Arg9人抗HBsAg单链抗体 EGFP融合蛋白基因的构建、表达及活性分

1、Arg9/人抗HBsAg单链抗体/ EGFP交融卵白基因的构建、表达及活性分薛茜，温伟红，孟艳玲，张勇，张巍，王涛，张瑞，杨安钢【关键词】肝炎,乙型；肝炎外貌抗原,乙型；SFv；Arg9【Keyrds】hepatitisB;hepatitisBsurfaeantigens;SFv;Arg9【摘要】目的：构建带有转膜布局域Arg9编码序列的R9/SFv14/EGFP交融基因，将其转化入大肠杆菌中举行表达，并阐发表达产物与HBsAg的结合活性.要领：方案引物，将Arg9的编码序列引入单链抗体基因的5端，PR扩增后得到带有Arg9编码序列的SFv14基因，将PR产物连入pD18T载体，举行序列测定.

2、将测序准确的SFv14基因和R9/SFv14基因别离与EGFP基因毗连后转化入原核表达载体pET32a，得到SFv14/EGFP和R9/SFv14/EGFP两种交融基因的表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS，以IPTG诱导表达，对表达产物举行SDSPAGE阐发，并用间接ELISA要领检测其与HBsAg的亲和活性.结果：经酶切断定及测序证明SFv14/EGFP交融基因和R9/SFv14/EGFP交融基因序列完全准确.SDSPAGE阐发表白两种交融基因在大肠杆菌BL21中乐成得到表达，表达量别离占菌体总卵白的20%和25%.间接ELISA检测证明所表达的SFv14/EGFP交融卵白和R

3、9/SFv14/EGFP交融卵白均具有HBsAg结合活性.结论：乐成构建了带有转膜布局域Arg9编码序列的R9/SFv14/EGFP交融基因，并在大肠杆菌BL21中乐成表达，表达产物SFv14/EGFP和R9/SFv14/EGFP均具有与抗原HBsAg特异性结合的活性.【关键词】肝炎，乙型；肝炎外貌抗原，乙型；SFv；Arg90弁言1质料和要领1.2要领14F5TTTGAATTATGGAGGTGAGTGGTGGAGT3；14R9F5TTTGAATTATGAGAGAGGAGAGAGGGGAGAGGGAGGTGAGTGGTGGAGT3；L35TTTGGATTGATTGATTTATTGGT3.此中划

4、线部门为九聚精氨酸的编码序列.2结果2.1目的基因扩增和酶切断定PR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳证明别离扩增出巨细约为750bp和780bp的条带(图1A).测序结果证明扩增的SFv14和R9/SFv14基因完全准确.用ER和BaH双酶切断定，得到巨细约为750bp和780bp的条带，与预期长度符合图1B.2.2原核表达载体的酶切断定重组载体pET32aSFv14/EGFP和pET32aR9/SFv14/EGFP用限定性内切酶ER和BaH双酶切SFv14和R9/SFv14基因，别离得到巨细约为750bp和780bp的条带；用ER和Nt双酶切交融卵白基因，别离得到巨细约为1490bp和1520

5、bp的条带,与预期长度符合图2.2.3重组交融卵白表达的断定和阐发SDSPAGE阐发表现，与未诱导菌比拟，两种诱导菌在r约为73ku处均有一特异性卵白条带，同预期的巨细符合.经凝胶成像体系扫描表现，它们的表达量别离约占菌体总卵白的20%和25%图3.取IPTG诱导后的菌液举行超声裂解，别离取其裂解上清和沉淀举行SDSPAGE阐发，电泳结果表现两种目的卵白均重要存在于诱导菌的裂解上清中图4.2.4重组交融卵白的esternblt阐发在r约为73ku处有一特异性卵白条带(图5)，与SDSPAGE阐发结果符合，说明该诱导卵白为目的卵白.2.5交融卵白亲和活性的ELISA检测间接ELISA检测结果表现

