RTPCR原理与实验操作步骤讲解

1、RT-PCR原理与实验操作步骤聚合酶要点词：RT-PCR逆转录酶 reversetranscriptase链式反应引物设计DNA聚合酶，、知识背景:1、基因表达：DNA RNA Protein单拷贝基因表达存在逐渐放大概系，如一个蚕丝心蛋白基因104个丝心蛋白 mRNA (每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白)共合成109个丝心蛋白。所以单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是特别重要的。2、 PCR 技术(olymerase chain reaction):即聚合酶链式反 应。在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引

2、物序列决 定。反应分三步：A、变性：经过加热使 DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA ；B、退火：将反应混杂液冷却至某一温度，使引物与模板结C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2 +存在下，退火 引物沿5 3方向延伸。以上三步为一个循环，这样频频。3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶(reverse transcriptase )是存在于RNA病毒体内的依 赖RNA的DNA聚合酶，最少拥有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第 一条链；2、Rnase水解活性：水解 RNANA杂合体中的 RNA ；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模

3、板合 成互补的双链cDNA.二、RT-PCR 的准备：1、引物的设计及其原则：1)引物的特异性决定 PCR反应特异性。所以引物设计能否 合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充 分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不一样亚型，不一样的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性 的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，也许在目的 蛋白表达过程中特异存在而在其余亚型中不存在的内含子。2）引物设计原则的掌握：引物设计原则包含a、引物长度：一般为1530bp，引物很短会影响PCR的特异 性，引物太长PCR的最适延伸温度会超出Taq酶的最适温度， 也影响反应的特异性。b、碱基

4、分布：四种碱基最好应随机分布，防范嘌吟或嘧啶的齐集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40 %60 %，PCR扩增的复性温度一般是较低 Tm值减去510度。c、3端要求：3端一定与模板严格互补，不可以进行任何修饰，也不可以有形成任何二级结构的可能。末位碱基A时错是配的引起效率最低，G、C居中间，所以引物的3端最好选 用A、G、C而尽可能防范连续出现两个以上的 T。d、引物自己二级结构：引物自己不该存在互补序列，不然会自己折叠成发夹状结构或引物自己复性。e、 引物之间的二级结构：两引物之间不该有多于4个连续碱基互补，3端不该超出2个。f、 同源序列：引物与非特异扩增序列的

5、同源性应小于连续8 个的互补碱基存在。g、5端无严格限制：5尾端碱基可以游离，但最好是 G或C，使PCR产物的尾端联合稳固。还可以进行特异修饰（标志、 酶切位点等）等等。依据实验目的选择合适的引物。常用引物设计软件如Primer5.0 ， Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。2、 耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管苹头、EP 管之类早先都需经过 0.1%DEPC 水浸泡办理，除去RNA酶，防范操作过程中RNA降解。而后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC）。3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC办理并高压的水。三、RNA的提取方法：RT -PCR中

6、从细胞分其余RNA的质量至关重要，包含RNA 的纯度和完好性。RNA分其余最要点要素是尽量减少RNA酶的 污染。但RNA酶活 性特别稳固，分布广泛，除细胞内源性RNA 酶外，环境中也存在大批RNA酶。所以在提取RNA时，应尽量创建一个无RNA酶的环境，包含去除外源性RNA酶污染和克制内源性 RNA酶活性，主若是采纳焦 碳酸二乙酯（DEPC ）去除外源性 RNA酶，经过RNA酶的 阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氤酸胍克制内源性RNA酶。实验操作步骤一、实验用具与资料：1、移液枪：1ml、200 ul、20 ul、10 ul、2 ul2、吸头：1ml、200 ul、20 ul3、匀

7、浆管：5 ml4、吸头台：搁置1ml吸头的一个，搁置 20 u l吸头的一个5、EP 管：1.5ml、0.2ml、100 ul6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml、1.5ml、20 ul10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒：1个13、大瓷缸：2个14、锡泊纸：一卷15、卷纸：2卷16、三角烧瓶：带盖，稍大二、实验用具的办理与准备1、塑料制品：（包含枪头、

