基因重组及遗传分析ppt课件

1、第五章 细菌基因重组及遗传分析基因重组gene recombination是指不同来源的遗传物质经过转移和交换而重新组合的过程。高等动植物和许多产生有性孢子的真核微生物的基因重组都是经过有性世代来完成。在细菌中，提供部分遗传物质或少数基因的一方称为供体donor，而获得基因的另一方称为受体recipient。第一节 转化Transformation转化：是指某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型细胞的DNA而使受体的基因型和表型发生相应变化的景象。转化景象的发现和转化因子的证明对促进现代分子生物学的诞生和开展产生了宏大的推进作用。 在实验室条件下，通常用CaCl2、cAMP、低温培育、

2、PEG介导及电脉冲等方法转化细菌或其它微生物。细菌转化的过程大体可分为三个阶段：感受态的出现DNA的吸附和进入DNA的整合感受态的出现 感受态competence：是指受体菌细胞最容易接受外源DNA并使之不被DNA酶降解的生理形状。一、转化过程和机制 细菌细胞在特定时期产生一种称为感受态因子的小分子蛋白5-10 kD。这种感受态因子可与细胞外表受体蛋白结合，使细胞产生感受态特异蛋白，其中包括细胞壁自溶素。自溶素使细胞外表的DNA结合蛋白及核酸酶裸显露来，使其具有与DNA结合的活性。因此，当细菌外表出现许多DNA结合位点时，就意味着细菌出现了感受态。 4. 进入细胞的单链与寄主DNA同源区重组并

3、整合到染色体上革兰氏阳性菌1. 双链DNA片段在DNA结合蛋白黑色点的协助下吸附到细胞外表并由核酸酶紫色椭圆切成缺口2. 由核酸酶降解其中一条单链3. 未被降解的单链与感受态特异蛋白相互作用并进入细胞DNA的吸附和进入 在流感嗜血菌中，其感受态细胞构成一种结合双链DNA的膜构造，称为转化小体transformasome。该小体吸附DNA后，与细胞的内外膜相交融而转入细胞内侧，再将双链变成单链DNA。 转化小体双链DNA被转化小体摄取转化的双链DNA30-50kb结合到膜受体上很快进展同源重组使外源DNA整合到染色体上革兰氏阴性菌DNA在进入感受态细胞之前，要经过可逆性吸附和不可逆性吸附。可逆吸

4、附的DNA对DNA酶敏感，并可以洗脱下来。随着感受态细胞膜蛋白的参与，可逆性吸附逐渐向不可逆吸附转化，不可逆吸附DNA对DNA酶不敏感。吸附到细胞外表是双链DNA，而不是单链DNA实验证明：肺炎链球菌的转化因子在100下逐渐失去转化活性(DNA发生变性)。在逐渐冷却过程中活性逐渐恢复(单链DNA复性成双链)。阐明完好的DNA双链构造对于转化活性来说是必要的，转化的第一步，需求双链DNA才干结合到细胞外表的结合位点上。当DNA吸附后，被酶解开成单链DNA，只需单链DNA才干进入细胞内并与受体染色体DNA进展整合。 流感嗜血菌特异性摄取序列： 5AAGTGCGGTCA 3淋病奈瑟球菌特异性摄取序列

5、：5GCCGTCTCAA 3在流感嗜血菌的染色体上有600个拷贝的摄取序列。摄取序列虽然只需10-12bp，但很少随机地出如今其他物种的DNA序列中，因此这些细菌对外源DNA的吸收具有选择性。为什么有些细菌对摄取的DNA有特异性要求呢？近年来的研讨阐明，G-菌和G菌对单链DNA也能进展有效转化，但普通是在较低的pH值下进展的。外源DNA片段在受体细胞中的命运：外源DNA红色转化到受体细胞后，经过同源重组整合到染色体上，否那么被降解成核苷酸。 DNA的整合 转化为一样或相近物种之间的同源重组提供了能够性，是自然界中基因交换的一条重要途径，在生物变异和进化中起着重要作用。转化的效率决议于以下三个内

