几种药剂对玉米弯孢菌的室内毒力测定(共39页)

1、PAGE 河 南 科 技 大 学毕 业 设 计（论 文） 几种(j zhn)药剂对玉米弯孢菌的室内(sh ni)毒力测定姓 名 车志平 院 （系） 林学院 专 业 植物保护(zhwboh) 指导教师 崔林开 2007年 6 月 26 日毕业设计（论文）包含内容(nirng)及装订顺序1. 毕业设计(b y sh j)（论文）任务书2. 中英文摘要(zhiyo)（含关键词）3. 目录4. 前言5. 正文6. 结论7. 参考文献8. 致谢9. 附录10. 外文资料译文 - 4 -毕 业 设 计（ 论 文 ）任 务 书（指导(zhdo)教师填表） 填表时间(shjin)：2007 年01月 10 日

2、学生姓名车志平专业班级植保032指导教师崔林开课题类型论文设计（论文）题目几种药剂对玉米弯孢菌的室内毒力测定主要研究内容1.从田间采到的病叶上分离玉米弯孢病菌，单孢分离纯化，并从形态上进行初步鉴定；2. 几种药剂对玉米弯孢菌分生孢子萌发的影响3. 几种药剂对玉米弯孢菌菌丝生长的影响4. 几种药剂对玉米弯孢菌芽管伸长的影响主要技术指标(或研究目标)1.通过形态鉴定，明确分离所得玉米弯孢菌的种类；2.找到抑制玉米弯孢菌分生孢子萌发较好的药剂；3.找到抑制玉米弯孢菌菌丝生长较好的药剂；4.找到抑制玉米弯孢菌芽管伸长较好的药剂；5.综合几种药剂对玉米弯孢菌分生孢子萌发、菌丝生长和芽管 伸长的影响，找到

3、一种抑制玉米弯孢菌较好的药剂。进度计划2006.01-2007.02 查阅资料，撰写开题报告 2007.03-2007.04 进行玉米弯孢菌的分离与鉴定2007.04-2007.05 进行几种药剂对玉米弯孢菌的室内毒力 测定的研究2007.06 撰写论文，准备毕业答辩主要参考文献1.蒋家珍 , 吴学民 , 赵美琦.13 种杀菌剂对草坪新月弯孢菌的毒力测定及应用分析. 华南农业大学学报，2004，25（4）：20-222.古丽皮艳, 韩青梅, 王兰.不同杀菌剂对玉米弯孢叶斑病菌的毒力测定. 西北农林科技大学学报，2005，33：49-523.方中达.植病研究方法.中国农业出版，1998研究所（教

4、研室）主任(zhrn)签字： 年 月 日目 录摘要(zhiyo)YAbstractY1前言(qin yn)11.1玉米(ym)弯孢病菌在我国及世界的危害状况11.2症状11.3 病原21.3.1病原菌种类21.3.2病原菌的生物学特性21.4影响分生孢子萌发的因素31.5影响病残体产孢的因素31.6病原菌的致病性及生理分化31.7病菌毒素41.8发生规律和影响发病因素41.8.1发生规律41.8.2影响发病因素51.9危害损失及其估计模型51.10玉米对弯孢叶斑病的抗性及抗性机制61.11综合防治71.11.1选育和种植抗病品种71.11.2轮作换茬和清除田问病茬，减少菌源71.11.3加强栽

5、培管理，培育壮苗，增强植株抗病能力71.11.4药剂防治71.11.5搞好病情测报工作82 材料与方法82.1试验材料92.1.1玉米病叶92.1.2供试杀菌剂92.1.3仪器(yq)与用品92.1.4其他(qt)试验用品(yngpn)92.2试验方法102.2.1病原菌的分离102.2.2病原菌的纯化102.2.3 分离病菌的初步鉴定102.2.4杀菌剂对菌丝生长的影响102.2.5杀菌剂对孢子萌发的影响113 结果与分析123.1 玉米弯孢菌的种类鉴定123.2不同杀菌剂对病菌菌丝生长的影响133.3不同杀菌剂对病菌分生孢子萌发的影响154 结论与讨论184.1 试验结论184.2 讨论1

6、8参考文献20致谢22附录23几种药剂对玉米弯孢菌的室内(sh ni)毒力测定摘 要玉米(ym)弯孢叶斑病Currularia lunata (Boed) Wakker是我国近几年玉米上发生(fshng)的重要病害。其危害在一些地区已经超过玉米大小斑病，成为玉米主要病害，对玉米产量的损失相当严重，但目前在药剂防治方面还没有筛选出一套可行的方案。鉴于此，本试验从玉米弯孢菌叶斑病的病叶上分离纯化病菌，并进行初步鉴定，鉴定是新月弯孢菌。然后采用室内生长速率法和分生孢子萌发法测定了6种杀菌剂对玉米弯孢叶斑病菌Currularia lunata (Boed) Wakker的毒力作用，得到6条毒力回归曲线

7、及相应的EC501。结果表明，不同杀菌剂，同种杀菌剂不同系列浓度之间存在差异，且同种杀菌剂对菌丝与分生孢子毒力作用不同。生长速率抑制试验中，退菌特、多菌灵、粉锈宁、百菌清、代森锰锌、甲基硫菌灵的EC50分别为0.080mg/mL，0.055mg/mL，0.172mg/mL，0.137mg/mL，0.595mg/mL，0.548mg/mL；分生孢子萌发试验中，退菌特、多菌灵、粉锈宁、百菌清、代森锰锌、甲基硫菌灵的EC50分别为0.076mg/mL，0.055mg/mL，0.063mg/mL，0.172mg/mL，0.298mg/mL，0.521mg/mL。通过测定6种杀菌剂对玉米弯孢菌的菌丝生长

8、、孢子萌发的抑制作用，初步找到对防治玉米弯孢菌叶斑病较好的药剂，为防治此病提供科学的理论依据。关键词：杀菌剂；玉米弯孢叶斑病菌；EC50；生长速率；孢子萌发法Several PHarmaceutical Right Curvularia Fungus Indoor Virulence TestAbstractThe corn curved spore leaf spot Currularia lunata (Boed) Wakker is the important plant disease which on our country corn occurs in recent years.

