《生物化学》本科课件第4章+蛋白质的共价结构

1、Protein第章 蛋白质的共价结构蛋白质 （Protein）“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。” 恩格斯反杜林论 1878年1838年，J. J. Berzelius提出，由proteios衍生而来， 第一重要，首要的物质蛋白质存在于所有生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，参与了几乎所有的生命活动过程。一、蛋白质通论（一）、蛋白质的化学组成和分类、元素组成蛋白质是一类含氮有机化合物 、蛋白质的含氮量蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分。大多数蛋白质含氮量接近于16% 蛋白质含量 = 每克样

2、品中含氮的克数6.25凯氏定氮法三聚氰胺含氮量：66.7%含氮量是蛋白质的4.16倍。、蛋白质的分类（1）、依据外形分类球状蛋白质：globular protein 外形接近球形或椭圆形，溶解性较好纤维状蛋白质：fibrous protein 形似纤维或细棒，分可溶性/不溶性两种膜蛋白质：membrane protein 亲水性残基少于胞质蛋白（2）、依据蛋白质的组成分类单纯蛋白 simple protein 单纯蛋白，仅由氨基酸组成缀合蛋白 conjugated protein由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成单纯蛋白清蛋白和球蛋白 albumin and globulin 广泛存在于动物组

3、织谷蛋白和醇溶谷蛋白 glutelin and prolamin 植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/碱鱼精蛋白和组蛋白 碱性蛋白存在于细胞核硬蛋白 存在于软骨、腱、毛发、丝等组织中， 分为角/胶原/弹性/和丝蛋白等缀合蛋白糖蛋白：简单蛋白+糖类物质脂蛋白：简单蛋白+脂类结合核蛋白：简单蛋白+核酸磷蛋白：含与Ser,Thr和Tyr残基的羟基酯化的磷酸基。金属蛋白：含有金属离子的蛋白质血红素蛋白：金属蛋白的一个亚类；辅基为血红素，是卟啉化合物。黄素蛋白：含黄素，辅基为FMN和FAD。（3）蛋白质按生物学功能分类酶：如核糖核酸酶，胰蛋白酶等调节因子：如胰岛素、促生长素、促甲状腺素等转运蛋白：如血红蛋白

4、、血清清蛋白、和葡糖转运蛋白贮存蛋白：如卵清蛋白、酪蛋白、菜豆蛋白和铁蛋白收缩和游动蛋白：肌动蛋白、肌球蛋白、动力蛋白结构蛋白：角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白和蛋白聚糖支架蛋白：如胰岛素受体底物-1、A激酶锚定蛋白和信号传递转录激活剂保护和开发蛋白：如免疫球蛋白、凝血酶、血纤蛋白原、抗冻蛋白、蛇和蜂毒蛋白、白喉毒素等异常蛋白：如应乐果甜蛋白、节肢弹性蛋白和胶质蛋白（二）、蛋白质的大小与分子量蛋白质是分子量很大的生物分子对任一种给定的蛋白质，其所有分子在AA组成和顺序以及肽链的长度方面都应是相同的，即所谓均一的蛋白质。人为规定Pr分子量上下限下限一般认为从胰岛素开始，其相对分子量为5700（

5、51个氨基酸残基）某些Pr由两至多个亚基经 非共价结合而成（寡聚蛋白）分子量高达数百/千万。如谷酰胺合成酶（12个亚基组成），如烟草花叶病毒（2130个亚基和一条RNA链构成。蛋白质与多肽无严格的界线 通常将6000Dr以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大蛋白质月示胨多肽肽AA 1*104 5*103 2*103 1000 200 100 -500对于不含辅基的单纯蛋白质，相对分子量/110aa残基数20种aa的平均分子量约为138，较小的氨基酸占优势，因此平均分子质量为128。形成一个肽键失去一分子水（分子量18），aa残基的平均分子量为110。100个氨基酸残基的蛋白质，分子量约

6、为多少？（三）、蛋白质构象和结构的组织层次蛋白质的结构层次一级结构二级结构三级结构四级结构高级结构空间构象蛋白质的各级结构的基本概念一级（1o）结构：肽链中的氨基酸排列顺序。二级（2o）结构：多肽链借助氢键排列成自己特有的a螺旋和b折叠股片段。三级（3o）结构：多肽链借助各种非共价键（非共价力）弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。四级（4o）结构：寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。一个蛋白质分子为获得复杂结构所需的全部信息都含于1o结构即多肽链的氨基酸序列中示例肌红蛋白的三级结构和丙酮磷酸异构酶的三级结构血红蛋白四级结构（四）、蛋白质功能的多样性1. 催化功能-酶2. 调