8、EP管、匀浆管等）先将DEPC水沉石量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐一浸泡此中，此中小枪头需要吸管打入/PC水，过夜，而后高压，再烤干备用，实验前将枪优等放入吸头台，再高压一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1 %oDEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包含剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC ）三、试剂配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1 %o DEPC 水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。2、 75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，而后放-20 C保存（此中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色

9、瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖四、几种缓冲液的配制：1、电泳缓冲液：Tris 54g硼酸0.5M EDTA 20ml ?蒸溜水1000mlXTBE （储存液）再将5 XTBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml储存液450ml水-500ml工作缓冲液2、上样缓冲液：0.25%漠酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油X缓冲液，4 C保存五、琼脂糖凝胶的配制：1、1.0% :1.0g琼脂糖100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，融化的 琼脂物冷却至60 C时加入10mg/ml漠化乙锭2.5 ul，充分混匀， 将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下

10、搁置30-45min后现进行电泳。2、1.5%:同上，将琼脂糖的量改为六、需购置的RT-PCR资料：(生工.Tel. 2236106.)Taq 酶(含 MgCl2 Buffer )dNTP: 1 支Oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promegaM-MLV: 1 支 250.00 promega (Buffer)RNasin: 1 支 110-20 CTrizol 100ml/1 瓶 Invitrogen Life technologies- 4 CMarker: 10(1543. 994. 697. 515. 377. 231) 七、引物合成正义：5 -CACGATGGAGGG

11、GCCGGACTCATC- 3 反义：5 -TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT- 32、par-4:正义：5 -GGGACCTCGGAACTCAAC- 3反义：5 -TGTATCTGCCTGGGACTG- 3，3、退火温度计算2 (A T) 4 (G C )正反义均匀数，再上下颠簸度(4C,或5C)4、引物各合成5 OD，每OD 一瓶分装好5、引物稀释：加DEPC水量为(H)=? nmol / ODX管上所标 OD 数 X100是为10p mol /u浓l度的引物溶液八、PCR产物电泳先将1- 10 ul左右PCR产物，加已点在纸上的漠酸兰，频频吸打混匀后进行电泳，一般电流为 1

12、0mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。九、几个注意点：1、逆转录的要点步骤是马上冰水浴？2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。3、RNA抽提早，打开离心计预冷。TRIzol法抽提总RNA细胞1 X 107组织100mgI加 1mlTRIzol细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块I匀浆（要完全，后转至 EP管）（组织匀浆量100mg时分装1ml/每EP管）I 颠倒混匀10下，室温5分钟I加氯仿1/5体积（0.2ml ）（一定按整体积的 1/5 ）颠倒混匀10下，室温5分钟I4。，离心 12000g，15 分钟I转上层水相（约 400 ul）于另一 1.5ml

13、EP 管中I加等体积异丙醇（约 400 ul），混匀室温10分钟I4。，离心 12000g，10 分钟I弃上清I加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1mlI4 。离心7500g , 5分钟I弃上清，空气干燥5-10分钟（不可以完好干燥）I溶于 DEPC 水中至 20 ul（10 ul-20 ul）（可在55-60 C水中，10分钟助溶）注：1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，不然DEPC 溶解2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60 C搁置最少一个月（甚 至可一年以上）3、 RNA在75%乙醇中，2-8 C最少可保存一周，-20 C最少可保存一年两步法RT-PCR（第一步：逆转录反应） 试剂浓度体积终浓度RNA 23 u口 1)u g/ u 1 4 u 1(2 u u g/ ul(稀释10倍后用)I混匀，离心，70 C 5minI马上冰水浴，稍离心I试剂浓度体积终浓度M-MLV Buffer 5 X 8 u 1 (4 u 1) 1 XdNTP 10mM 2 u 1 (1 uRNasin 40U/ u 1 1 uu 1) 20 u整体积 40 ul( 20 ul)I混匀，离心，42 C 60minI95 C 10min (破坏 ML