6、在要素：受体细胞的感受态，决议转化DNA能否进入细胞受体细胞的限制系统，决议转化DNA在整合前能否被分解供体和受体DNA的同源性，决议转化DNA的整合。由于转化DNA总是与顺序一样或类似的受体DNA配合，所以亲缘关系越近的其同源性也越强，转化效率也越高。二、人工转化 经过二价阳离子处置，大肠杆菌等部分G-细菌能产生感受态经过制备原生质，大多数细菌特别是某些G+细菌 知许多细菌包括大肠杆菌均无自然转化的才干，但经人工诱导可使它们构成感受态。如：1970年Mandel和Higa首先发现DNA在含有高浓度Ca2+的条件下可以被受体细胞摄入和转化，随后的实验证明由Ca2+诱导的人工转化的大肠杆菌中，其

7、转化DNA必需是一种独立DNA复制子。大肠杆菌的转化随着研讨技术的改良和阅历的积累，人们曾经建立了用Ca2+、Mg2+等诱导转化的规范程序，能对大肠杆菌菌株C600、JMl01、JMl09、DH5a等进展有效的转化。先将大肠杆菌培育至OD600=0.51接着用50-100mmolL CaCl2处置制备成感受态细胞然后将DNA与感受态细胞混合在冰浴中反响20-40min进展42热击可添加DNA的吸收107个转化子/ug质粒DNA 最经典的转化方法是：由于异源的质粒DNA分子可以进入大肠杆菌细胞，所以大肠杆菌摄取DNA是非选择性的。PEG介导的转化不能自然构成感受态的G+细菌如枯草芽孢杆菌和放线菌

8、，可经过聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG，普通用PEG 6000)的作用实现转化。这类细菌必需首先用细胞壁降解酶完全除去它们的肽聚糖层，然后使其维持在等渗的培育基中，在PEG存在下，质粒或噬菌体DNA可被高效地导入原生质体。电脉冲法电穿孔法 在许多细菌和真核系统中，它们既无自然的感受态呈现也不能用上述的方法建立感受态。因此人们开展了一种新的将核酸分子导入细胞的方法，最突出的是电穿孔(electroporation)法和基因枪(biolistic)转化法。 电穿孔法：是用高压脉冲电流击破细胞膜或将细胞膜击成小孔，使各种大分子(包括DNA)能经过这些小孔进入细胞，所以又称电

9、转化。 电场强度、电脉冲的长度和DNA浓度基因枪(biolistic)转化 基因枪转化法首先由Sanford报道，该方法是将包裹有DNA的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使DNA留在细胞内，特别是留在细胞器中。用这种方法初次胜利地将DNA导入酵母线粒体并引起线粒体遗传变化。基因枪转化如今被广泛地运用于植物的转化中三、建立转化方法的战略 被转化对象转化受体转化DNA的构建目的转化方法选择四、转化运用 在转化中，假设转化因子的两个基因是连锁的，那么它们可以同时被转化，也称为共转化，连锁的两个基因间隔越近，其共转化频率越高，反之那么低。利用共转化率和连锁的二基因间的间隔的反比关系可进展基因定位的任务

10、。1. 连锁检测2. 遗传图谱的绘制基因型数目trp2his2tyr1+11940+3360+685+418+2600+107+1180trp2+his2+tyr1+供体 trp2-his2-tyr1- 受体的转化类型trp2-his2重组率= 2600+107+3660+418 100% = 34% 11940+1180+ 2600+107+3660+418 trp2-tyr1重组率= 2600+1180+3660+685 100% = 40% 11940+107+2600+1180+3660+685his2-tyr1重组率= 418+1180+685+107 100% = 13% 1194

