生物体内药物分析方法与实际应用

1、生物体内药物分析方法与实际应用简介2.体内药物分析方法设计与建立3.方法学确认（评价、确证、考评）1.1 生物样品分析是药代研究的必备手段：分析化学是化学科学中的“眼睛”“眼睛”是心灵的“窗户”透过“窗户”获得大量的信息定量分析定性分析（半定量）1. 简 介源于化学学科中的分析化学专业具有分析化学的基本概念和要求不同于一般的药物分析同时具有生物学科的特点DistributionMetabolismAbsorptionExcretion生物样品中药物的分析测定是定量描述药物体内过程、获得药代参数的重要手段之一。1.2 方法学类型及特点： 体内药物分析方法大致可归为主要的五类： 1. 光谱分析法

2、2. 色谱法 3. 毛细管电泳法 4. 免疫分析法 5. 同位素法 （）传统分类方法:集各种方法之长, 为我所用: HPLC-UV HPLC MRD 体内药物分析方法特点： 灵敏度高： 受到给药剂量的限制 受到生物利用度的限制 浓度低: 专一性好： 生物内源性物质的干扰 体内新形成的代谢产物干扰 样品量少： 血液（血浆、血清、全血） 尿、胆汁、唾液、汗、乳汁、精液 粪便、组织器官 方法快捷： 不是专门的方法学研究， 利用方法较快的阐明药理学的问题。 可靠、重现性好： 药代实验的不可重复性。 药物类型多： 需要多种仪器、技术手段的配套 光谱分析法 比色法 紫外分光光度法: 差示、导数、双波长、三

3、波长 荧光分光光度法 色谱法: 分离效率高; 专一性较高 HPLC: 适用范围广; 室温检测; 样品预处理简单; 流动相选择范围广; 仪器自动化程度高 GC: 化合物气化；载气种类少； 方法灵敏，但受到进样量的限制 TLC: 检测条件受限制 毛细管电泳法: 分离效率高; 专一性较高 毛细管区带电泳 胶束电动毛细管色谱 毛细管凝胶电泳 毛细管等电聚焦 毛细管等速电泳 毛细管电色谱法进样量少，检测条件受限制。 同位素法: 灵敏度高; 专一性差 放射强度表示标记药物量() 同位素技术与其他分析法相结合以提高专一性 免疫分析法: 放射免疫分析 酶免疫分析 荧光免疫分析（二）、生物样本的药物测定方法生物

4、样品中的药物测定，免疫学和微生物学方法。应根据待测药物的性质，选择特异性好、灵敏度高的测定方法。色谱法包括高效液相色谱法（HPLC），气相色谱法（GC）和色谱-质谱联用法。在需要同时测定生物样品中多种化合物的情况下，LC-MS/MS和GC-MS/MS联用法在特异性、灵敏度和分析速度方面有更多的优势。应用放射性核素标记法测定血药浓度应配合色法，以保证良好的检测特异性。如某些药物难于用上述的检测方法，可选用免疫学或生物学方法，但要保证其可靠性。放射免疫法和酶标免疫法具有一定特异性，灵敏度高，但原药与其代谢产物或内源性物质常有交叉反应，需提供证据，说明其特异性。生物学方法（如微生物法）常能反映药效学

5、本质，但一般特异性较差，应尽可能用特异性高的方法（如色谱法）进行平行检查。 摘自: 临床前药代动力学研究技术指导原则（第二稿）（草案）2. 体内药物分析方法设计与建立2.1 体内药物分析方法设计的主要依据 明确分析方法设计的目的要求 a. 临床药物监护: 简便、快速、批量测定 b.药代动力学研究: 是否要求原形药物与代谢物同时测定 注意整个浓度变化的范围 样品量多, 方法尽可能简便 c. 配合新药设计合成、药理、毒理学的研究: 药物是否吸收? 生物利用度如何? T1/2? Tmax? Cmax? 化合物药代的快速评价 要求方法学简单，快捷的提供实验数据。 d. 新药报批: 参照SFDA颁布的指