9、Its harm already surpassed the corn size spot sickness in some areas, became the corn main plant disease, Is quite serious to the corn output loss, but at present has not filled in the chemical control aspect selects set of feasible plans. Is situated between this, this experiment separates the puri

10、fication germ from on the corn curved spore fungus leaf spot sickness leaf, and carries on the preliminary appraisal, the appraisal is the crecent moon curved spore fungus. Then to uses in the room to grow the speed law and a minute fresh spore sprouts the law has determined 6 kind of disinfectants

11、to the corn curved spore leaf spot fungus Currularia lunata (Boed) Wakker the toxicity function, obtains 6 toxicity regression curve and corresponding EC50. The result indicated that, the different disinfectant, between the homogeneous disinfectant different series density the existence difference,

12、also the homogeneous disinfectant is different to germs silk and the minute fresh spore toxicity function, Growth rate inhibition test,and the withdrawal from UNSCOM, carbendazim, triadimefon, chlorothalonil, mancozeb, Ling-flow strain EC50 were 0 .080mg/mL, 0.055mg/mL，0.172mg/mL, 0.137mg/mL, 0.595m

13、g/mL, 0.548mg / mL; In the experiment of a minute fresh spore sprouts ,and the withdrawal from UNSCOM, carbendazim, triadimefon, chlorothalonil, mancozeb, Ling-flow strain EC50 were 0.076mg/mL, 0.055mg/mL, 0.063mg/mL, 0.172mg/mL, 0.298mg/mL, 0.521mg/mL. By measuring six fungicides on Curvularia fung

14、us from the Andean governor, spore germination inhibition Preliminary find a microbicide to combat Curvularia lunata better PHarmacy, To control the disease with scientific theory.Key words : Fungicide; Curvularia leaf spot disease bacteria; EC50; Growth rate; Spore germination1前言(qin yn)1.1玉米弯孢病菌在我

15、国及世界(shji)的危害状况玉米(ym)弯孢叶斑病Curvularia lunata(Wakker)Boed是近年来我国玉米生产上新发生的一种危害性很大的病害1。早在1956年国外就有报道。我国有关该病的记载始于l9世纪70年代末80年代初，只因当时未能确定其病原，故称为“无名斑”。80年代中期，在河南省新乡地区种植的玉米骨干自交系黄早四上发生了该病。近10几年来，随着栽培制度改进，作物品种更换，气候条件的变化，玉米弯孢叶斑病已成为继玉米大、小斑病和黑穗病之后，在我国北方发生的又一灾害性病害。该病害发展蔓延快，已在辽宁、北京、河北、河南、山东、吉林和天津等地普遍发生，并对玉米生产造成极为严重

16、的影响。如1996年该病在辽宁省大面积爆发流行，发病面积达192105 hm ，其中绝收166l04 hm ，减产25l08kg，仅绥中县该病病级达4级以上，损失玉米800万kg。为了解决玉米弯孢叶斑病对玉米生产所造成的严重影响，国内外学者已对该病害做了较多的研究，本文前半部分就目前国内外的研究现状做一综述。1.2症状玉米(ym)弯孢叶斑病又称拟眼斑病、黑霉病2。它主要危害玉米叶片，有时也危害叶鞘和苞叶，在不同品种上其症状变化极大(j d)。其典型症状初为褪绿小斑点，逐渐扩展为圆形或椭圆形褪绿透明的病斑，中心枯白色或黄褐色，边缘暗褐色，周围有淡黄色晕圈。病斑大小一般为(0.54mm)(0.52

17、mm)，大的可达7mm 3 mm。在田间空气潮湿的条件下，病斑正反两面均可产生(chnshng)分生孢子梗或分生孢子，以背面为多，呈灰色霉状物3。严重时叶片上的病斑可出现联合现象，导致全叶干枯。赵来顺依据病斑的大小、形状、颜色及产孢情况等特征，将该病的症状类型分为抗病型(R)、中间型(M)和感病型(S)。感病型病斑(S)：病斑较大，宽l2mm，长l4mm，圆形、椭圆形、长条形或不规则形，中央苍白色或黄褐色，边缘有较宽的褐色环带，最外围有较宽的半透明草黄色晕圈，数个病斑相连可形成叶片坏死区。中间型(M)：病斑小，12mm圆形、椭圆形或不规则形，中央苍白色或淡褐色，边缘有较窄或的褐色环带，最外围有

18、明显的褪绿晕圈。抗病型(R)：病斑小，12mm圆形、椭圆形或不规则形，中央苍白色或淡褐色，边缘无褐色环带或有较细的褐色环带，最外围有狭细的半透明晕圈。1.3病原1.3.1病原菌种类引起玉米弯孢叶斑病的病原为半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、暗色菌科、弯孢霉属的真菌。国外学者认为，玉米上有多种弯孢霉菌引起的叶斑病，包括：新月弯孢菌Curvularia lunata(Wakker)Boed、苍白弯孢菌(C. Pallescens Boed)、斑点弯孢菌Cmaculans.(Bancroft)Boed和棒弯孢菌(C. clavata Jain.)、C. tested、C.tetramera、 C.erag