11、0+3660+418+1180+685+107trp2 his2 tyr1 3413403. 基因中断4. 插入基因第二节 接协作用conjugation 接协作用：是指在供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞向受体细胞转移的过程，也称细菌杂交 。 一、接合景象的发现与证明 Lederberg和Tatum1946年建立了用大肠杆菌K12的两个营养缺陷型菌株在根本培育基上能否生长，来检验细菌杂交或重组存在的方法。在此以前，没有人证明细菌杂交景象。细菌杂交有别于典型的有性杂交，故称为细菌接协作用。A菌株B菌株混合培育后在根本培育基中出现的原养型菌落能否是杂交的结果？必需求排除以下几种解释：一

12、是细菌细胞并没有接合，而是交换了DNA(转化作用)二是细胞并未接合，而是经过培育基交换了养料(互养)三是细菌细胞并未接合而是亲本发生了回复突变当时Lederberg和Tatum曾经证明，当把A菌株的培育液经过灭菌，再参与到B菌株的培育液中，没有原养型菌落，这阐明上述实验并非转化的结果。1950年，Davis经过他的U形管实验进一步支持了Lederberg和Tatum的结论。1. 转化作用的排除营养缺陷型细胞经过培育基交换养料而生长的景象亦称为互养。2. 互养的排除在A- B+ T1s和A+ B- T1r的杂交中，将基因型A- B+ T1s和A+ B- T1r两种细菌在根本培育基上混合培育，接触

13、较短的一段时间以后，喷上噬菌体T1，把A- B+ T1s细菌杀死。经培育以后仍有原养型菌落出现，这阐明原养型菌落的出现并非由于互养。 由于大肠杆菌的突变率普通都10-8，假设两个基因同时回复突变，那么其能够性只需10-1610-810-8，这种几率在平板上是很难检测到的，所以混合培育能出现10-510-6频率的菌落一定是重组的结果。3. 回复突变的排除4. 遗传物质的单向转移 正交实验AStrsBStrr用链霉素将A菌株杀死重组体的数目变化不大(A) Strr (B) Strs将B菌株杀死一个重组体也没有出现反交实验Amet- bio-Strr或Strs Bthr- leu- thi-Strs

14、或StrrHayse1952用正反杂交实验证明，细菌重组的发生只是染色体一方向的转移，而且染色体的转移往往不完全。 把A菌株以为是供体，而B菌株是受体A菌株作为遗传物质的供体，当链霉素对它进展灭活以后，并未影响它传送遗传物质的才干。B菌株作为遗传物质的受体，一旦被链霉素杀死以后，必然不能出现重组体。供体菌株又称为雄性细胞，受体菌株又称为雌性细胞StrrA突变型不育变种置冰箱1年后供体的A菌株Strr B菌株Strs可育的StrsA菌株共培育，一同繁衍不能得到杂交子StrrA菌株 B菌株Strs恢复了StrrA突变型的可育性F质粒的发现 (Hayes) 大肠杆菌的供体或雄性细胞(如A菌株)记为F

15、+，带有一个性因子或致育因子F (fertility factor)，而另一个不带性因子F的受体或雌性细胞(如B菌株)叫做F-； 杂交F+F-是可育的，杂交F-F-是不育的； F因子可以传送，从F+到F-细菌，但必需经过细胞接触 F因子可以自发丧失，一旦丧失就不能再恢复，除非从另一个F+细胞再把它传送过来。分析结果：F因子是染色体外的一种遗传构造，也就是质粒(plasmid)。 F+是一种遗传性状F 因子的存在使细菌成为F+F 因子的丧失使细菌成为F-F+ 细菌分裂仍得到F+细胞二、F质粒的构造及其在细胞中的存在形状 F质粒的遗传构造 F质粒的基因组由三个主要区段组成：转移区、复制区、插入区。