6、导原则,按照SOP进行试验.较快的获得信息 了解待测药物的特性, 调研文献 药物的结构、理化性质 检测方法? 溶解度? 稳定性? 药物的药理和毒理作用机制 生物样品:动物属性? 组织器官? (同一类化合物的)体内代谢情况 药物的剂量 给药途径 干扰成分的多少 样品的预处理方法 仪器设备与实验室条件 文献资料的可参考性? 可重复性? 别人可做的事情是否适合我们? 实验室硬件建设是否与研究课题相互匹配? 药物就是药物！它不是一般的化合物。应掌握和理解它的药效和毒性作用机制、理化性质、将来的临床应用等等。只有对其加深理解才能进行深入的代谢研究，包括药物代谢研究所采用的方法技术。 体内药物分析方法设计

7、与建立的一般步骤 总的原则：根据被测药物的性质药物浓度的大致范围(经验估计)仪器设备条件对药物和研究目的的理解程度灵敏 专一 简捷 可行 初步分析方法的预试优化确认以药物进行测定空白生物介质 + 药物空白生物介质(杂质)给药后的生物样品(有无药物?产物?)考虑内标的选择方法学的可行性验证评价3. 方法学确认（评价、确证、考评） （validation）“生物样品测定的关键是方法学的确证。方法学确证是整个药代动力学研究的基础。这是药代动力学研究有别于其它药理毒理研究的特殊之处。所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。在通过特异性、灵敏度、精密度、准确度、

8、稳定性等研究建立了检测方法学，得到了标准曲线后，在检测过程中还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性。” 摘自: 临床前药代动力学研究技术指导原则（第二稿）（草案）生物介质：一种生物来源物质，能够以可重复的方式采集和处理。例如全血、血浆、血清、尿、粪、 各种组织等。准确度：在确定的分析条件下，测得值与真实值的接近程度。分析批：包括待测样品、适当数目的标准样品和QC样品的完整系列。一天内可以完成几个分析批，一个分析批也可以持续几天完成。3.1 名词解释:重现性：不同实验室间测定结果的分散程度，以及相同条件下分析方法在间隔一段短时间后测定结果的分散程度。介质

9、效应：由于样品中存在干扰物质，对响应造成的直接或间接的影响。稳定性：一种分析物在确定条件下，一定时间内在给定介质中的化学稳定性。精密度：在确定的分析条件下，相同介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。标准曲线：实验响应值与分析物浓度间的关系。应采用适当的加权和统计检验，用简单的数学模型来最适当地描述。标准曲线应是连续的和可重现的，应以回归计算结果的百分偏差最小为基础。质控样品：即QC样品，系指在生物介质中加入已知量分析物配制的样品，用于监测生物分析方法的重复性和评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确性。标准样品：在生物介质中加入已知量分析物配制的样品，用于建立标准曲线，计算质控样品

10、和未知样品中分析物浓度。 定量范围： 包括定量上限（ULOQ）和定量下限（LLOQ）的浓度范 围，在此范围内采用浓度-响应关系能进行可靠的、可重 复的定量，其准确度和精密度可以接受。选择性：分析方法测量和区分共存组分中分析物的能力。这些共存组分可能包括代谢物、杂质、分解产物、介质组分等回收率：分析过程的提取效率，以样品提取和处理过程前后分析物含量百分比表示。nominal concentration : 真实浓度 (浓度真值; 算术值) 如: 配置溶液(1.3mg/ml); 标曲或QC中的fortified Samples : processed samples stock solution

11、standard samples authentic samples: 与试验物质完全相同的样品 (或根据试验样品复制的标准品)3.2 体内药物分析方法的评价内容：1. Selectivity: SFDA/FDA2. Linear Range and Response Factor： S/F3. Inter-Day Precision and Accuracy: S/F4. Intra-Day Precision and Accuracy: S/F5. Dilution Integrity: F6. Sensitivity: S/F7. Recovery (Extraction Efficie