19、rostidis、C.trifolii、C. inaegualis)等。其中以新月弯孢菌气生变种Curvularia lunata(Wakker)Boed为优势种，造成的损失也最严重。我国到目前为止报道的有6种弯孢霉菌引起的玉米叶斑病，包括：新月弯孢气生变种(C. lunata Boed)、苍白弯孢菌(C.Pallescens Boed)、不等弯孢菌(C.inaeguais Boed)、画眉草弯孢C.eragrostidis(P.Henn.)JAMeyer、棒状弯孢(C.clavata Jain.)和中隔弯孢(C. intermedia Boed)，其中，(C. lunata)是主要的致病菌，

20、也是研究和防治的重点。1.3.2病原菌的生物学特性(txng)影响(yngxing)病原茵茵丝生长(shngzhng)的因素据张定法等报道4，该病菌的菌丝生长的温度范围为938，最适温度为2832。戴法超等人认为病菌的菌丝在40生长缓慢，菌丝生长的温度范围为640。该病菌对pH的适应范围比较广，戴法超、张定法等报道5，当pH为112时病菌均能生长，形成正常菌落。而白元俊则报道6，病菌在pH为28的范围内才可以生长，病菌生长的pH范围为412，最适为69。白元俊还报道，该病菌的菌丝生长的碳源以六碳糖为好，氮源以NH4+形态时较好；光照对菌丝生长无显著影响，但黑暗交替有利于孢子形成。病菌菌生长的最

21、适碳源为可溶性淀粉，氮源以NO3-形态最好，以NH4+形态最差。1.4影响分生孢子萌发的因素多数的研究者均认为，分生孢子萌发的温度范围为741。孔令晓等报道，分生孢子在1045范围内均可萌发，最适温度范围在2040。李富华认为，分生孢子萌发的温度范围在840，最适在25357。多数的研究者均认为，分生孢子萌发时要求高湿度，但在湿度范围上的报道并不一致。甘贤友认为，在5条件下，孢子在水滴中的萌发率为7090，在饱和湿度下萌发率仅50，相对湿度低于90时孢子很少萌发或不萌发。张定法报道，25饱和湿度下孢子萌发率只有7，而孢子在水滴中的萌发率为91，同时他认为分生孢子萌发的pH值范围为310。白元俊

22、认为，分生孢子在pH为411之间均可萌发。郑铉爽等报道，花粉粒(不论是新鲜花粉粒还是放置一年的花粉粒)及叶面物质都可以促进孢子的萌发，且随着浓度的增加，促进作用更明显。1.5 影响病残体产孢的因素有关影响(yngxing)病残体产孢的因素研究报道不是很多8。张定法报道，病残体产孢的温度(wnd)范围为1538，适宜(shy)温度为2535，病斑上分生孢子形成要求98以上的空气相对湿度。病残体产孢的温度范围为838，且随着温度的升高，病残体产孢时间缩短，当温度高于20，处理24 h后即可产生大量的孢子病残体产孢的最低空气相对湿度为961。1.6 病原菌的致病性及生理分化弯孢霉菌的寄主范围较广，据

23、报道弯孢霉菌除危害玉米外，还可以侵染水稻、高粱子粒和叶片，引起黑霉粒和变色米病害，还可以引起一种新的水稻叶鞘腐败病9。Fakir和Kulkami报道，该病菌可以侵染小麦，具有一定的致病性。WU报道，它还可危害一些禾本科杂草。此外还有研究者发现它可以寄生于番茄、辣椒的果实以及中药材山奈上。戴法超等对来自不同地区的10个菌株进行致病性测定，结果表明，不同菌株之间致病性存在显著差异，这种差异一方面表现在地区不同差异显著，如来自北京周边的菌株要强于山东济南的菌株。另一方面在不同寄主上分离获得的菌株致病性差异也表现显著，如玉米上分离获得的菌株致病性强于分离自水稻和小红豆上的菌株。吕国忠也报道该病菌的致病

24、性存在差异。鄢洪海在做博士论文时采用同工酶电泳技术、鉴别寄主鉴定技术、基因组随机多态性扩增技术(RAPD)及人工诱变，从寄主病原互作角度研究了玉米弯孢叶斑病的遗传、变异与致病性分化，明确了该病菌存在致病性分化和生理分化，并从遗传物质DNA水平证实病菌致病性分化并非是表现型差异，而是一种基因的分化，具有较稳定的遗传基础。他经过筛选大量玉米品种和自交系后，确定自交系沈135、78599-1、Mo17、477、C8605、E28、7922和黄早四为较理想的鉴别寄主，建立起我国玉米弯孢叶斑病菌致病性分化的鉴别寄主体系，并采用这8个鉴别寄主将我国玉米弯孢叶斑病菌大致划分为AF6个致病性分化型10。用鉴别

25、寄主鉴定结果和DNA遗传多态性辅助鉴定结果关系密切，特别是在强致病性菌株分组3种方法鉴定结果上基本一致。这一研究首次在国内外建立起以鉴别寄主鉴定为主，DNA遗传多态性和同工酶分析鉴定为辅的病菌致病性分化鉴定技术，为玉米弯孢叶斑病菌生理分化的进一步研究奠定了基础。陈捷等还研究了影响病菌生理分化鉴定的主要环境因子，其中湿度、温度和植株营养状况对病菌生理分化鉴定结果有明显影响。1.7 病菌(bngjn)毒素Macri报道(bodo)，C.1unata在Fries改良培养基上至少能产生两种毒素，且活性强，在稀释倍数较大时仍能引起玉米叶片(ypin)枯死。这两种毒素具有溶于水和乙醇，还溶于氯仿和二乙基醚

