冰草6平染色体片段渐渗到普通小麦后增加了千粒重和穗长(共6页)

1、文章(wnzhng)研究目的：探讨(tnto)了小麦-冰草6p染色体片段异位的遗传组成(z chn)，并且确定了6p染色体的易位片段对于小麦的千粒重以及穗的长度影响。背景介绍：一些野生近亲材料为栽培作物提供了丰富的遗传资源。引言：普通小麦（Triticum aestivum L.,2n=6x=42,genomes=AABBDD)是一种主要的谷类作随着全世界人口的增加、气候条件的改变以及农业产品的需求量的增加，这些都迫切的要求我们在未来几十年里需要提高作物的产量。然而在长期的栽培过程中，精英小麦的种植已经造成遗传多样性的下降。拓宽小麦的遗传基础对于提高其产量和质量，以及增强其生物胁迫和非生物胁迫

2、的抗性方面的育种有非常重要的意义。而一些野生的材料正好拥有一些很好的基因和遗传基础。培育小麦-近亲野生材料易位品种并且对其遗传组成进行分析，这对于高效的转移有价值的基因是非常关键的。近年来，将普通小麦与山羊草，中间堰麦草，大赖草，黑麦，簇毛麦以及新麦草进行杂交，许多种属间杂合易位系已经被培育出来了。这些野生材料具有一些新的抗病基因，如叶锈病，茎锈病，条锈病等等。材料介绍：冰草（Agropyron cristatum，2n=4x=28，genomes pppp),是重要的小麦野生近缘物种，它拥有许多良好的性状，如高分蘖数、高小花数、抗小麦锈病、白粉病和大麦黄矮病毒早在20世纪90年代通过大量的杂

3、交和胚拯救途径，获得了一系列的common wheat cv.Fukuhokomugi-A. cristatumaccession Z559种属间杂种。同受体亲本Fukuho相比，异附加系4844-12每穗上具有更多数量的小花和籽粒Wu等人已经在冰草6p染色体上定位出了能够增加小花和籽粒数量的农艺性状。通过辐射技术和山羊草杀配子染色体效应获得了许多小麦-冰草6p易位系。小麦-冰草易位系Pubing3035来源于小麦-冰草异附加系的辐射杂交种，这是一个有价值的小麦-冰草6p染色体插入中间的易位系。为了详细的了解Pubing3035的遗传组成以及进一步探索位于冰草6p染色体上的优良基因，严谨的回交

4、和自交是必要的手段。将Pubing3035同普通小麦Fukuho进行杂交以此获得F2分离群体和BC1F1分离的群体。有趣的是，在这两个群体中，包含有6p易位染色体的片段易位系展现出了更优秀的农艺性状（千粒重和穗长）。在本研究中，采用全基因组原位杂交、荧光原位杂交以及分子标记技术来研究Pubing3035的遗传组成，同时也定位了插入冰草6p染色体中间的染色体片段上面的优良农艺特性。材料和方法：小麦-冰草6p双体异附加系4844-12（2n=44）和双体异代换系4844-8（2n=42）。材料的获得：将冰草Z559（2n=4x=28，PPPP）同普通小麦T. aestivumcv. Fukuho杂

5、交获得。小麦-冰草6p易位系WATP6-32（辐射二代种），来源：将Gaocheng 8901和4844-12的杂交种进行辐射得到。受体亲本Fukuho和高强筋小麦T. aestivumcv.Gaocheng 8901是普通小麦品种。从WATP6-32连续自交七代的后代中通过细胞遗传学分析，将易位系Pubing3035分离出来。F2群体由Pubing3035和Fukuho杂交获得。BC1F1回交群体由轮回亲本同Pubing3035连续的回交获得。F2群体和BC1F1群体大小分别为310和88个。这两个群体用来研究优秀的农艺性状同异源附加染色体片段之间的关系。方法(fngf)：探针(tn zhn

6、)pAs1是一个(y )长度为1kb的重复序列，来源于Ae. tauschiiCoss.(2n = 2x = 14,DD)，它使得我们能够鉴定小麦所有D组的染色体。pHvG39克隆能够同B基因组产生很强的特异性杂交信号而与A、D组杂交微弱。使用探针pAs1和pHvG39克隆作为探针进行双色荧光原位杂交来鉴别发生易位的小麦染色体。分子标记分析：为确定易位的6p染色体片段和他的位置，从GrainGenes2.0网站上下载并筛选出位于小麦1A染色体上的462对ssr引物和13对STS标记。并且，根据已经发布过的冰草转录组序列，设计出了680对6p染色体特异性EST-STS标记。农艺性状的评估：性状的