12、ncy) S/F8. Matrix Effects: F9. Carryover Evaluation F10. Stability: S/F11. Relative Retention: F3.2.1 Selectivity:被测组分与内源性物质、试剂中杂质、代谢产物以及其它干扰物质有良好的分离; 必须证明所测定的物质是预期的分析物，内源性物质和其他代谢物不得干扰样品的测定。对于色谱法至少要考察6个不同来源空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图。对于质谱法则应着重考察分析过程中的介质效应。1. 被试验药物标准样品的色谱图2. 正常生物样品（空白

13、）的色谱图3. 空白生物样品外加被试药物的色谱图4. 给药后的生物样品的色谱图试验报告(论文)中应提供:3.2.2 Linear Range and Response Factor：必须用至少6个浓度建立标准曲线(n = / 5);应使用与待测样品相同的生物介质;定量范围要能覆盖全部待测浓度;不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点。 标准曲线标准曲线线性范围标准曲线的相关系数试验报告(论文)中应提供:5. 空白生物样品外加被试药物(低,中,高三个浓度; n5)经标准曲线的反算(back-calculated)测定浓度标准曲线线性范围最低和最

14、高浓度样品的色谱图TabX. Standard Curve Readback Concentrations for XX 药物 -20% 0.80 -15% 1.70 4.25 17.0 85.0 425 850 +20% 1.20 +15% 2.30 5.75 23.0 115 575 1150 Nominal Concentrations (ng/ml) 1.00 2.0 5.00 20.0 100 500 1000 1.07 1.98 4.67 18.3 97.4 483 1002 0.921 2.10 5.17 20.1 106 511 1063 1.04 2.10 4.69 20.4

15、 102 486 991 1.05 2.21 5.20 (a) 102 491 1038 0.946 2.21 5.20 19.9 102 495 1073 平均值: A B C E F G H SD I J K L M N O RSD% P Q R S T U V %RE W X Y Z A B C n n1 n2 n3 n4 n5 n6 n7Acceptance Criteria3.2.3 Inter-Day Precision and Accuracy:3.2.4 Intra-Day Precision and Accuracy:Precision of the method, defi

16、ned by the percent relative standard deviation ( %RSD = （standard deviation）（mean）100)， was determined from the interpolated QC sample concentrations.Accuracy of the method, defined by the percent relative error ( %RE = （standard observed concentrationnominal concentration） （ nominal concentration ）

17、100)Precision and AccuracyPrecision:10ng/ml10ng/mlAccuracy 要求选择3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。 低浓度选择在定量下限（LLOQ）附近，其浓度在LLOQ的3倍以内； 高浓度接近于标准曲线的上限； 中间选一个浓度。每一浓度每批至少测定5个样品，为获得批间精密度应至少连续测定3个分析批。 精密度用质控样品的批内和批间相对标准差（RSD）表示，RSD一般应小于15%，在LLOQ附近RSD应小于20%。 准确度一般应在85%115%范围内，在LLOQ附近应在80%120%范围内。 空白生物样品外加被试药物(低,中,高三个

18、浓度; n5)的日内、日间精密度和准确度Inter-Day 和 Intra-Day Precision and Accuracy:国内一般做法：1.00 n=5 10.0 +血浆 n=5 50.0 n=5同一天日内1次/日；连测5天日间5个平行样品合为一体；分5次进样浓度 样品管 测定结果 1.0 1 2 3 4 5 10 1 2 3 4 5 100 1 2 3 4 5 合为一起日内分5次测定合为一起日内分5次测定合为一起日内分5次测定若每日测定1次,连续测定5次，得日间结果数据处理Nominal Concentrations (ng/ml) 3.00 75.0 750 3.46 73.5 7

19、11 平均值: A B C SD I J K RSD% P Q R %RE W X Y n 6 6 6TabX. Quality Control Sample Concentration for XX 药物 3.23 75.6 733 平均值: A B C SD I J K RSD% P Q R %RE W X Y n 6 6 612Inter-Day Statistics 平均值: A B C SD I J K RSD% P Q R %RE W X Y n 30 29 30 3.23 75.6 733 平均值: A B C SD I J K RSD% P Q R %RE W X Y n 6

