医学细胞生物学课件：细胞增殖及调控

1、细胞增殖及调控 如果时光倒流25年，在座的各位还只不过是父母身体里的一个细胞；他们相遇融合为一个细胞，经过不断地细胞增殖及其对这个过程的精密调控，才长成了今天这样你。 在今后漫长的人生中，你们身体里的大多数细胞还要继续增殖并受到调控，如果这个过程发生了异常，健康就会受到威胁HeLa cell in culture几个概念细胞增殖（cell proliferation）是细胞生命活动的重要特征，包括细胞生长和细胞分裂的过程。细胞生长（cell growth）细胞分裂（cell division）细胞增殖的生物学意义生物繁育的基础 细胞补充创伤修复第一节细胞周期一、细胞周期概述二、细胞周期各时相的

2、动态变化 前期（prophase）早中期（prometaphase）中期（ metaphase ）后期（ anaphase ）末期（ telophase ）胞质分裂（ cytokinesis ）细胞周期G1期（Gap1 phase）S 期 （S phase）G2期（Gap2 phase）interphaseM phase间期分裂期一、细胞周期概述interphaseprometaphaseprophasemetaphaseanaphasetelophasecytokinesis单向性：G1 S G2 M，不能逆行阶段性：各时相的细胞形态和代谢特点都有明显差异。细胞周期特点不同生物的细胞tC存在

3、很大差异不同组织的细胞TC也有差异tStG2tM 相对恒定变化小G1期持续时间差异大，tG1决定细胞周期的长短。细胞周期时间（tC）从增殖的角度来看，所有真核细胞可分为周期细胞（连续分裂细胞）静止期细胞（休眠细胞、G0期细胞）终末分化细胞（不分裂细胞）细胞分类指在细胞周期中连续运转的细胞（细胞增殖） 如小肠绒毛上皮隐窝细胞 表皮基底层细胞 骨髓造血细胞周期细胞(cycling cell)暂时脱离细胞周期，不进行增殖，但在适当刺激下可重新进入细胞周期的细胞 肝脾细胞、淋巴细胞、成纤维细胞静止期细胞(quiescent cell, G0)指终端分化的细胞，发生不可逆地脱离细胞周期，丧失分裂能力，但

4、保持生理机能活动的细胞 神经元、肌肉细胞、红细胞终末分化细胞细胞同步化 （synchronization of cells）指在生理过程中自然发生的或经人为处理造成的使细胞处于同一细胞周期时相的方法。 自然同步化与人工同步化 人工同步化选择同步化诱导同步化有丝分裂选择法细胞沉降分离法 DNA合成阻断法有丝分裂中期阻断法适用于单层培养的细胞利用M期细胞呈圆球状隆起，与培养皿的附着力减弱的特点振荡、收集、保存在4、多次重复优点：细胞不受药物伤害，同步化程度高缺点：分离出来的M期细胞数量较少有丝分裂选择法(mitotic shake-off)有丝分裂选择法HeLa cell in culture属于

5、细胞沉降分离法，适用于任何悬浮培养的细胞处于细胞周期不同时相的细胞体积不同优点：同时获得大量不同周期时相的同步化细胞，分离效率高，对细胞活性影响小缺点：需专门的装备、价格贵活细胞离心淘洗法选用DNA合成抑制剂，可逆地抑制DNA合成TdR（胸腺嘧啶核苷）双阻断法该方法适用于（tG1+tG2+tM）tS细胞优点：适用于任何培养体系，同步化程度高， 可使所有的细胞同步化缺点：细胞可能出现非均衡生长的问题DNA合成阻断法第一次阻断：加入过量的TdR， S期细胞停止运转，其他期细胞最后停止在G1-S交界处第二次阻断：移去TdR，释放时间大于tS时，再次加入过量TdR，细胞群体阻断在G1-S交界处，再经释

6、放获得S期细胞TdR双阻断法( double thymidine block)TdR双阻断法重点，理解药物阻断法有丝分裂中期阻断法利用某些药物（ 秋水仙素,Taxol, nocodazole）抑制微管的聚合，抑制有丝分裂器的形成，从而把细胞阻断在有丝分裂中期优点：操作简便、同步化效率较高缺点：阻断的可逆性差Hela, Noc: 100ng/m, 16h二、细胞周期各时相的动态变化 有丝分裂完成到DNA合成之前tG1变化最大，控制着连续分裂细胞的增殖率是细胞生长和DNA合成准备时期中心体分离，为进行中心体复制作准备G1/S检验点（限制点，Restriction point）G1 期与DNA合成起

