BD多色流式全面解决方案

1、 BDIdentmcatlonofimmunecellsubsetsbyeight-colorantKxxlystainingBD多色流式全面解决方案BD生物科学JudyTheBDHorizonMTourNatRevlmmunoi.2012筋BD&、主要内容RorochronwKUrler禺谿BcHUDC&.monocytesandNKcetiTcplcwCO45RACCR4CCR4conCDllcAFCCDlflCDI27CDM898CD16C4VCCCCXXOCOCO20CO5.CD19dCOV4XCD,CD3COJCO)COMV500KADRHLKDRKADRHLADRAFCHr.HTt

2、*wte*MCCft.CC-h*nUirwCXCRl,tXC1;bC.ATC.KT、hrS-yWvepenncMofaphyNpot?*o*n*w)5Thdpec1.regbtwyI;VXk4*OXfcrttrUtel3hKrr、7KeomwxsEOHMkwwVS44k*tKr)*K05MKgyfrAkMRvOrtOiHW55fWR20BOLSrfortrnM805rrtnMX*2048SnmUKPtfire托K-Cy?tacnNKPCyS.SK-Cy?HtCKt5JM托rwyCyS.Srfv?fflCtKM)KPCyS.5640nmACAKAK-Cy?AKAK-Cy?ArtAtamfkorM

3、OAKHZ/AKCWAPCMvnfkjor?CCAPC-H7/AK-CV?4OSnm6V42W410fAlftVSCCf/AJlAMU)切bOSZWQ切砂8V421AMU)8忻gnoavuHavtsoSV7115V76561nm35SnmPtpt-asMpg?bwmBVVH785mA7i?22345BOHui/cn-ZK巾*讹il借祈権呼。六种被紫激光激发的染料一基础多聚体:BV421andBV510一那联体：BV605.BV650.BV711andBV786亮的染料减少交叉激光激发减少备杉响BDBDBD站与其他染料的比较BufferCompatibility-SurfaceStainTram

4、cnpdonFactorBufferBOHvt/oiBVCD4试剂与PE比较HuCNBVSfOPennHISoluncoaoHuCD4BV7S6BDBDBD #Hz-oBuffercompatibility:intracellularstainingnstimulatedCMVpp5SEB紫激光配置：Afjrr“CD4CD8BDBDHorizonBrilliantUltraviolet(BUV)赠学部T所用的为竝人限度地发挥BDHorizonBnlliantViolet的组合优势.仪器町能需要更新配賈BD与其他染料的比较 #HIM中林ft明亮弘JEmnl:348nm395nmEErrv:348

5、nm737nm滤比片：379.28BP谑光片:74Q358P：690LPBD两种枝355nm敦外激光漱发的新荧光索BUV395:1!他检测H.谒BUV737:x-JAIexaFluor7001啲浴沏eo”55 # BB515isuptoseventimesbrighterthanFITCHuCD19Brightness:VeryBrightExMax490nmEmMax515nmFilter:SameasFITC(e.g.530/30nm)BOKon/ai-Z*;力哦线IfBDMsCD11bHuCD127 #.BetterresolutionofdimmarkersLVvB25FITCLWRp

6、AnFl25F8S1SBD彳出0ii2竹）ii*CD25FITC9ii1ri“CD25BB515荧光素同抗原的搭配理解抗原表达的特性选择最合适荧光素偶联的抗休 #CD25FITCorCD25BB515andCD3PerCP-Cy5.5.CD4APC.CD127PE BOHwizwiZt力讹”信*懂！FBDTheBDHorizonvTour抗原的分类3抗原密度列表三大类：Primary:容易区分阴阳性细胞群.阴阳性蜂分得很开-Examples:CD3,CD4,CD45Secondaiy:很好鉴定较高水平表达.经常连续性衣达-Examples:CD27,CD28,CD45RA,CD45ROTert