26、、可透析等特点，在pH较低时活性大，进一步研究表明，该毒素属非寄主专化性毒素11。我国吕国忠等、赵来顺等也报道，玉米弯孢菌叶斑病菌可以产生毒素，且毒素对寄主种子的萌发及胚根和胚芽生长都有抑制作用，可使幼苗枯死；毒索还可使寄主叶片组织的叶绿体、线粒体及细胞壁等超微结构发生明显的伤害作用，病菌毒素的紫外光谱分析显示，这种毒素是非蛋白质类物质，具有热稳定性。玉米弯孢叶斑病菌毒素不仅是病原菌的致病因子之一，在适当浓度下也可作为玉米抗性的诱导因子，但弯孢菌毒素中的有效诱导成份有待于进一步研究。1.8 发生规律和影响发病因素1.8.1 发生规律许多研究表明12，玉米弯孢叶斑病菌以菌丝体潜伏于病残体组织中或

27、以分生孢子状态越冬。遗留在田间的病叶、秸秆或施入田间的由带病玉米秸秆沤制而未腐熟的农家肥是该病重要的初侵染源。一般田间发病始于7月底至8月初，由于此病害潜育期短(23 d)，710 d后即可完成一次侵染循环，病菌可随风雨传播，短期内侵染源急剧增加，如遇高温湿，则在田间形成病害流行(高峰期)。但由于受生态因子的影响，各地在病害发生的始发期、进人高峰期的时间以及发病严重程度上都有一定的差异。1.8.2影响发病因素影响玉米弯孢菌叶斑病流行的因素主要包括田间菌源积累量、气候因素、耕作制度和栽培技术等。玉米弯孢菌菌源量是病害发生的内因，是发病的基础条件。多年来玉米秸秆一直作为当地农民的烧柴，有的群众家在

28、第二年春播时还堆存有玉米秸秆没有烧掉。加之秋翻地不及时，地里还残留带病菌的植株、残叶，这是第二年发病的初发菌源。随着发病面积的扩大，病菌量逐年增加。气候因素影响发病的严重程度。玉米弯孢菌叶斑的发生程度与7、8月份的不良气候条件密切相关，主要是湿度和温度。高温高湿是该病发生的有利因素，特别是78月份的湿度和温度是决定当年病害流行程度的关键因子。耕作制度和栽培技术对该病的发病程度有严重影响。各地大面积的种植感病品种是该病大发生的主导因素，现在主栽的玉米品种绝大多数都是感病和高感病的，高抗品种很少，不存在抗病品种，这就对该病的大发生创造了条件。玉米大面积连作，造成田间病残体多，增加了菌源数量。栽培管

29、理粗放也是造成玉米弯孢菌叶斑病发生流行的主要原因，有机肥施用量少，偏施无机肥，氮、磷、钾及微量元素失调；播种量大，植株密度大，田间郁闭，通风透光条件差，湿度增加，光照不足，既降低了玉米植株的抗病性，又有利于病害的发生流行。1.9 危害损失及其估计(gj)模型傅俊范研究了玉米弯孢菌叶斑病引起的产量(chnling)损失，认为该病对玉米百粒重、单穗重和产量都有显著影响，产量损失率与病情指数呈正相关，产量损失率最高为38.24，而病情指数对穗数没有直接影响13。他还利用统计分析软件构建了两个玉米弯孢菌叶斑产量(chnling)损失估计模型：关键期病情模型(CPM)：L=2.821 9+0.7402X

30、1(R=0.879 9，SD=5.214 9，N=18)。多期病情模型(MPM)：L=I.073+0.426X1+0.170X2(R=0.892，SD=5.289 8，N=18)。式中：L为玉米产量损失率，X1为授粉期病情指数，X2 为灌浆后期病情指数。张定法认为，产量损失与病级、病情指数之间均存在着极显著的直线相关。病级每提高1级，产量损失平均增加8.25；病情指数每增加10，产量损失平均增加4.14。在产量损失构成中，千粒重下降处于主导地位，约占66.6；穗粒数减少次之，约占33.4。1.10 玉米对弯孢叶斑病的抗性及抗性机制玉米(ym)品种和自交系对弯孢叶斑病的抗性存在即存抗性和诱导抗性

31、。Oye kan做了播期与玉米抗病性关系(gun x)的研究，结果表明14，播期对玉米的抗性影响很大，播期早，发病轻，抗性强；播期晚，感病重，抗性弱。赵来顺等就播期与抗病性关系的研究也得出同样结果。戴法超不同生育期抗性试验结果表明。玉米苗期抗性较强，随着生育期进程的发展玉米对弯孢叶斑病的抗性也在逐渐减弱，在13叶期最感病，由此看来玉米对弯孢叶斑病的抗性具有阶段性，可能受生理机能调控，是一种即存抗性。Olufolaji和赵来顺等报道(bodo)，在玉米生育期增施N肥，促进玉米健壮，叶片浓绿，可提高抗性；相反，缺乏营养特别是N肥不足，抗性明显下降。因此，玉米的生理状况也影响其抗性。Mandok h

32、ot报道，玉米弯孢叶斑菌分生孢子接触叶片后，利用雨水，2 h就可萌发侵入，芽管生长特快，并不断形成分枝和附着胞直接侵入寄主组织角质层、蜡质层根本对它侵入不构成障碍，因此，玉米对弯孢叶斑病几乎不存在结构抗性。Mandok hot的结论说明。在弯孢菌的强侵染力面前，玉米对弯孢叶斑病的即存抗性比诱导抗性弱。目前，对玉米弯孢菌叶斑病的研究多集中在品种抗性鉴定上。据报道15，不同玉米品种对弯孢菌叶斑病的抗性有明显差异，但是针对特定品种，不同的研究年份和不同生态条件下，其抗性鉴定的结果并不完全相同，甚至有时会出现完全相反的结论。总体说来，目前我国玉米主栽品种抗性单一，主要是抗玉米大小斑病和丝黑穗病，一旦新