7、节功能-激素、基因调控因子3. 转运功能-膜转运蛋白、血红/血清蛋白4. 贮存功能-乳、蛋、谷蛋白5. 运动功能-鞭毛、肌肉蛋白6. 结构成分-皮、毛、骨、牙、细胞骨架7. 支架作用-接头蛋白8. 防御功能-免疫球蛋白9. 异常功能生老病死，万物轮回(蛋白质层次)生（诞生、生长）：在酶催化下老细胞 计划性凋亡和新细胞的再生（新陈代谢）、活细胞的代谢老？蛋白质功能普遍衰退(?) 病个别蛋白质的功能障碍死？蛋白质功能的全部停止/分解 蛋白质生物功能分子单细胞生物胞外酶鞭毛-蛋白质（运动器官）细胞壁-糖、脂、肽细胞膜-载运蛋白、膜蛋白细胞质-酶蛋白（催化物质代谢）细胞核-酶蛋白（遗传）多细胞动物个体

8、层次毛发、皮肤 -角蛋白骨骼、牙齿 -钙+胶原蛋白肌肉 -肌球蛋白/肌丝蛋白二、肽（peptide）AA-NH2与另一AA-COOH间失水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽。由两个AA组成的肽称为二肽。含几个至十几个AA的肽链称为寡肽由20个AA以上组成的肽则称为多肽。组成多肽的AA单元称为氨基酸残基。多肽链中AA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序含游离-氨基的一端：氨基端或N-端 含游离-羧基的一端：羧基端或C-端AA顺序是从N-端开始以C-端氨基酸残基为终点 如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln反过来写的是一个不同的肽肽键是aa间的基本连接方式。证据：、Pr中游离氨基和羧基很

9、少。、人工合成的多肽能被蛋白酶水解。、Pr能发生双缩脲反应（紫红色或蓝紫色）、人工合成的多聚aa的射线衍射图案和红外吸收光谱与天然的纤维状蛋白质十分相似。、我国首次人工合成结晶牛胰岛素。（一）、肽和肽键的结构肽键的特点是：N上孤对电子与羰基有明显的共轭作用。肽键中C-N键有部分 双键性质 不能自由旋转组成肽键原子处于 同一平面（肽平面）键长及键角一定大多数情况以反式 结构存在共价主链 （二）、肽的物理化学性质离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。肽末端-羧基pKa值比游离AA中的大。 肽末端-氨基pKa值比游离AA中的小。酸碱性质取决于： -羧基、-氨基、侧链基团的解离等电点，静电荷为零时溶液的

10、pH值。肽的化学反应也和AA一样，游离的-羧基、-氨基、侧链基团可以发生类似AA的反应，如茚三酮反应。具有双缩脲反应肽特有的反应。（紫红色或蓝紫色）（三）、 天然存在的活性肽生物体中多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位；有许多分子量比较小的寡（多）肽以游离状态存在，这类肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽、激素类多肽、抗生素类多肽、 谷胱甘肽、蛇毒多肽等 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽 L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn

11、 L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽) 由细菌分泌，含有D-AA和一些不常见AA，如鸟氨酸（Ornithine, Orn）。 鹅膏覃碱是一种环状八肽，真核生物RNA聚合酶II的抑制剂（能与RNA聚合酶紧紧结合）三、蛋白质一级结构的测定蛋白质AA顺序测定是蛋白质化学研究的基础1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构现已有成千上万种不同蛋白质的一级结构被测定。 什么是Pr的一级结构？蛋白质中氨基酸的排列顺序。1.样品必需纯（97%以上）2.知道蛋白质的分子量3.知道蛋白质由几个亚基组成4.测定蛋白质的AA组成并根据分子量 计算每种AA的个数5.测定水解液中的

12、氨量计算酰胺的含量蛋白质测序前提（一）、蛋白质测序策略(1) 测定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。蛋白质一级结构的测定（一）、蛋白质测序策略(2) 多肽链的拆分蛋白质一级结构的测定（一）、蛋白质测序策略几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。蛋白质一级结构的测定（一）、蛋白质测序策略(3) 断开二硫键在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生

13、成的巯基，防止重新被氧化。蛋白质一级结构的测定巯基（-SH）的保护（一）、蛋白质测序策略蛋白质一级结构的测定(4)测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比部分样品进行完全水解，测定氨基酸组成（一）、蛋白质测序策略(5)分析多肽链的N-末端和C-末端(6)多肽链断裂成多个肽段采用两/多种不同的断裂方法将多肽 断裂成两套或多套肽段，并将其分离。蛋白质一级结构的测定（一）、蛋白质测序策略(7)测定每个肽段的氨基酸顺序蛋白质一级结构的测定(8)确定肽段在多肽链中的次序 利用两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。(9)确定原多肽链中二硫键的位置。（一）、蛋白质测序