20、6 6353.2.5 Dilution Integrity:如何测定超出线性范围的样品?Range: 10200ng/ml对大于200ng/ml的样品要进行稀释: 500ng/ml 50ng/ml10X所处理和测定的结果是否符合要求: 50ng/ml的可信限之内 (50 ng/ml ) 表xx. Dilution Integrity for xxDrug Acceptance Criteria -15% 42500 +15% 57500 Nominal Concentrations (ng/ml) Acceptance 50000 Ratio 47478 49950 47794 6/6 512

21、04 49265 53459 平均值: 49858 SD 2239 % RSD 4.49 %RE -0.284 n 6Acceptance Ratio: 在“Acceptance Criteria”允许范围内 的 样品数目除以分析的样品总数对小于10ng/ml的样品如何处理: 10ng/ml 20ng/mlRange: 10200ng/mlx2所处理和测定的结果是否符合要求: 10ng/ml的可信限之内 (10 ng/ml )3.2.6 Sensitivity:定量下限是标准曲线上的最低浓度点，要求至少能满足测定35个半衰期时样品中的药物浓度，或Cmax的1/101/20时的药物浓度，其准确度

22、应在真实浓度的80%120%范围内，RSD应小于20%。应由至少5个标准样品测试结果证明。 最低检测浓度(X/ml)最低检测量(X)最低定量下限(LLOQ) 表xx. Sensitivity for xxDrug Nominal Concentrations (ng/ml) Run (1.00) 1 0.842 0.985 0.891 0.913 1.15 0.888 2 1.01 0.783 0.976 0.942 1.00 0.880平均值: 0.938 SD 0.0951 % RSD 10.1 % RE -6.02 n 12标准曲线试验表明：LLOQ为1ng/ml；该浓度的精密度为10.

23、1%；该浓度的准确度为-6.02 3.2.7 Recovery (Extraction Efficiency)提取回收率: 应考察高、中、低3个浓度的提取回收率，其结果应当一致、精密和可重现。 低、中、高(3个浓度):回收率不低于70%(原规定) 回收率不低于50%(改为)萃取回收率: Mean MeanConc. Peak Area Peak Area Peak Area Percent Percent SD(ng/ml) Fortified Fortified Processed Recovery Recovery Samples Samples Samples A1 A B1 B1 /A

24、 C D A2 B2 B2 /A A3 B3 B3 /A A4 B4 B4 /A B5 B5 /A M. E1 E F1 F1 /E G H E2 F2 F2 /E E3 F3 F3 /E E4 F4 F4 /E F5 F5 /E H. I1 I J1 J1 /I K L I2 J2 J2 /I I3 J3 J3 /I I4 J4 J4 /I J5 J5 /I 方法回收率:低 中 高(3个浓度)的加入量与检出量的比较.L.M.H.Conc. 测定量 加入量 回收率 回收率(ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) (%) (平均)123456789101112131415L.M.H.212

25、223242526272829303132333435ABC3.2.8 Matrix Effects:在采用质谱方法进行体内药物定量检测时,应进行基质效应试验,观察基质对药物测定的影响. 基质（matrix） 尚无统一的解释，曾称为“一种分析物（analyte）的环境（milieu）”，即指标本中除分析物以外的一切组成。 以血清胆固醇（Chol）测定而言，就是指Chol以外血清中的一切成分及其物理、化学性质。 基质效应（matrix effect）对临床化学分析的影响越来越受到人们的重视。最早是在酶动力测定中用人工制备的参考物质时发现的。 基质效应（matrix effect） 按NCCLS文

26、件的定义，指: （1）标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值 的影响。 （2）基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。 广义说来，基质效应也应包括已知的干扰物（如Chol测 定中胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物），但 目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质 或因素（如粘度、pH等）的影响。减少基质效应的研究方向，至今仍有参考价值： 改进室内质控样品； 改进仪器设计及试剂组成； 选择方法及方法学参数，使其适应性更强且易于掌握， 对制备物（如标准液，室间质控样品与质控物）基质的确切性不敏感。Matrix Factor (MF;基质因子): peak area (fortifi