33、的病害出现，条件适宜，品种往往很快失去抗性，由抗病品种变为感病品种，这也是近几年玉米弯孢菌叶斑病从轻到重猖獗危害的主要原因之一。由于玉米弯孢叶斑病是一种新病害，目前有关该病的抗性机制研究较少，黄娅琳对玉米抗弯孢叶斑病的生化机制进行了初步研究。结果表明16，病原菌侵染可以刺激寄主玉米产生酚类物质，且酚类物质的含量与玉米抗弯孢叶斑病性能之间存在明显的正相关；受病原菌侵染后，抗、感品种的PAL酶活性均呈上升趋势，但抗病品种PAL酶活性在接种前的基础水平和接种后的上升速度以及峰值均高于感病品种，故认为PAL酶在玉米抗弯孢叶斑病中发挥积极作用；受病原菌侵染后，抗、感品种的POD酶活性均呈上升趋势，但抗病

34、品种的POD酶活峰值的出现早于并高于感病品种；此外，受病后抗、感品种的POD同工酶变化趋势相同，都是在发病前、中期酶活性上升，后期稍下降，其中抗病品种的各酶带活性明显高于感病品种，这说明过氧化物酶在病菌侵染早、中期对抗病起着作用。在玉米与病原菌互作的过程中，感病品种的酯酶活性稍有下降，抗病品种在发病中期各酶活性均稍有升高，但抗、感品种的酶谱变化没有差异。此外，抗、感品种的过氧化氢同工酶谱的变化趋势相同，仅程度上有一定差异。1.11 综合(zngh)防治1.11.1 选育(xun y)和种植抗病品种抗病育种是防治弯孢叶斑病经济(jngj)有效的措施之一17。引进新的抗病种质资源，通过杂交、生物技

35、术等手段导入抗病基因，拓宽品种的遗传基础是遏制玉米弯孢叶斑病危害的关键。目前抗性较好的自交系及品种有Mo17 、沈137、799、沈试29和农大108等18。1.11.2 轮作换茬和清除田问病茬，减少菌源玉米收获后，及时清除病残体，集中烧毁或深埋。也可以在秋天时深耕、深翻，把病叶残株翻入底层或在玉米收获后进行浇水，而后深耕，造成湿润的土壤条件，消灭病菌。严禁利用玉米秸秆作架材。1.11.3 加强栽培管理，培育壮苗，增强植株抗病能力适当早播，可以减轻病害的发生；增施有机肥，培肥地力，优化氮、磷、钾及微量元素配方，合理密植，一般大穗型品种60 000株/hm2左右为宜；雨后及时排除田间积水，创造有

36、利于玉米生长发育的田间生态环境，提高植株抗病力，减轻发病程度。1.11.4 药剂防治 喷洒药剂是防治的最后一道防线，也是应急措施。当病情指数达到防治指标时(田间病斑株率达到10)，应立即喷药防治，一般用40多菌灵乳液6kg/hm2(500倍液)喷雾，7天1次，连喷3次，防效较好；用50的退菌特、80的炭疽福美或50的福美双，防治效果也可达70.082.5。此外，效果较好的还有70的代森锰锌可湿性粉剂、75的百菌清可湿性粉剂等19。1.11.5 搞好(o ho)病情测报工作由于玉米弯孢叶斑病的发病规律有待进一步研究(ynji)，故尚无一整套预测预报的方法20。从上述的研究结果看，可根据头年发病危

37、害程度和种源地玉米弯孢叶斑病的发病情况，结合当地的气象预报，做出病害(bnghi)发生危害估计。玉米弯孢叶斑病一般田间发病始于7月底至8月初，潜育期短。短期内即可完成一次侵染循环，因此，应注意预报和及时防治。2 材料与方法2.1试验材料2.1.1 玉米病叶 玉米病叶采自河南省林州市玉米弯孢菌叶斑病发生严重的玉米田块。2.1.2 供试杀菌剂50%退菌特可湿性粉剂(河北冠龙农化有限公司)50%多菌灵可湿性粉剂(青岛谷成金作物科学有限公司研制)20粉锈宁可湿性粉剂（天津市田园农用化工科技实业公司开发）75百菌清可湿性粉剂（连云港市德龙农药有限公司）80%代森锰锌可湿性粉剂(山东荣邦化工有限公司)70

38、甲基硫菌灵可湿性粉剂（江苏新沂中兴农化有限公司）2.1.3 仪器与用品无菌工作台、培养箱、玻璃棒、剪刀、解剖刀、接种针、接种环、70%酒精、0.1%升汞、火柴、橡皮筋套、灭菌培养皿、接种铲、打孔器、酒精灯、灭菌吸管（1.0mL）、吸液管（1.0mL）、镊子、烧杯、凹玻片、电子称、灭菌试管、吸水纸、记号笔、试管架、计数器、无菌水、荧光显微镜。2.1.4 其他试验用品培养基：PDA（去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、蒸馏水1000mL），制作方法是：称取200g去皮马铃薯切成小块，在小铁锅内先加1000mL蒸馏水，并用玻璃铅笔标记水液面，然后放入切好的马铃薯，煮沸半个小时，用纱布