6、表达的两种SFv14/EGFP交融卵白均能与HBsAg抗原特异性结合(图6),二者比拟，R9/SFv14/EGFP与HBsAg的亲和力稍大于SFv14/EGFP与HBsAg，但不具有统计学意义P0.05.2，4:未诱导的pET32a和pET32aR9/SFv14/EGFP的全菌卵白质；3，5：IPTG诱导的pET32a和pET32aR9/SFv14/EGFP的全菌卵白质.B1:arker；2，4:未诱导的pET32a和pET32aSFv14/EGFP的全菌卵白质；3，5：IPTG诱导的pET32a和pET32aSFv14/EGFP的全菌卵白质.3讨论自然Fv片断中VH和VL为非共价性结合，是抗

7、体分子中保存抗原结合部位的最小成效片断.将VH和VL用一个小肽(linker)毗连起来，即单链抗体.单链抗体易与效应分子相连，与其他卵白交融，可得到具有多种生物学成效的交融卵白.比年来，以单链抗体为导向物的免疫交融卵白在抗肿瘤、抗病毒等的治疗和诊断方面显现了辽阔的远景，引起了人们的普及存眷.由单链抗体与毒素、酶、细胞因子等的基因相连的免疫交融卵白，可以结合到特定的靶部位，高效的发挥生物学成效6-7.卵白转膜布局域PTDs是一类可以或许介导与之交融的卵白内化入细胞的短肽.它们作为内化的东西被普及应用，它不但可以使多肽、多聚核苷酸、微小微粒进入细胞，乃至可以在体内介导卵白质的内化8.Futaki等

8、9创造多种富含精氨酸的肽都具有转膜作用.在比力了差异长度的多聚精氨酸对内化服从的影响之后，他们创造八聚精氨酸Arg8的内化结果最好.ender等10创造Arg9具有更高效的内化作用.我们接纳转膜布局域Arg9来加强交融卵白的转膜成效，以期使产物具有更高的内化服从.【参考文献】1KasuyaK,ByerJL,TanY,etal.PassiveiuntherapyfranthraxtxinediatedbyanadenvirusexpressinganantiprtetiveantigensinglehainantibdyJ.lTher,2022,11(2):237-244.2NeveR,Niel

9、senUB,KirptinDB,etal.BilgialeffetsfantiErbB2singlehainantibdiesseletedfrinternalizingfuntinJ.BiheBiphysResun,2001,280(1):274-279.3RsanaB,ihel,Julesattes.IntraellularauulatinftheantiD20antibdy1F5inBlyphaellsJ.linanerRes,2002,8(8):2701-2713.4HeaD,YangbH,LinaQ,etal.Arg9peptidefailitatestheinternalizati

10、nfanantiEAiuntxinandptentiatesitsspeifiyttxiityttargetellsJ.IntJBiheellBil,2022,37(1):192-205.5enH,ZhaJ,YuJ,etal.nstrutinfsinglehainFvGenefAntiHBsAganditsexpressininS7ellsJ.hinJelllIunl,2022,192:163-167.6ShnellR,VitettaE,ShindlerJ,etal.TreatentfrefratryHdgkinslyphapatientsithanantiD25riinAhainiuntxi

11、nJ.Leukeia,2000,14(13):129-135.7DrninaS,TkiBE,TrgvY,etal.DevelpentfptentnlnalantibdyauristatinnjugatesfranertherapyJ.NatBitehnl,2022,21(7):778-784.8aiJ,ShenH,atkinsS,etal.EffiienyfprtEintransdutiniselltypedependentandisenhanedbydextransulfateJ.JBilhe,2002,277(33):30208-30218.9FutakiS,SuzukiT,hashi,etal.ArgininerihpeptidesAnabundantsurefebranepereablepeptideshavingptentialasarriersfrintraellularprteindeliveryJ.JBilhe,2001,276(8):5