16、长度为33 kb，由23个基因组成，构成一个tra支配子(tra operon)。tra ABCEFGHKLQUVW与性菌毛的构成有关tra YZMIGD等与F因子的转移有关 traG、traN 影响杂交对的配对构成与否 traI、traM 决议DNA转移起始 traI 编码解旋酶I(helicase) traD 控制DNA转移； traY、traZ 编码的核酸内切酶能在转移起始区 oriT上切开一个缺口。1转移区(transfer region)复制区担任F质粒的自我复制F质粒自主复制区为oriVVegetative origin of replication，在oriV中包含有复制起点。F

17、质粒的复制是按型方式进展复制，它是一种严紧型质粒。F质粒的拷贝数能被准确地控制，一个寄主细胞约有12个F质粒。repF replicative protein编码一组与F质粒复制相关的蛋白质。incincompatibility基因产物使细胞具有不相容性。2复制区replication regionF质粒插入区包含4个插入顺序：2个IS31个IS21个Tn1000它们与F质粒的整合、切除、易位有关 3插入区insertion region2. F质粒在细胞内的存在方式 根据大肠杆菌细胞内有无F质粒及F质粒在细胞内的存在形状可将细胞分为4种类型：F-、F+、Hfr、F。F-：是细胞内不含F质粒；

18、F+：是细胞内含有F质粒且独立染色体外；Hfr菌株(high frequency recombination strain)：高频重组菌株：是F质粒整合到宿主的染色体上，随着宿主染色体的复制而复制；F是指携带了宿主的一部分染色体的F质粒。 三、F质粒与接协作用 1. F+F-杂交有F质粒的细胞在形状学上可以与F-明显区别。除了共有的大量外表菌毛以外，F+还有少量通常在细胞对数生长期中只需13根性菌毛。纤细的蛋白质性菌毛有的长数毫米，直径约为8nm。性菌毛在细菌的接合过程中起着非常重要的作用。 2. HfrF-杂交 Hfr菌株是怎样构成的呢? F质粒有两种方式整合到染色体上：同源重组、质粒和染色

19、体共有插入序列和转座子。大肠杆菌染色体基因组有7个IS1、13个IS2及6个IS3；F质粒有1个IS2和2个IS3。 3. FF-杂交 F质粒在脱离Hfr细胞的染色体时也会发生过失，从而构成带有细菌染色体基因的F质粒。而F因子又可经过交换交融到细菌染色体的原来位置上，回复到原来的Hfr形状。由于在FF-接合运用中能专注性地向F-转移F质粒携带的供体基因，因此经过F因子的转移而使受体菌改动其遗传性状，这种景象也被称为F 因子转导。四、中断杂交实验和基因定位 中断杂交：就是将两个菌株例如Hfr a+ strsF- a strr在培育液中进展通风培育，每隔一定时间取样，把菌液放入组织捣碎器里搅拌以中

20、断杂交，经过稀释接种到鉴别培育基上，待构成菌落后鉴定它们的基因型。 1957年Wollman和Jacob初次进展中断杂交实验：供体菌：HfrH strs thr+ leu+ azis tons lac+ gal+受体菌： F- strr thr leu- azir tonr lac- gal-0 azi ton lac gal F0 thr lac trp his thy arg str F2 8 27 45 61 69 73Peptide-induced transfer of Enterococcus faecalis plasmid pCF10. (A) Peptide pheromon

21、e cCF10 (triangles) is expressed from the chromosome of both plasmid-containing donor cells and plasmid-free recipient cells. Inhibitor peptide (stars) is expressed from pCF10 and secreted into the medium to prevent pheromone from the donor cell from inducing itself, probably through competitive bin

22、ding to the pheromone binding protein PrgZ. (B) Pheromone from a nearby recipient cell is detected by PrgZ. PrgZ imports the peptide pheromone using the chromosomally encoded Opp (Oligopeptide permease) system. (C) Imported cCF10 induces expression of transfer genes, including the cellsurface adhesi