39、滤除马铃薯，滤液仍倒入铁锅内，加适量蒸馏水使液面仍保持原标记处，再加20g葡萄糖和20g琼脂，加热使琼脂溶化，并用玻璃棒不停地搅动，以免糊底，直到琼脂溶化后再次补足水份。充分溶解后趁热纱布过滤，然后分装在100200mL的三角瓶中并封口，用灭菌锅（121）灭菌30分钟左右后取出冷却后贮存备用。0.1%升汞(shn n)溶液：升汞1g、浓盐酸2.5mL、蒸馏水1000mL（配制方法：先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解(rngji)后，再加水稀释）2.2试验(shyn)方法2.2.1病原菌的分离从玉米田间找取发病的新鲜玉米叶片（特点为：叶部病斑初为水浸状褪绿半透明小点，后扩大为圆形、椭圆形、梭形或长条

40、形病斑，病斑长25，12，最大的可达73，病斑中心灰白色，边缘黄褐或红褐色，外围有淡黄色晕圈，并具有黄褐相间的断续环纹。潮湿条件下，病斑正反两面均可产生灰黑色霉状物，即病原菌的分生孢子和分生孢子梗。感病品种叶片密布病斑，病斑接合后叶片枯死。）或找取上一年发病过的玉米叶带回实验室备用（如果是去年的发病叶片必须在用前浸泡于清水中24h以后用）剪取大小接近1cm的玉米弯孢病叶斑（玉米弯孢病叶斑的斑点大小为25mm左右，中心为白色且透明，边缘灰色至褐色）用刀子除去剪取斑点上的灰尘和其他杂质（目的是使分离的菌更纯化）在无菌台上将获得的病斑浸入酒精中56s然后浸入 0.1%砷汞中12min而后在准备好的无

41、菌水中浸蘸34s重复用无菌水冲洗34次将冲洗过的病斑叶片放在灭菌过的吸水纸上使病斑上的水吸干准备好倒好的PDA培养基平板将45片处理过的玉米弯孢病病斑放在倒好的PDA培养基上（病斑必须用十字交叉法方在倒好的PDA培养基上，而且互相不能靠近，以防止病菌相互交叉感染。此过程均在无菌下操作。）赶快盖上培养皿盖并记下制作的日期置于2728的培养箱中培养23天以后观察。2.2.2 病原菌的纯化 分离的菌长到菌落直径为12cm时，倒PDA培养基平板（待PDA培养基冷却以后开始纯化）用挑针挑取一小块带菌的培养基或菌丝然后快速接种到准备好的PDA培养基中心（此过程都在无菌台上进行，并且必须在靠近酒精灯旁边操作

42、。接种时必须将有菌的一面接在培养基上）快速盖上培养皿盖并记下接种日期置于2728培养箱中培养，三到四天以后进行镜检，根据弯孢菌的形态特征鉴定出玉米弯孢菌。其特点为：分生孢子梗单生或数根从生，暗褐色，不分枝，有隔，顶端多呈屈膝状，顶端和侧面着生分生孢子。分生孢子淡褐色、灰褐色，棍棒形或椭圆形，向一端弯曲，多数分生孢子3个隔膜4个细胞结构，中间两个细胞膨大，暗褐色，从基部向上数第三个细胞最大，两端细胞较小。分离到玉米(ym)弯孢菌进行单孢分离：其过程(guchng)为：（1）在产孢的培养皿中加入约5m的无菌水后用推布玻璃棒在菌丝表面轻轻推布以使产生的孢子进入无菌水中，然后倒入试管中备用。（2）制仅

43、有琼脂的平板冷却以后备用，同时(tngsh)倒几皿PDA培养基备用。（3）给制好的平板上滴一滴备用的孢子液后用推布玻璃棒推布以使孢子分布均匀。然后在超净台上用挑针在显微镜下挑去单个的孢子并接种在PDA培养基上。（4）将接种好的单孢培养皿方入2728的培养箱中培养,45天以后鉴定。2.2.3 分离病菌的初步鉴定用PDA 平面培养纯化的菌株,先在25 下暗培养，逐日观察、记录病原菌的培养性状;培养45 天后, 挑取病原菌进行镜检, 观察菌丝、分生孢子梗和分生孢子的形态特征。根据形态特征确定分离病菌的种类。当分离的病菌菌落颜色为淡黄色后，挑取病原菌进行镜检，其分生孢子梗单生或数根从生，暗褐色，不分枝

44、，有隔，顶部多呈区状，大小约70270um24um，顶端和侧面着生分生孢子。分生孢子淡褐色、灰褐色，棍棒形或椭圆形，少数呈“Y”型，向一端弯曲，多数分生孢子为3个隔膜4个细胞结构，中间两个细胞膨大，暗褐色，从基部向上数第三个细胞最大，两端细胞较小，大小为1930819,淡褐色。如果在显微镜下观察的病原菌符合以上特点，说明分离的病菌是所需的玉米弯孢菌。2.2.4不同杀菌剂对菌丝生长的影响将6种不同供试杀菌剂用无菌水分别(fnbi)稀释成所需的5种梯度浓度药液，每种药剂每一浓度各取5mL分别(fnbi)与45mLPDA培养基混合(hnh)均匀后倒入三个培养皿中冷却后备用，此即为所制的药板。将直径为

45、8mm的弯孢菌菌饼置于含药平板中央，每皿1块，以灭菌水为对照（CK）。每处理设3个重复。28下培养，定期检查，待培养四天后用十字交叉法测量菌落直径。也可以在接种后第二天就开始用十字交叉法每天测量菌落直径直到第四天。三天记录的实验数据可根据情况选择一天的作为论文中所要的试验数据。用下式计算抑制率：抑制率=（对照生长直径-处理生长直径）/（对照生长直径-0.8）100% 试验方法及步骤：（1）将消毒三角瓶中盛放的一定体积的无菌水分别于各种不同杀菌剂按所需比例混合，并作好药剂名称、浓度的标记。（2）加热融化定量即45mL培养基，冷却至5055时加入5mL供试药剂，充分摇匀后迅速倒入3个培养皿中，此时