27、ed samples) peak area (analytical samples)fortified samples: 生物介质 样品处理 加入待测药物 测定analytical samples: 标准样品 测定 (两种测定方式的药物浓度相等)IS adjusted Matrix Factor (内标校正的基质因子): 基质因子是采用色谱峰面积峰面积计算. 内标校正的基质因子是采用色谱峰面积的比值计算. ratios of peak area(Drug/IS) (fortified samples) ratio of peak area (Drug/IS) (analytical sampl

28、es) (两种测定方式的药物浓度相等)基质因子为1, 表明药物的测定无基质效应影响.基质效应影响范围(基质因子;内标校正的基质因子)在某一个区间可被接受. (0.8-1.2)Drug 峰面积 IS 峰面积 PAR MF IS校正后MF Mean Mean （A） （B） （A/B） （A/C） （A/B）/D MF IS校正后MF 11404 39416 0.289 0.968 1.06 1.02 0.988 10658 51296 0.258 0.905 0.945 10557 39457 0.268 0.896 0.982 0.923 1.03 Mean 0.967 0.997SD 0.0

29、53 0.017%RSD 5.47 1.72N 6 6Tabxx. Matrix Effects for xx drugDrug 峰面积 IS 峰面积 PAR Drug 峰面积均 值 Mean PAR （A） （B） （A/B） （C） (D) 40240 0.269 11778 0.273 analytical samples fortified samples run1run2run3run4run5run63.2.9 Carryover Evaluation在方法评价中，线性的最高浓度（如1000ng/ml）被测试之后，必须测试试剂空白样品来评价Carryover 。在样品出峰的时间（R

30、T）,试剂空白样品可能会出现一个相应的信号，这个信号是LLOQ的百分之几（LLOQ%）? LLOQ: 1.0 ng/ml; Acceptance: 0.8-1.2 ng/ml , (1.0 ng/ml 的 20%) ; 在进样高浓度样品时，在分析系统中会产生“携带污染”；“污染” 到什么程度时，分析方法可以接受；什么程度时，分析方法不可以接受；Carryover可允许接受的范围 “20% of LLOQ”如果： 方法学的 LLOQ = 1ng/ml ( 1ng/ml X ) 20% 那么： 假定：在validation试验中，观察到1000ng/ml（线性范围的 最高浓度）样品引起 50% o

31、f Carryover (残留量)，指的是LLOQ的50%;(1ng/ml的50% = 0.5ng/ml)1000ng/ml的残留率：(ng/ml1000ng/ml=0.05%）“cut-off”浓度(残留量在20%的LLOQ以下的药物浓度)： X = 400ng/ml（1000ng/ml的残留量为0.5ng/ml, 多大浓度的残留量为20%的LLOQ？解“一元一次方程”所得到的浓度就是分析方法所分析的最大浓度。）1000ng/ml的样品所引起的残留为 ；残留率为0.05%。若要求所引起的残留为LLOQ（1ng/ml）的20% (0.2ng/ml)， 那么该样品的浓度应400ng/ml。若某一

32、个样品的浓度 400ng/ml ，那么所操作的下一个样品就要求重新进行验证。3.2.10 Stability:生物样品在处理前,室温放置的稳定性(Benchtop Stability).(2)生物样品在处理前,4放置的稳定性低 (n=5)中 (n=5)高 (n=5) 放置一定时间 处理 测定稳定性试验应从实验过程的实际情况出发, 如观察时间,存放温度等. 表xx. XX介质中XX药物在XX条件下的稳定性试验 Acceptance Criteria -15% 0.99 12.8 85.0 +15% 1.02 17.3 115 Nominal Concentrations (ng/ml) Acce