7、评估最初都是针对双亲和大群体。对于亲本进行的区域试验选择了两个地方（北京和河南新乡），每个试验三个重复，每行20株，种在两米宽的地中，空出0.3m的田沟。重点调查所有亲本几个重要的农艺性状，如，株高，种子育性，穗长，每穗籽粒数，千粒重以及小花密度。同样，310个F2群体以及由包含易位片段Pubing3035和普通小麦Fukuho杂交得到的88个BC1F1群体，在2013-2014年播种，并且调查性状。每个单株都要通过特异的序列标签标记来鉴定P基因组。之后，两个群体被分成两个组：通过冰草6p特异性标记的群体鉴定，将这两个群体分为两个组：6p易位植株和非易位植株。在收获的时候，对F2群体和BC1F

8、1群体每个单株进行性状调查，同时也对Pubing3035,4844-12,Gaocheng8901及Fukuho亲本的20个植株进行随机选择来调查性状。使用SAS软件进行数据分析，用t检验来调查6p易位植株和非易位植株之间，以及各亲本之间农艺性状的差别。图一：发生易位的小麦部分同源染色体GISH/FISH鉴定。a图表示用P基因组的DNA（红色）作探针来检验Pubing3035中的6p易位片段。b图表示的双色的荧光原位杂交技术，用pHvG39克隆（绿色）和pSs1（红色）作为探针来鉴定Pubing3035.遗传图谱的构建和QTL作图：为更进一步确定发生易位的位点以及冰草染色体同农艺性状之间的关系

9、，我们使用了F2群体构建了遗传图谱。用IciMapping3.3软件进行了QTL作图和关联分析，LOD值取2.5为临界值。结果：GISH和FISH分析用技术可以获得易位系基因组结构的清晰图片，这都得益于我们在有丝分裂中期使用的冰草全基因组的作为探针并且用的作为封阻探针。根尖体细胞成像结果(ji gu)可以看出：易位的有着非常小的带有红色杂交(zjio)信号的冰草染色体片段。从的荧光信号图中可以看出，在着丝粒附近有一段外源染色体片段插入。的结果表明含有普通小麦的条染色体，所以它能够被看做(kn zu)一个小麦冰草中间插入的易位类型。双色荧光原位杂交技术结合全基因组荧光原位杂交技术揭示了染色体片段

10、易位到了普通小麦组号染色体的短臂上面。因此是中间插入型的易位系。分析：上有着来源于冰草转录组的对基因组上的特异性序列标签位点引物。从这对引物中，我们又筛选出了对引物，这些引物对冰草、双体异附加系、双体异代换系以及能够扩增出条带而而对普通小麦和则不能扩出条带。这些引物扩增的长度多数在到个长度。结果表明这些引物能够作物分子标记来示踪冰草的异源染色体。图二：易位系的引物扩增图及阴性对照；.冰草，.,.,.,，.，.箭头指向的是冰草的扩增产物的检测。图三：左边的是小麦的染色体遗传连锁图，右边是物理图谱。遗传图距展示在遗传图谱的左边，标记在右边。冰草的特异标记以粗体展示。右侧是染色体的物理图谱，包括 C

11、-1AS1-0.47、1AS1-0.47-1以及1AL。标明的缺体系和小块的断点在左侧，bin-mapped标记在右侧。橙色区域指代的是冰草6p染色体的缺少区域。物理图谱来源于GrainGenes 网站上。小麦-冰草6p易位系的易位点：为了证实易位的小麦的染色体和中间插入的位置，我们使用位于小麦1A染色体图谱上的一共461对SSR引物和13对序列标签位点标记来查看是否这个易位系仅仅只是插入了6p染色体的一个片段而没有丢失任何其他的1A染色质（表S1和S2）。分子标记分析的结果表明在Pubing3035中1A染色体上没有标记丢失。用遗传图谱分析的方法来精确的定位易位的位点。检测了这些标记在Pub

12、ing3035和Fukuho中的多态性。通过筛选后，这些标记中有34（7%）对SSR引物在两个亲本中能扩增出多态性条带。选择小麦多态性SSR引物和冰草EST-STS引物来确定发生易位的位点。在F2分离群体中，卡方检测表明发生易位和未发生易位的植株比例遵循理论上的3:1比例。根据小麦的标记和冰草特异标记之间的连锁关系，发生易位的染色体和易位的位点已被确定。基于F2群体的连锁图谱表明冰草6p特异性标记同位于1AS上的标记有着关联。6p染色体片段被定位在SSR12引物1cM到SSR263引物3.52cM之间（图3a）。这两个与小麦基因组草图序列一致的标记被定位在小麦1AS上靠近着丝粒区域（图3b）。