7、iary:低水平表达.激活marker或者表达区分不明见-Example:CD25在2ft达最低密度的抗原上H配量亮的烫光就抗BtSf度一定是在细胞亚詳水平I衔疋的込个理则公山通進何相互溢洌共表达尊JW因有所改变度也会由J淞活状念而仃所改费BDBDHouc-ZHBD抗原和荧光素的组合抗原共表达mediumhigh|HtWMMrm*WKW*IVeorwErwwaowwwrvniKHowrrB*IooTy”Wtwnn-|rtyrifcr*?RTCMKurtxveubMcrnUKAiiafMreM?AM4lkCT心KB*KBOHotxai-BDMarker的共表达：-Populationresolu

8、tionisimpactedbyspillover.细胞群的分鮮率会受到通道溢漏的杉响-Markersco-expressedonspecificcelltypesshouldbeconjugatedtospectrallyseparatedfluorochromes.-在紛定细胞亚新其牝达的marker该偶联光谧分出的淡光素T细胞panel中.可能用到的marker:CD3,CD4,CD8,CD45RA,CD27,CCR7,CD25,CD127BDHoun-7M.BD 清慚分祥的能力取决于育量和阴性群体的分散度.BD优化仪器配置，提高分辨率分辨率的重要性优化仪器设呂：CS&T荧光溢漏分辨率分

9、辨率-流式细胞位区分如染色信弓和未染色信y的程度在多色倩呆下更为复杂 # tefcoBCMnomcon(25TheBDHorizonMTourBD亠分辨率vs.背景|性前体浮乐低分耐淸晰4染色指数:分辨率的度量标准阴性祥体UJRffi不能淸嘛分阴性群体VRUUD分散度（相対标族僞差天不能清酸分染色馅数亮度/MFI阴件仃廿的宽呢SD1闭tt*号的宽度亮度取决于试刑HWia所用茨光索仪罟通逋电斥琳itt光0能妝阴性辭体的世度取决于仪曙性能-松；WT电J弋叙敢色iCihliJ色方冬BOKm/cn/如0色力*讹”信If用歼BDBDHotuoc*ZW多PM*讼计优豪胃肝加BD流式细胞仪设置和跟踪（CS&

10、T）系统CS&T系统的益处 #科学家/便用者-从炙色实齡中那到岛质师的数棚毎灭提供稳定井nj*fr条件优化仪捷供毎次实艘时仪器状态的筋0平台负责人廉作者尽早发现仪髀性能的下降帮助确定材題的来讯-捉供设田仪器的（S息（系统电子背景嗥音）CS&T是一个由软件（FACSDiva和FACSuit。和试刑（CST微球）整合面成的完整*.CS&T系统的作用-暁定决定仪器性能.杉响灵敏度/称体分辨率的因責川对荧光檢测效率（Q0相对光学背景但）系统电子背星噪ff（SDen）-标准化仪器设IS应用设-跃踪仪器杵能 # #BOKmzw-參0力*讹権If”BDBDHsttzoft-zWBD BD荧光溢漏的重要性1.

11、多色方案群体分辨率为了使烛兴世的外体获的绘好的分辨率荧光溢滿足方系设计时唯一越为埜要的因索2.复杂数据的可视性不止确或欠佳的iftiWtft计兔会对实齡所側的产生负而的tafooaiMmn.contSlTheBDHorizon1*lourBD炎光溢漏到其他检测器导致背景及信号分散，|影响分辨率农尤也闊卅II乜廿科衣：比如PerCP-CyS.5,w欄iPE-Cy7的桧滅n烫光沦目导政：frsus(MFiwa：僞号分血分徽度rSD.将泪材所效的弁缺扣除的辻榕彩为补宦.NegativePocrtivoIMFIrSDMFIrSDoCamp1229098Comp(?)29(T)的闭怜1体血训怜口体的平垢

12、灾咒*及皿嗽*的馆而.占舗猗仮的估号分般zS3)ftW“忸床不侥被卄協斫的Mt补偿对照-微球补偿微球的优势-易用-不需要细胞-对干炙数災光索所得的补偿位与细胞所那的一致eOMcnzurt-參色才讹”(ntMrunc*n/)4KBOLwiX.M4S单色对照计算溢漏值的工具TheBDHorizonwlourBD多色Panel设计实例分析TheBDHorizon*Toor -多色实验Panel设计实例分析BD依据-机器性能（光路配置）-分析中的生物学内在关系（目的细胞聊.抗原密度和共表达）-选择的荧光索优先顺序（荧光亮度和通道间溢漏）应用逻辑规则分配荧光索给待异性抗体 # #6色Treg细胞配色实例