23、n PrgB. (D) PrgB mediates aggregation of the donor and recipient cells. A mating channel is then formed and single-stranded pCF10 is transferred to the donor cell via a rolling circle mechanism. After pCF10 has established itself in the recipient cell, the inhibitor peptide and another mechanism of

24、negative control, PrgY, is expressed to prevent self-induction by endogenous cCF10.第三节 转导 (transduction) 转导：是利用噬菌体为媒介，将供体菌的部分DNA转移到受体菌内的景象。由于绝大多数细菌都有噬菌体，所以转导作用较普遍。另外，转导DNA位于噬菌体蛋白外壳内，不易被外界的DNA水解酶所破坏，所以比较稳定。 局限性转导：被转导的DNA片段仅仅是那些接近染色 体上溶源化位点的基因转导普遍性转导：任何供体的染色体都可以转移至受体细胞1952年Lederberg和他的学生Zinder把鼠伤寒沙门菌的

25、一个突变菌株LT22(trp-)和另一个突变菌株LT2(his-)在根本培育基上进展混合培育，结果在107细胞中得到大约100个原养型菌落。 一、转导景象的发现 LT2菌株LT22菌株中间用滤板隔开U形管实验 可过滤因子并不由于DNA酶的处置而失活； 可过滤因子和从溶源性的LT22菌株得来的噬菌体(称为 P22)具有一样的大小和质量； 可过滤因子加热后失活，用抗P22血清处置后也失活； 把P22与 LT2和LT22菌株分别混合培育，在根本培育基上不出现原养型菌落。结果证明了可过滤因子是温暖噬菌体P22。这就是最早发现的转导景象。 经过一系列的实验，证明可过滤因子具有以下一些特性：转导过程中有三

26、个组成部分，即供体、噬菌体和受体。这种导致基因重组的方式不同于转化，转化需求供体DNA和受体细胞接触，而转导那么是以噬菌体为媒介将供体遗传物质传给受体，无需DNA和受体细胞接触。转导可分为普遍性转导和局限性转导，普遍性转导又可分为完全转导和流产转导。二、普遍性转导1. 完全转导P1 供体 搜集子代噬菌体菌苔计数噬菌体完全培育基受体缺陷型大肠杆菌选出重组子转导子根本培育基侵染 裂解 侵染野生型转导频率= 转导子数 100% = 转导子数 100% 侵染受体的P1颗粒数 噬菌斑数+转导子数2. 流产转导3. 普遍性转导在遗传学和分子生物学研讨中的运用 (1)共转导： 普遍性转导的重要运用之一是经过

27、测定共转导的频率进展基因定位，所谓共转导(cotransduction)是指两个处在一个转导片段上的基因一同整合进受体染色体中。 被共转导的两个基因之间的间隔不能超越转导噬菌体所能包装的DNA长度，而且越是严密连锁的基因其共转导频率也越高。F为共转导频率，d 为基因间间隔，L为转导片段长度这里指噬菌体基因组长度，用分钟表示F = (1 d/L)3 d = L (13F)以thr+leu+为供体，以thr-leu-为受体的P1噬菌体转导实验中，得到1%的thr+leu+转导子，计算thr和leu之间的遗传图距。P1噬菌体基因组约为大肠杆菌染色体长度的2.4% d = 2.4 (130.01) =

28、 2.4 (1-0.215) = 1.883 (2)三点杂交法：P1噬菌体所进展的共转导被广泛运用于大肠杆菌的基因定位中。1955年Lennox用P1噬菌体转导寄主大肠杆菌染色体，研讨基因连锁关系时发现，thr和leu有时能、有时不能与第三个基因ara共转导。 实验选择基因测定的基因 1 ara+75% leu+, 0% thr+ 2 thr+ leu+85% ara+他用P1噬菌体感染供体(thr+ leu+ ara+)，用所得到的噬菌体裂解液去感染受体菌(thr- leu- ara-)，得到的结果。 实验1可知：ara基因与leu基因靠得较近，而与thr基因相距较远，陈列顺序应是thr-a