46、等于将药液又稀释了10倍。因此，在配制药液时应该将药液浓度扩大10倍，这样正好达到所设计的有效浓度。待凝固后，标记各皿药剂名称及浓度。对照组的培养基加入5mL无菌水。（3）以无菌操作，用切菌环切取一块8mm的纯粹培养的菌种（最好均在菌落边缘选取，菌落边缘生活力强也比较一致），移植于各个凝固培养基的培养皿中央，然后置于恒温培养箱内培养。48小时即第二天后测量菌落直径，作为第一组数据，第三、第四天的作为第二、第三组数据。由于第四天后菌落长置于培养皿大小一样大，无法继续测量，因此，一组试验到此为止。2.2.5 不同杀菌剂对孢子萌发的影响将6种不同供试杀菌剂用无菌水分别稀释成所需的5种梯度浓度药液，采

47、用悬滴法将不同浓度的杀菌剂分别与同体积的孢子悬浮液混合，各取1滴于载玻片中央，盖上盖玻片，放入垫有吸水纸的培养皿，以灭菌水为对照（CK）。每处理设3个重复。在28恒温箱中保湿培养，24h后镜检孢子萌发数。孢子萌发标准为芽管长直超过孢子短径的一半。萌发率、抑制率的计算公式为：萌发率=已萌发的孢子/镜检的孢子总数100%抑制率=（对照萌发率处理萌发率/对照萌发率100%试验方法及步骤(bzhu)：（1）凹玻片是专为孢子萌发试验用的一种载玻片，必须先用肥皂洗净，再用洗涤液洗涤干净(gnjng)。普通载玻片也可以涂上硝酸纤维素，以改变液滴在其上的张力，或直接使用微型烧杯作萌发器皿。（2）孢子悬浮液的制

48、备：于纯粹培养的试管中注入灭菌蒸馏水约5mL，再用接种针或接种环轻轻推下斜面上的孢子(boz)，并使其充分分散，造成孢子悬浮液。用显微镜检查孢子密度，以在1010的视野中有80100个孢子为宜，尤其是不要过于密集，太密的难于检查计算。（注意：在与药剂混合后的每个液滴中的孢子密度不能相差太大，否则会影响准确度）。（3）每种供试药剂的各个浓度分别用1mL吸管依由低到高的浓度顺序各级取1mL注入吸取药液名称、浓度相同标记的小烧杯中。另用1mL吸管逐个吸取1mL孢子悬浮液注入已盛有药液的小烧杯中。摇匀后用移液管取一滴置于萌发玻片的凹穴中，每一浓度重复34片。然后放在垫有吸水纸的大培养皿或有盖的瓷盆中，

49、25恒温保湿培养。（4）经812小时后检查孢子萌发情况。培养时间不宜太长，不然萌发的孢子芽管过长而影响观察计数。一般萌发芽管有菌体孢子长度的1倍为宜。如果时间来不及检查，应加1：200的HgCl2 溶液一滴于萌发玻片的培养液中用于固定。3 结果与分析3.1 玉米弯孢菌的种类鉴定 图1玉米弯孢菌菌丝 图2玉米弯孢菌孢子在PDA培养基上，如图1，菌落中间呈灰色、灰黑色或墨绿色的地毯状，菌落边缘灰白色，呈整齐发射状，气生菌丝不发达、不致密，菌落表面不形成同心环，不产生或很少产生子座。基内颜色为黑色或墨绿色；分枝的菌丝微微着色至淡褐色，菌丝直径在25毫米左右；如图2，分生孢子梗深褐色，不分枝、有隔膜，

50、顶端常弯曲或纠结；27个分生孢子轮生、侧生或束生在分生孢子梗上；分生孢子基部不突出，壁光滑，3分隔，中隔不居中，自基部起第三个细胞特大而色深，孢子都在此弯曲，两端细胞色浅，孢子大小在1832816微米之间。根据以上特征，鉴定所分离的玉米弯孢菌为新月弯孢菌。3.2 不同(b tn)杀菌剂对玉米(ym)弯孢菌菌丝生长(shngzhng)的影响表1 6种杀菌剂对玉米弯孢叶斑病菌菌丝生长的测定（4d）杀菌剂Fungicide浓度（mg/m）Concentration菌落平均直径（cm）Diameter of colony抑制率（%）Percentage ofinhibition代森锰锌0.82.706

51、6.80.44.7730.70.25.2023.20.15.5317.50.055.9310.50（CK）6.53多菌灵0.41.2093.00.31.3390.80.22.1077.30.12.7366.30.053.7049.40（CK）6.53百菌清1.50.9797.00.751.2392.40.3751.7782.90.18753.2357.20.093754.3737.20（CK）6.48粉锈宁0.33.2357.20.153.6350.20.0754.3737.20.03755.1323.80.018755.6714.30（CK）6.486种杀菌剂分别通过等比稀释，制成含有不同(

52、b tn)浓度药剂的PDA 平板，其中70%代森锰锌的浓度分别为0.8 mgmL-1、0.4 mgmL-1、0.2 mgmL-1、0.1 mgmL-1、0.05 mgmL-1，50%多菌灵的浓度(nngd)分别为0.4 mgmL-1、0.3 mgmL-1、0.2 mgmL-1、0.1 mgmL-1、0.05 mgmL-1，75%百菌清的浓度(nngd)分别为1.5 mgmL-1、0.75 mgmL-1、0.375 mgmL-1、0.1875 mgmL-1、0.09375 mgmL-1，20粉锈宁的浓度分别为0.3 mgmL-1、0.15 mgmL-1、0.075 mgmL-1、0.0375 m

