遗传性疾病的分子诊断 (2)ppt课件

1、DNAmRNA蛋白质转录反转录 翻译 核酸的分子杂交 基因构造异常基 因 表 达 异 常PCR DNA测序 Nothern-blot 实时荧光定量PCR 反转录PCR 蛋白质芯片 ELISA 蛋白组织化学染色 Western-blot 基因芯片 基因诊断的技术和方法遗传性疾病分子诊断 严永敏 根底医学与医学技术学院遗传性疾病诊断战略 1. 点突变的诊断 方法有等位基因特异性寡核苷酸杂交ASO、PCRELISA、等位基因特异性扩增ASA、PCRRFLP、基因芯片技术进展诊断； 对于一些基因背景未知的点突变，可以采用单链构象多态性SSCP、变性梯度凝胶电泳DEEG、异源双链分析HA、DNA序列测定

2、、蛋白截短测试等方法。 一、限制性内切酶法RE法 导致某一限制酶识别位点移位的大片段缺失或插入， 导致某一限制酶识别位点丧失或获得的点突变， 均可引起相应限制性片段的长度和数量发生变化。 分析限制性酶切图，即可诊断出此类突变。Mst酶切位点(GCTNAGG)53正常基因53突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析二、ASO探针杂交受检者基因组DNA或含突变位点的PCR扩增产物与标志的ASO 探针杂交主要适用于检测知点突变ASO1ASO2NormalHeteroHomo

3、PCR-SSCP 2.片段性突变的检测 片段性突变是指DNA分子中较大范围的碱基发生突变，如碱基的缺失、插入、扩增和重组。对于少数核苷酸缺失或插入，可以采用检测点突变的方法，而对于大的片段突变，那么运用Southern印迹技术和多重PCR技术。 杜氏和贝氏肌营养不良症的基因诊断 多重PCR检测患者缺失凝胶电泳图9对引物P1 除外显子1 外其他均缺失； P2 外显子819 有小的缺失；P3 外显子44-50 缺失； P4 外显子4552 有小的缺失；B1 空白对照；C1、C2 正常对照。遗传性疾病诊断战略 DNA多态DNA Polymorphism： 群体中每个个体DNA区域中等位基因或片段存在

4、两种或两种以上的方式，对基因功能没有影响，称DNA多态。 它经过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标志。 将与致病基因连锁的某种多态性标志作为遗传标志，在同一个家系成员中探查能否存在致病基因的方法即为基因连锁分析法。 基因连锁分析常用的遗传性多态性标志有3类：1RFLP： 称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标志；2反复序列多态性VNTR： 如短串联反复序列STR，为第二代多态性标志；3单核苷酸多态性SNP DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标志。1 Southern blot-RFLP诊断(PKU)间接基因诊断 PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb

5、 两种等位片段，以PAH cDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交。患者为19kb片段的纯合子,阐明患者缺陷的PAH 基因与19kb片段连锁其父、母亲缺陷的PAH基因与19kb片段连锁， 其23kb片段与正常PAH基因连锁。II2为23kb 和19kb片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者。间接基因诊断数目变异串联反复variable number tandem repeats, VNTR反复序列以各自的中心序列反复单元，首尾相连多次反复，称为串联反复序列，其反复次数在人群中存在变异，构成多态即 VNTR。散在分布于染色体上。反复单位625bp长，称为小卫星DNA。反复单位26bp长，

6、如TAn, (CGG)n等，称为微卫星DNA，又称短串联反复序列(STR) 。VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联反复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。DNA多态可以经过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态amplified fragment length polymorphism, Amp-FLPVNTR 酶切，电泳后的检测结果大小PCR-VNTR检测PCR-VNTR成年型多囊肾病的诊断例：成年型多囊肾病APKD，AD ，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。APKDGene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化

7、性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证明APKD Gene与珠蛋白基因3端附近的一段小卫星DNA序列3HVR严密连锁，因此，可以经过VNTR连锁分析进展诊断。间接基因诊断 以3HVR为探针，与PvuII酶切后的家系有关成员的基因组DNA进展Southern Blot 基因组DNAPvuII酶切DNA片段变性转膜探针变性杂交结果分析间接基因诊断 1 2 1 2 3 4 5 5.7kb 3.4kb 2.3kb 间接基因诊断结果分析 患者I1、II1和II2有3.4kb片段，阐明致病基因与3.4kb片段连锁，并按孟德尔方式遗传。II5不含3.4kb片段，产前诊断正常。间接基因诊断单核苷酸多态Singl

8、e Nucleiotide Polymorphism， SNPSNP：发生在基因组中的单个核苷酸的替代根据SNP在基因中的位置，分为： 基因编码区SNP 基因周边SNP 基因间SNP在人类基因组中每100300个核苷酸就有一个SNP 遗传性疾病的主要分子机理是基因突变，因此是基因诊断的最正确顺应症。基因诊断在遗传性疾病中的运用 血红蛋白病 最早胜利进展产前基因诊断可分为两大类： 异常血红蛋白病abnormal hemoglobin syndrome 地中海贫血thalassemia一、 遗传性疾病 1异常血红蛋白病珠蛋白基因突变单硷基替代、缺失或插入等 镰状细胞贫血： b-珠蛋白基因第6位密码

9、子GAGGTG (E6V) 该突变使限制酶MstII位点消逝(CCTGAGGCCTGTGG) 诊断方法： 限制性酶切图谱直接分析法 (基因组DNA或PCR产物) ASO 斑点印迹杂交分析法 (ASO = 等位基因特异性寡核苷酸探针)Mst酶切位点(GCTNAGG)53正常基因53突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 b-珠蛋白基因点突变 GAG(Glu)-GTG(Val) bA probe ACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC bS probe ACTCCT

10、GTGGAGAAGTCTGCCHeterobA probebS probeHomoNormal a-地中海贫血： 不同数量(1-4个)a-珠蛋白基因缺失或点突变等 a a 14kbBamHI BamHI aa/aa aa/- aa/a- a-/- -/- 10kb 14kb 10kb a 2地中海贫血 珠蛋白基因缺失或基因中某些硷基替代 影响a-或b-珠蛋白链的合成速率 a-或b-地贫诊断方法：PCR、酶切图谱法、PCR-ARMS、PCR-ASOb-地中海贫血 主要是b-珠蛋白基因点突变。 突变常不涉及限制酶识别位点 不能用限制性酶切图谱进展直接分析。诊断方法： RFLP连锁分析 间接检测病变基因 ASO 斑点印迹杂交分析 直接检测病变基因点突变 DNA芯片包括各种基因突变位点的一切探针 可快速、简便地检出一切知突变 甲型血友病血友病A 凝血因子VIIIF VIII缺乏所致， 发病的分子机制是F VIII基因突变，主要为点突变或少数硷基 的缺失和插入以及第22内含子的大片段倒位。 乙型血友病血友病B 原因于凝血因子IX的缺乏 其分子机制是分布于整个基因各处的多种方式的突变。 诊断方法：PCR/ASO直接检测法点突变 PCR/RFLP连