！真是“路遥知马力”的典范）等优点。但是Protran由于是纯NC膜，比较脆，机械耐受力欠佳，需要小心操作，如果担心自己“粗手粗脚”，那么就可以考虑一下Optitran或者(huzh)Pall公司的以耐受力著称的BioTrace

35、NT Nitrocellulose Transfer Membrane。 Optitran是在一层超薄聚酯支撑膜的两面均匀铺上100%纯的硝酸纤维素，结果表面看起来和纯硝纤膜完全一样，保持了NC膜各种优点，只是内部多了一层中性支持物，大大增强这种强化NC膜的柔韧度和机械耐受力，不容易卷曲，方便操作，特别是重复标记和洗脱的实验(shyn)。不过有的使用过的人反应不如纯NC膜结合能力强。 NC膜除了一般的Discs、Rolls和Sheets以外，像Invitrogen、Bio-Rad公司还有一种方便顾客使用的“sandwich”三明治形，十分有趣。说它有趣是因为考虑周到，利于高通量操作，但其实也就

36、是将滤纸和NC膜纸套成滤纸NC膜滤纸的层迭形式，预先切割装订好，方便使用。不过，卷膜肯定是最实惠的选择，只不过要自己动手裁剪切记，必须带手套操作。不知道为什么在国外硝纤膜会被当作危险品来运输还要加收运费，所以货期蛮长的，所以还是卷膜好，一卷用n年如果非要给这个n加个期限，那就是至少可以用到等我毕业之后。2. PVDF膜 刚开始做WB的人也许会有这种疑问：为什么实验室的老师（或者(huzh)师兄师姐们）在教我们做WB的时候，如果是用PVDF膜做，总是小心翼翼的剪，节省着用，甚至一些边边角角也舍不得丢掉呢？其实，这不仅是因为PVDF膜比较贵，还由于PVDF膜是做WB的“杀手锏”。 聚偏二氟乙烯（P

37、VDF）膜作为基质的转印膜由Millipore公司在1985年首先推出。与硝酸纤维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更优越的性能(xngnng)（Pluskal,et al.,1986)。市售硝酸纤维素膜的典型结合量是80-100g/cm2,而PVDF膜结合量是100-200g/cm2（而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍！）。在艾滋病毒（HIV）血清学检验中直接比较PVDF和硝酸纤维素膜，PVDF膜具有更好的截留总HIV抗原能力并提高抗体检测糖基化被膜抗原的性能。但是PVDF膜最大的优点不仅于此：更好的机械强度和化学耐受性使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为

38、理想选择；而且单个凝胶的泳道复本可用于多种目的，如考马斯亮蓝染色后切出条带并进行N-末端测序、蛋白消化/肽分离/内部测序和免疫检测（Kurien,et al.,2003)。特别是需要做N端蛋白测序，在相当“严酷”的清洗条件下，当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。所以PVDF也是要做蛋白测序的唯一选择。此外，个人经验，一些强疏水蛋白用PVDF膜效果会更好一些。PVDF膜适用的检测方法也不少，化学发光、常规显色、同位素和标准染色都一样OK，但不适合荧光。PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡，才能用，而且适用过程中万一干了也要同样程

39、序再处理（不过要真出现这种问题也是自己欠扁，谁要你不小心呢，转膜前处理也就罢了，转膜后再这样处理可能会影响后继的抗体识别呢）。PVDF膜同样分0.45um和0.2um的，后者孔径小，对小分子蛋白有较好的拦截吸附，背景可能会比前者稍高。PVDF膜常见(chn jin)的有以下几个品牌公司产品名孔径适用范围参考价格MilliporeImmobilon Transfer Membranes0.45um0.2um$212Bio-RadImmun-Blot PVDF MembraneChemiluminescent, colorimetric western blots,amino-terminal sequence and total amino acid compositionPiercePVDF Membrane0.45um0.2umWestern, Southern, N