29、ra-leu或thr-leu-ara。假设是前一种情况，那么thr+ leu+转导子应该大多数含有ara+基因；假设是后一种方式，那么thr+ leu+转导子应该很少含有是ara+，或者根本没有。而由实验2可知，thr+ leu+转导子同时又是ara+的占85，所以上述3个基因的陈列顺序是第1种。三、局限性转导(specialized transduction) 局限性转导：是指以噬菌体为媒介，只能将供体菌特定的一个或几个基因转移到受体菌中的转导景象。导致局限性转导的普通都是温暖噬菌体，它们在供体菌染色体上具有特定的整合位点。在某些条件下，当这种整合状的原噬菌体脱离寄主染色体时，偶尔会将整合位

30、点两端相邻的基因错误地切离下来，并组装到噬菌体颗粒中。当这种噬菌体感染另一细菌时，就将原寄主的基因转移到另一细菌中。1高频转导的原理不正常环出构成特殊性转导颗粒这种缺陷噬菌体亦是转导噬菌体，它具有感染才干，能整合到寄主染色体一样的位点上构成稳定的转导子。所得转导子的频率约为10-6，称为低频转导。当携带有gal基因的缺陷噬菌体和正常的噬菌体在同一细胞时，正常噬菌体整合到寄主的染色体上后，产生两个杂合(细菌/噬菌体)att位点，dgal缺陷噬菌体就可以整合到该位点上。高频转导子的构成杂基因子重组性转导再次整合导致溶源性转导正常噬菌体协助dgal缺陷噬菌体整合和繁衍，因此被称为助手噬菌体helpe

31、r phage。这种转导子不稳定，由于原噬菌体很容易被诱导切离下来。在这种切离的裂解物中，有一半是正常噬菌体，另一半为dgal缺陷噬菌体。假设用这种裂解物去转导另一个Gal-菌株，其转化频率实际上可达50%，所以也称之为高频转导。CRISPR构造及作用机理CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)为规律成簇间隔短回文反复，是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的反复构造。CRISPR经过与一系列相关蛋白、前导序列一同，为原核生物提供对抗噬菌体等外源基因的获得性免疫才干。 这种构造最早于1987年在大肠杆菌(Es

32、cherichia coli) K12的iap基因侧翼序列中被发现，后来，科学家利用这个小片段找到了一种操作简单、可对多种生物的基因组进展遗传改造的工具CRISPRCas系统。 后续的遗传学实验和生物化学实验也证明，这些CRISPR序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的，很有能够是生物体抵御病毒等外来人侵者的一套特异性防御机制，就像是另外一套顺应性免疫反响系统。CRISPR系统根本构造 CRISPR系统由前导序列leader sequence，LS、 CRISPR基因座以及一系列Cas CRISPR-associated蛋白组成。Leader序列： Leader序列前导序列由300500b

33、p碱基组成，位于CRISPR的5端，与第一个反复序列直接相连，是一段在物种内相对保守的AT富集的区域。有研讨阐明前导序列是新插入序列的识别位点，也有研讨指出，它可以作为启动子，启动CRISPR基因座的转录。CRISPR基因座：CRISPR基因座由简短稳定的同向反复序列(direct repect，DR)和长度相近的非反复的间隔序列(spacer)间隔陈列而成，称为R-S构造。其中反复序列的片段长度在2148b，且含有57 bp的回文序列，通常能构成稳定的茎环构造，间隔序列的长度在2672 bp，能够来源于噬菌体、质粒等外源DNA序列。Cas基因：cas基因是存在于CRISPR位点附近的一系列基因，cas基因簇通常由410个保守基因组成，它表达出的cas蛋白对CRISPR防御机制的实现不可或缺。cas基因根据其保守程度可分为中心cas基因、亚型特异