33、ptance 1.00 15.0 100 Ratio 0.99 13.0 87.8 8/9 1.01 16.7 98.0 1.05 17.1 114.8 平均值: A B C SD E F G RSD% H I J n 3 3 3Acceptance Ratio: 在“Acceptance Criteria”允许范围内 的 样品数目除以分析的样品总数(3) Freeze/Thaw Stability:观察生物样品经反复多次冻-融后的稳定性;低、中、高三个浓度;(或低、高二个浓度);标明冻存条件的温度(如:-20或-70等);标明融化后样品所处的温度(如:20或25或室温等);Freeze/Th

34、aw的周期数. 表xx. XX介质中XX药物经4次冻(-20)融(25) 后的稳定性试验 Acceptance Criteria -15% 0.99 12.8 85.0 +15% 1.02 17.3 115 Nominal Concentrations (ng/ml) Acceptance 1.00 15.0 100 Ratio 0.99 13.0 87.8 12/12 平均值: A B C SD E F G RSD% H I J n 4 4 4 Acceptance Ratio: 在“Acceptance Criteria”允许范围内 的 样品数目除以分析的样品总数(4) Extract S

35、tability:观察生物样品经处理后,待测样品放置一定时间的稳定性;低、中、高三个浓度;(或低、高二个浓度);标明放置的时间 (如:50小时等);标明放置的条件(如:10等); 表xx. XX介质中XX药物经处理后在xx条件 放置xx小 时的稳定性试验 标准曲线参数 斜率1/(ng/ml) 截距 相关系数 0.00 xxx 0.00 xxx 0.999xx Stansard Curve Readback Concentrations Acceptance Criteria -20% 0.800 -15% 1.70 4.25 17.0 85.0 425 850 +20% 1.20 +15% 2

36、.30 5.75 23.0 115 575 1150 Nominal Concentrations (ng/ml) 1.00 2.00 5.00 20.0 100 500 1000 0.971 1.94 5.20 20.4 99.7 493 957 1.01 1.89 5.01 19.7 102 501 1121 Mean - - - - - - - %RE - - - - - - - n 2 2 2 2 2 2 2 (续) XX介质中XX药物经处理后在xx条件 放置xx小 时的稳定性试验 Acceptance Criteria -15% 2.25 63.8 638 +15% 3.45 86.

37、3 863 Nominal Concentrations (ng/ml) Acceptance 3.00 75.0 750 Ratio 3.17 74.0 695 15/15 2.98 76.4 700 2.81 77.2 701 2.80 77.8 697 3.21 74.2 731 Mean - - - SD - - - n 5 5 5 (5) Solution Stability:观察药物溶液的稳定性,浓度: 药物储存液的浓度(xxmg/ml)条件: 溶媒; 温度;标明放置的时间 (如:50小时或30天等)与新配置的药液进行比较表xx. XX药物溶液在XX 放置XX天后 色谱峰面积比值

38、Old Stock Solution Nominal Conc. (3.0mg/ml)# 制备时间 色谱峰面积比值 4/17/03 1.60 1.54 1.46 Mean(R2) 1.53 SD 0.07 %RSD 4.60 n 3 New Stock Solution Nominal Conc. (4.0mg/ml) #制备时间 色谱峰面积比值 5/16/03 1.58 1.59 1.51Mean(R1) 1.53 SD 0.07 %RSD 4.60 n 3%Difference -1.92%Difference为: (R2-R1)x100/R1#在同一个浓度下进行计算条件: 溶媒; 温度:

39、 一般应进行两个温度条件下的观察 如: 一个在冷藏温度 一个在室温 即: 冷藏一套试验数据 室温一套试验数据(6) 冷冻条件下的稳定性(生物样品) XX介质中XX药物在xx条件 放置xx天的稳定性试验 Acceptance Criteria -15% 2.25 63.8 638 +15% 3.45 86.3 863 Nominal Concentrations (ng/ml) Acceptance 3.00 75.0 750 Ratio 2.85 74.0 695 14/15 2.98 76.4 700 2.81 77.2 701 2.80 77.8 697 3.21 74.2 637 Mean - - - SD - - - n 5 5 5 用来考察生物样品经较长时间的低温存放的稳定性,以确定质控样品能否长期存放?3.2.11 Relative Retention: 评价和观察分析系