13、.抗原密度和荧光素亮度匹配 #BlueFITC/AJexaFluor48&B5515PE(488nm)PerCP-Cy5.SPefCPPECy7RedAPC-AlexaFluor647(640nm)APC-H7(APC-Cy7双漱光6色A33I0NMEHTLaarANIIOEN8pcAcyBD举例4遵循规则根卅抗廉农达分配荧光索的嘛则来优化panel举傅2录好的实践进一步优化paneltTregfft分辨率最大化&典茨达浜光iff的売喪：宀地逆间Si港导致的分散程度BD荧光染料的抗廉农达水平郴匹配低密度农达抗原需要更亮的荧光索荧光染料Z间的莖栓赧小避免偶联染料帯来的假阳性BDWtgTZ*多0巾

14、*设计背豪冑即&: # 6色T细胞Panel:举例2通过分配PerCP-Cy5.5给CD8來减少PerCPCy5.5jtt|g到PECy7通道的杉响通过分散CD25和CD127到不冋漱光符和迭择址小溢漏荧光索来捉儲Treg彷辨率CD3FITCCD3FITCCD4PerCP-Cy5.5-CD4APC-H7CD8APC-H7-*aCD8PerCP-Cy5.5优化panel使黄光通道溢H最小化FITCCD3PECD25PerCP-CyS.SCD8PE-Cy7CD45RAAlexaFluor47CD127APC-Cy7CD4CD45RAAPCCD127PE-Cy7CD45RAPE-Cy7CD127Al

15、exaFluor647CD25PECD25PECD2SPECD2SPEBD8DBD #.6色Panel中例1,例2结果比较1dExampleX0P8.“CD2SPECD28PEQicncaifunxnM4TheBDHorizonTour # #BlueFITC.AlexaFluor48&BS515PE(488nm)PerCP-CyS.&PerCPPE-Cy7RedAPCAiexaFluor647(640nm)APC-M7/APC-Cy7VioletBV421V450(405nm)BV510V500Expandingthe6-colorpaneltoan8*colorpanelCD3FITCBV

16、421andBV510:2个说兴的災光董CD4APC-Cy7亮发和少的溢漏允许被添加impanelCD8PerCP-Cy5.5CD25PECD127APCCD45RAPE-Cy7CCR7BV42CCD27BV5108色T细胞Panel设计丕財案Scenario#1从已行的6色panel开始.征拓胜的机召祝11上液加marker优化6色方案TOC o 1-5 h zJ丿Scenario#2.按那色panels计的片1则根据机2SM朮理立待井竹的8色方案X/厂方案化6色Panel优化到8色Panel餐澈光町得然而6色panel井没仔考老添加9!marker.卩眦对干8色panel來说.并不足赧佳的

17、-添加了2个新的marker.但陷个panelf-没有遵循panel设计的原则 #BDBDHacuooBD # #-2方案2：g按照3激光配置优化最佳8色方案 # BOHaixai*z*.9wgExisting6-ColorPanelCO27WOQe7_ist58CO2TFECCR?BV421CCR7BY421CD45RArefla!*ACThavesionflcartEmicenaro2.SewCDZ7rejoixonrscenaro2. #BDBD拓展8色pane倒色panel44色Pan上拓展新的panel后，Effector/MemoryMarker辨率没有改变添加Tegmarker到这个panel中CCR4.CD95.CD122足非常重要的对干鉴定新的Treg亚群.我们想尽可能解决这个问题在8色panel设i|傑路的基础上添加新的marker.荧光素的分配显得很容易我们做了如卜分配.m从ij的黄尢索只有很小的溢汩足不何的激光箭激发的CCR4APC.CD95PE-Cy7.CD122BV421BD118or:8Color+Tregdrop-in