14、策略蛋白质一级结构的测定胃蛋白酶水解两类多肽链末端氨基酸残基： N-端氨基酸 C-端氨基酸在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。（二）、末端氨基酸残基测定Sanger法1、 末端分析 二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2+ H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸（二）、末端氨基酸残基的鉴定N碱性条件二硝基苯衍生物黄色二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高 丹磺酰氯（DNS）法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、 末端分析1N碱性条件(DNS-aa)苯异硫氰酸酯（PITC)法（二）、

15、末端氨基酸残基的鉴定、 末端分析1NN=C=S + NCH CONHCHHR1PITCNCNCHCONHCHHRSPTC-多肽NCHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3无水HF苯异硫氰酸酯PITCR2多肽+NCH CONHCHHR2R3少一个氨基酸的多肽肽链外切酶:从多肽链N-端逐个向里水解根据不同反应时间测出释放的AA种类和数量， 按反应时间和AA残基释放量作动力学曲线 蛋白质N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 水解以Leu残基为N-末端的肽键速度最大。氨肽酶法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、 末端分析1N氨基酸酰肼可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质。上清中的氨基酸可通过其他方法鉴定

16、肼解法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、 末端分析2C1n-1（二）、末端氨基酸残基的鉴定、 末端分析2C C末端AA 氨基醇 水解肽链，鉴定氨基醇 还原法硼氢化锂肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解根据不同反应时间释放出的AA种类和数量 蛋白质C-末端残基顺序。四种羧肽酶：A,B,C和Y； A和B(胰脏)、C(柑桔叶)、Y(面包酵母)A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基 B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键 Y：可作用于任何一个C-末端残基的肽键羧肽酶法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、 末端分析2C（三）、二硫键的断裂盐酸胍/尿素解离多肽链间的非共价力。应用过甲酸氧化法或巯基

17、还原法拆分多肽链间的二硫键。1、酸水解常用6M盐酸或4M硫酸优点：水解产物不消旋缺点：Trp被沸酸完全破坏 含羟基Ser、Thr、Tyr部分分解 Asn、Gln酰胺基被水解（四）、氨基酸组成的分析2、碱水解一般用5M氢氧化钠缺点：许多AA受到不同程度的破坏 部分水解产物发生消旋化优点：Trp不受破坏（四）、氨基酸组成的分析1、酶解法:内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽链的选择性降解 （五）、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化目前序列分析方法最长只能几十个残基，因此需要裂解多肽，然后分离纯化。R1=Lys（K）或Arg（R）专一性较强，水解速度快

18、R2=Pro（抑制）肽链水解位点胰蛋白酶trypsin减少断裂点： 保护Lys侧链-NH2或修饰Arg胍基增加断裂点： 将Cys变为类似Lys的结构R1=Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AALeu、Met和His稍慢R2=Pro（抑制） pH8-9肽链水解位点糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度与相邻AA性质有关: 酸性：-/碱性：+R2=Phe（F）、 Trp（W）、 Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快肽链水解位点R2= Pro或Gly，不水解R1或R3=Pro，抑制水解嗜热菌蛋白酶（th

19、ermolysin)R1和/或R2Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、 Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快 R1=Pro（抑制）pH2肽链水解位点胃蛋白酶Pepsin肽链水解位点羧肽酶和氨肽酶2、化学裂解法 溴化氰水解法(Cyanogen bromide)选择性地切割由Met羧基形成的肽键。（五）、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化多肽链的选择性降解 NH2OH断裂： 较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键 Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂 3、肽段的分离纯化： 凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法N-端分析法特点：能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解

20、离。1、 Edman法（六）、肽段氨基酸序列的测定（苯异硫氰酸酯法）Edman于1950年首先提出。无水氨基非质子化PITCPTC-肽2、氨肽酶法或羧肽酶法3、质谱法（MS） 灵敏度高、所需样品少、测定速度快核糖体蛋白质链4.根据核苷酸序列的推定法根据核苷酸序列的推定法：（1）用待测的蛋白质作抗原免疫动物 抗体（2）分离多核糖体（3）抗体沉淀此种蛋白质多核糖体（4）分离该蛋白质的模板mRNA，（5）反转录成cDNA（6）根据测定cDNA序列推测蛋白质的AA序列。 注意：必须知道蛋白质N-末端和C-末端氨基酸残基（七）、肽段在多肽链中次序的决定重叠肽（overlaping peptide）胃蛋白