53、gmL-1、0.01875 mgmL-1，70甲基硫菌灵可湿性粉剂的浓度分别为1.4 mgmL-1、0.7 mgmL-1、0.35 mgmL-1、0.175 mgmL-1、0.0875 mgmL-1，50%退菌特的浓度分别为1.0 mgmL-1、0.5 mgmL-1、0.25 mgmL-1、0.125 mgmL-1、0.0625 mgmL-1，然后接上玉米弯孢菌，于28下培养96h后测定玉米弯孢菌的菌落直径，并计算抑制率，结果见表1。 续表1 6种杀菌剂对玉米弯孢叶斑病菌菌丝生长的测定（4）杀菌剂Fungicide浓度（mg/m）Concentration菌落平均直径（cm）Diameter

54、of colony抑制率（%）Percentage ofinhibition甲基硫菌灵1.42.8363.10.73.1756.90.353.9043.60.1754.5731.50.08755.1720.50（CK）6.30退菌特1.01.1793.30.51.2791.50.252.2374.00.1253.1357.60.06253.7746.00（CK）6.30 从表1可以(ky)看出，代森锰锌、多菌灵、百菌清、粉锈宁、甲基硫菌灵、退菌特等六种杀菌剂对对玉米弯孢菌菌丝生长(shngzhng)均有一定的抑制作用。然后以各处理杀菌剂的浓度对数值为自变量X,以抑制率转化的几率值为应变量Y,应

55、用(yngyng)统计回归方法 ,拟合出杀菌剂的毒力回归曲线。并且令Y = 5(抑制率为50%时的几率值) 代入毒力回归方程求出X，再转化成杀菌剂的浓度，即为EC50。EC50的数值越小，说明该药剂对玉米弯孢病菌的抑制效果越好。结果见表2表2 6种杀菌剂对玉米弯孢叶斑病菌菌丝生长的回归方程及EC50药剂(Fungicide)回归方程(Regression equation)R2 (Correlation co-efficient)EC50（mg/m）代森锰锌y=5.2851.264x0.8850.595多菌灵y=7.0991.667x0.9680.055百菌清y=6.6251.882x0.99

56、00.137粉锈宁y=5.8171.067x0.9850.172甲基硫菌灵y=5.2580.987x0.9860.548退菌特y=6.5961.454x0.9630.080从表2可以(ky)看出，除代森锰锌的R2值为0.885外，其他(qt)杀菌剂的R2值均大于0.960，说明(shumng)根据试验所得数据进行的毒力回归曲线的拟合程度比较好，所求得抑制中浓度也比较准确。多菌灵的EC50值最小，其EC50=0.055mg/mL。这说明多菌灵对玉米弯孢菌菌丝生长的抑制作用最强。退菌特次之，其EC50=0.080mg/mL，对玉米弯孢菌菌丝生长的抑制作用弱于多菌灵。而代森锰锌和甲基硫菌灵的EC50

57、值均较大，其EC50值分别为0.595mg/mL和0.548mg/mL，说明对玉米弯孢菌菌丝生长的抑制作用最差，不适合防治玉米弯孢病。百菌清和粉锈宁位于中间，其其EC50值分别为0.137mg/mL和0.172mg/mL，说明对玉米弯孢菌菌丝生长的也有较强抑制作用。3.3 不同杀菌剂对玉米弯孢菌分生孢子萌发的影响6种杀菌剂分别通过等比稀释，然后加入分生孢子，制成含有不同浓度药剂的孢子悬液，其中70%代森锰锌的浓度分别为0.8 mgmL-1、0.4 mgmL-1、0.2 mgmL-1、0.1 mgmL-1、0.05 mgmL-1，50%多菌灵的浓度分别为0.25 mgmL-1、0.125 mgm

58、L-1、0.0625 mgmL-1、0.03125 mgmL-1、0.015625 mgmL-1，75%百菌清的浓度分别为1.5 mgmL-1、0.75 mgmL-1、0.375 mgmL-1、0.1875 mgmL-1、0.09375 mgmL-1、20粉锈宁的浓度分别为0.15 mgmL-1、0.075 mgmL-1、0.0375 mgmL-1、0.01875 mgmL-1、0.009375mgmL-1，70甲基硫菌灵可湿性粉剂的浓度分别为1.4 mgmL-1、0.7 mgmL-1、0.35 mgmL-1、0.175 mgmL-1、0.0875 mgmL-1，50%退菌特的浓度分别为0.5

59、 mgmL-1、0.25 mgmL-1、0.125 mgmL-1、0.0625 mgmL-1、0.03125 mgmL-1，于25下培养12h后测定玉米弯孢病菌分生孢子的萌发率，并计算抑制率，结果见表3。表3 杀菌剂对玉米弯孢叶斑病菌分生孢子萌发的测定（）杀菌剂Fungicide浓度（mg/mL）Concentration孢子萌发率（%）Percentage of germ ination抑制率（%）Percentage ofinhibition代森锰锌0.832.866.40.446.752.20.253.145.60.164.933.60.0575.922.30（CK）97.7多菌灵0.2

60、57.692.20.12537.561.60.062555.243.50.0312563.834.70.01562574.024.30（CK）97.7百菌清1.517.582.10.7526.473.00.37544.154.90.187545.853.10.0937556.142.60（CK）97.7续表3 杀菌剂对玉米弯孢叶斑病菌分生孢子萌发的测定（）杀菌剂Fungicide浓度（mg/mL）Concentration孢子萌发率（%）Percentage of germ ination抑制率（%）Percentage ofinhibition粉锈宁0.1530.968.40.07539.7