13、冰草6p中间(zhngjin)插入的染色体片段来源分析：为查明(ch mn)冰草6p中间插入片段(pin dun)的来龙去脉，我们使用了基于SLAF-seq测序的Agropyron Gaertn.p基因组高密度图谱。开发了9个位于冰草6p染色体SLAF标记来分析在Pubing3035中的异源片段起源。如图4所展示的，4个标记（SL4746，SL4100，SL10594和SL12433）从冰草6p染色体的短臂筛选出来，另外五个标记（SL11313, SL26496, SL17120, SL12396和SL45115)从冰草6p染色体长臂上筛选出来。不过仅仅只有一个SLAF引物（SL11313）能

14、够在Pubing3035中扩增出特异性条带。与P基因组上遗传图谱的位置信息结合，我们发现SL11313标记同SL12396和SL45115两个标记位于相同的位置。这结果表明在Pubing3035中冰草6p中间插入染色体片段来源于冰草的6p染色体长臂。Pubing3035农艺性状的调查：在生长期的时候，Pubing3035就表现出紧凑的植株表型并且要比普通小麦Gaocheng8901要高大。在收获的时候，所有的亲本都要调查性状，性状包括：株高、生殖枝、穗长、每穗小花数、每穗籽粒数、每个小花籽粒数、千粒重和小花密度。超过两个地点的性状调查，结果都是相似的显著水平，这表明在独立的环境中Pubing3

15、035的表型遗传上是稳定的。在这三个亲本中，Pubing3035的每穗小花数、每小花籽粒数和每穗粒数要低于另外两个亲本4844-12和Gaocheng8901。Pubing3035的高度要高于Gaocheng8901，但是低于4844-12.在生殖枝方面，Pubing3035和Gaocheng8901之间没有显著的差异。然而，这三个材料之间，在千粒重、穗长和小花密度方面表现出了显著的变化。Pubing3035和4844-12相比于所有的Gaocheng8901植株有着更高的千粒重、更长的穗长以及更低的小花密度（表格2）。以上结果表明冰草6p中间插入片段对千粒重和穗长方面有着积极的调控作用，它为

16、改善穗的性状和增加产量而不延长生长期和成熟期提供了可能性。冰草6p易位片段遗传上的影响：对F2群体进行了t测验、对BC1F1群体更进一步的分析了6p染色体的片段在遗传上的影响。结果显示在穗长、千粒重和小花密度性状方面有着显著的差异；然而在F2群体中易位和非易位植株间在生殖枝和每穗籽粒数性状上没有明显差异。通常来讲，易位单株的（千粒重=45.4g）千粒重要比非易位的单株（千粒重=42.8g）要高2.5g。发生易位的单株穗长（10.2cm）大约要比非易位的个体长0.7cm。类似的结果也出现在BC1F1群体中的易位和非易位个体之间（表3）。在BC1F1群体中，易位单株的千粒重也要比非易位的单株重2.

17、5g，穗长也要长0.7cm。以上结果表明小麦-冰草6p易位单株对于增加千粒重和穗长的表型有促进作用，这对于提高小麦产量和改善穗子的性状方面有着重要意义。为了找出小麦-冰草6p易位的个体不同的性状的QTL位点，进行了QTL定位。这些性状包括株高，分蘖数，穗长，穗粒数，千粒重以及小花密度。通过使用6个小麦SSR标记和8个冰草特异EST-STS标记构建了1AS上的遗传连锁群。一共发现了3个QTL簇，并且将区间定位在Agc7155和SSR263之间（图5）。发现有一个QTL集群与增加穗长相关，这也解释了LOD值为4.89，12.38%表型方差。第二个QTL集群解释了24.96%的千粒重表型方差，LOD

18、值为10.63。第三个QTL同小穗密度性状相关联，其上有个异源基因能降低穗密度。这解释了17.2%表型方差，LOD值为5.59（表4）。总的来说QTL作图的结果更深层次的说明了6p异源的染色体片段中含有对提高产量和增加穗长方面重要的基因。图5：通过(tnggu)QTL作图发现(fxin)异源的冰草6p易位片段对于不同(b tn)性状的遗传影响。微卫星标记和冰草EST-STS标记的连锁图用来对F2群体进行QTL分析。猜测的QTL集群展示在右侧。TGW表示千粒重，SL表示穗长，SD代表穗密度。讨论：小麦-冰草6p中间插入型易位系Pubing3035一个有价值的，片段小的易位系。野生的近亲品种对于小