21、酶处理没有断开二硫键的多肽链经电泳分离各肽段用过甲酸断开二硫键，含有-S-S-的肽段带电性质发生变化，转向90二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置（八）、二硫键位置的确定胃蛋白酶最适pH约2，此时二硫键不断开专一性低、肽段短（九）、蛋白质测序举例（十）蛋白质序列数据库 www.ncbi. nlm. 同源蛋白质：来自不同生物体、 执行同一 /相似功能的蛋白质 同种蛋白质：来自相同生物体、 执行同一功能的蛋白质 同源蛋白质的AA序列具有明显的相似性 序列同源性（sequence homology） 不变残基/可变残基1、同源蛋白质四、蛋白质的A

22、A序列与生物功能（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化 一百多个AA残基 MW约12.5103 2 8个不变残基 序列间AA差异数与物种间系统发生差异成比例；进化位置上相差愈远，AA序列之间的差别愈大。 细胞色素C的AA序列差异可用于核对各物种间的分类学关系以及绘制系统树/进化树。2、细胞色素C与系统树invariant residues (yellow) conservative substitutions (blue)nonconservative or variable residues (unshaded)Conservation and variation of cytochrome

23、c sequences 序列同源关系表明随机突变导致一级 结构方面AA取代/趋异事件的进化顺序。1、氧合血红蛋白（二）同源蛋白质具有共同的进化起源该酶类活性中心的Ser残基起关键作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、 凝血酶和纤溶酶有序列同源性对底物偏爱不同2、丝氨酸蛋白酶类卵清中的溶菌酶（lysozyme）- 乳清蛋白（lactalbumin）三级结构很相似 也可能具有共同的祖先。3、一些功能差异很大的蛋白质（三）血液凝固与AA序列的局部断裂 凝血酶原血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纤蛋白原转变为不溶性的血纤蛋白网。可溶性的血纤蛋白原酶有活性的凝血酶不溶性的血纤蛋白网（一）肽的人工

24、合成 保护（氨基、羧基、侧链活性基团） 活化（氨基、羧基） 缩合剂 （二）胰岛素的人工合成（三）固相肽合成五、肽与蛋白质的人工合成树脂挂接1.有一多肽经酸水解后产生等摩尔的Lys，Gly和A1a.如用胰蛋白酶水解该肽，仅发现有游离的Gly和一种二肽。下列多肽的一级结构中，哪一个符合该肽的结构? A.Gly-Lys-Ala-Lys-Gly-Ala B.Ala-Lys-Gly C.Lys-Gly-Ala D.Gly-Lys-Ala E.Ala-Gly-Lys2.测定小肽氨基酸顺序的最好方法是 A.2，4-二硝基氟苯法(FDNB法) B.二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-Cl法) C.氨肽酶法 D.苯异硫

25、氰酸法(PITC法) E.羧肽酶法选择题 3.用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键? A.双缩脲反应 B.克氏定氮 C.紫外吸收 D.茚三酮反应 E.奈氏试剂4.下列关于蛋白质中L-氨基酸之间形成的肽键的叙述，哪些是正确的? (1).具有部分双键的性质 (2).比通常的C-N单键短 (3).通常有一个反式构型 (4).能自由旋转 A.1,2,3 B.1,3 C.2,4 D.4 E.1,2,3,41 珠蛋白也是球蛋白2 用羧肽酶A水解一个肽，发现从量上看释放最快的是Leu，其次是Gly，据此可断定，此肽的C端序列是gly-leu3 等电点不是蛋白质的特征参数4 催产素和加压素只有三

26、个氨基酸地残基不同5 胰蛋白酶专一地切在多肽链中碱基氨基酸的N端位置上6 溴化氰能作用于多肽链中的甲硫氨酸键7 在蛋白质和多肽分子中，连接氨基酸残基的共价键除肽键外，还有就是二硫键二、是非题（）（）（）（）（）（）（）1 胰凝乳蛋白酶专一性的切断 和 的羧基端肽键2 胰岛素的分子量大约是 3 一条肽链；AsnHisLysAspPheGluIleArgGluTyrGlyArg经胰蛋白酶水解，可得到 个肽4 肽经溴化氰（CNBr）处理后，在 残基右侧的肽键被裂解，裂解后该残基变成 5 继Sanger之后， 与 二人共同建立了蛋白质一级结构的测定技术获得了诺贝尔奖6 胰蛋白酶的专一性就是在 残基右侧的肽键上水解填空题7 胰岛素是 分泌的多肽激素，是由前胰岛素原经专一性蛋白水解，失去N端的 成为 。再经肽酶激活失去 ）肽，最后形成具有生物活性的胰