19、麦的改良是一个丰富的遗传资源库。通过远缘杂交将小麦的野生近亲种中的的基因导入到普通小麦中从而来提高小麦遗传多样性，这是一个基本途径。染色体工程在目标外源基因的渐渗方面的成功的关键在于消除了在作物中渐渗片段所带来的不利影响。然而从一个基因组中将有利的基因转移到另一个非同源的基因组之中也是一个难点。通过异源基因的渐渗来获得有育种价值的材料本身就比较困难。比如，从57个自发或者诱导产生的小麦异源染色体易位系中也仅仅只在发现了两个中间插入型的易位系。通常来讲，含有越小外源片段的易位系在遗传上是更加稳定的并且出现不良影响的可能性也更加低。许多研究人员曾经都探索过大量的方案来创建具有更小不利影响的小的片段

20、易位系，他们使用辐射的方法和Ph1系统，如改良过的染色体工程方法，它能够有效的消除山羊草染色质周围大量的Sr39，再如一个简化的簇毛麦，它包含有抗白粉病Pm21位点的染色质，还有小麦-黑麦的末端和中间插入型染色体易位系的创建。在我们的研究中，鉴定了Pubing3035是一个中间插入型的易位系而且它能增加千粒重和穗长，重要的是它没有带来不利影响。虽然Pubing3035易位系出现在小麦染色体1AS和冰草染色体6PL之间，但是在遗传上它很可能是稳定的。Pubing3035含有小的冰草6p片段不含有小麦1A染色质的丢失。稳定的遗传特征和表型数据表明Pubing3035不会带来明显有害的性状特征（表2

21、）。而且前人的研究也表明在进化的过程中冰草6p染色体发生了遗传重排。类似的，染色体重排也发生在小麦-簇毛麦和小麦-大赖草的易位系中。因此可以推测，在Pubing3035中的6p染色体插入片段可能存在一个对小麦1AS部分补偿效应。在将来新技术将会揭示在小麦1As染色体中的6p片段的序列共线性关系。而且，已经有证明来自于小麦野生近缘物种中的许多有价值的基因同第六号部分同源染色体组有关。6VS/6AL易位系已经被创建，并且它具有抗白粉病的基因Pm21。Du等人验证了wheat-Ps. HuashanicaKeng6Ns双体异附加系拥有成对的小穗、多个小花以及籽粒。Xie等人报道过抗白粉病基因PmG3

22、 M被定位在野生二粒小麦的6BL染色体上。我们的研究结果表明6p染色体片段也拥有让人惊喜的农艺性状，更大的千粒重和更长的穗长，而且(r qi)Pubing3035是一个有价值的小的片段易位系。我们研究的结论对更进一步研究基因挖掘(wju)方面奠定了基础。6p染色体片段(pin dun)的渐渗能够提高小麦的千粒重：千粒重在一些粮食作物中是一个重要的指标。然而许多不利的气候原因给千粒重带来了不良影响，近些年明显影响了小麦的产量。因此，寻找能够提高产量的新的遗传资源库已迫在眉睫。水稻中，许多基因包括GS3，GW2和GIF1已经被验证同产量相关。在小麦中水稻OsGW2基因的直系同源基因TaGW2也被视

23、作为同产量相关的候选基因。单体型Hap-6A-A在TaGW2-6A启动子区域形成，并且很大程度上同更高的千粒重相关。Hou等人报道过在小麦高产育种中与千粒重相关的胚乳淀粉的合成路径是一个间接选择的主要的目标。在小麦近缘物种中，带有与千粒重相关的QTL1RS染色体能够显著的提高千粒重，穗长和穗宽。而且，已经证明6VS/6AL易位系在增加千粒重和穗长方面有着积极的作用。本研究中包含冰草6p片段的中间插入型易位系Pubing3035拥有比普通小麦更高的千粒重。此外，从F2和BC1F1群体中进行的遗传分析表明Pubing3035对于提高穗重方面有着显著的积极作用。增加的千粒重意味着Pubing3035能够成为一个提高小麦产量重要的材料。中间型易位系展现出潜在的提高麦穗产量的应用价值：像其他作物一样，麦穗是小麦谷物的产出部位，因此他们同产量相关。而且在出头后，麦穗参与了光合作用，他们显著的促进了灌浆的进行，尤其是在干旱条件下。因此有许多研究都把注意力集中在穗形态上，它主要由长度，小穗密度和小花发育