7、始与进行有关的酶与细胞从G1期到S期的转换有关的蛋白质G1期合成的蛋白质细胞周期蛋白( cyclin D, E等)从DNA合成开始到DNA合成结束的全过程主要生化事件S 期DNA复制组蛋白和非组蛋白合成核小体组装中心体复制DNA复制检测点（S phase checkpoint)真核细胞DNA复制特点DNA复制多个复制起点复制起点成簇活化DNA复制不同步GC含量较高的DNA序列在早S期复制AT含量较高的DNA序列在晚S期复制常染色质先复制异染色质在晚S期复制组蛋白与DNA的合成是一种联动关系在细胞S期存在一个反馈机制，调节游离组蛋白水平，保证组蛋白形成的数量与DNA量相适应。组蛋白合成DNA复制

8、完成到有丝分裂开始前的时期细胞核内DNA含量已增加一倍，由G1期的2n变成了4n活跃的RNA和蛋白质的合成，为M期的分裂作准备。G2 期加速合成微管蛋白，为M期纺锤体微管的组装提供原料成熟促进因子（MPF）形成已复制的中心体在G2期逐渐长大，并开始向细胞两极分离G2/M检验点G2 期细胞分裂开始到分裂成两个子细胞的过程染色质高度螺旋化，遗传物质均等分配，形成2个子细胞RNA合成停止，蛋白质合成减少细胞呈球形纺锤体组装检验点(spindle assembly checkpoint)M 期第二节细胞分裂无丝分裂（amitosis）：是细胞的直接分裂方式;减数分裂（meiosis）：在生殖细胞的成熟

9、过程中进行;有丝分裂（mitosis）：在体细胞中进行，将其遗传物质载体平均分配到两个子细胞中.有丝分裂有丝分裂过程人为划分为前期（prophase）早中期（prometaphase）中期（metaphase）后期（anaphase）末期（telophase） 胞质分裂（cytokinesis）有丝分裂器（mitotic apparatus）纺锤体（spindle）中心粒中心粒周围物质星体（aster）中心体（centrosome）星体微管动粒微管极微管Microtubule: a/b-tubulin heterodimerChristiane Wiese, and Yixian Zheng,

10、 JCB, 2006Microtubule NucleationK-fiberInterpolar microtubuleAstral microtubuleSpindle Microtubules:Key components of mitotic spindle中心体周期（centrosome cycle） 中心体经过一系列发育过程达到成熟并具有微管组织中心（MTOC）的作用 ；指在间期中中心体的复制至有丝分裂开始时两个新的中心体分离的过程。中心体周期 Centrosome 染色质凝集开始组装有丝分裂装置核仁解体前期（prophase）核被膜崩解核纤层解聚纺锤体进一步装配纺锤体微管与染色体

11、接触、结合动粒微管牵拉染色体剧烈地旋转、振荡，往返于两极之间早中期（prometaphase）染色体排列到赤道面上染色体最大程度凝集形成完整的有丝分裂器中期（metaphase）姊妹染色单体相互分离并移向两极后期A：染色单体向两极运动后期B：纺锤体两极移动分开后期（anaphase）Anaphase AAnaphase B子染色体到达两极动粒微管消失 染色体开始解螺旋核膜碎片重组成完整核被膜核仁重新出现末期（telophase） 开始于细胞分裂后期，完成于细胞分裂末期 分裂沟：赤道板周围处细胞表面下陷形成收缩环：由微丝束环绕细胞一周形成胞质分裂（cytokinesis）胞质分裂第三节细胞增殖调

12、控一、细胞周期调控的关键分子二、细胞周期检测点难点：有点难，但很重要喔！一、细胞周期调控的关键分子细胞增殖是一个多阶段、多因子参与，高度精确的过程，这个过程是由不同基因严格按照时间顺序表达的结果，也是基因与环境因素相互作用的结果。细胞周期的调控是严格有序、极其复杂的过程，涉及多个因子在多层次上的作用1960s，LelandHartwell以芽殖酵母为实验材料，发现cdc28基因cdc28基因编码一个34KD的蛋白激酶，促进细胞通过G1/S检测点研究背景budding yeast1970s，Paul Nurse以裂殖酵母为实验材料发现cdc2基因cdc2基因编码一个34KD的蛋白激酶，促进细胞通

13、过G2/M检测点命名为周期蛋白依赖性蛋白激酶 研究背景Fission yeast1980s，Timothy Hunt以海胆为实验材料发现细胞周期蛋白（Cyclin A和B）研究背景Leland H. Hartwell R. Timothy (Tim) Hunt Sir Paul M. Nurse 2001年10月8日Hartwell、Nurse和Hunt因对细胞周期关键调控分子的研究而获诺贝尔生理学/医学奖。周期蛋白 （Cyclin）周期蛋白依赖性蛋白激酶（Cyclin-dependent kinase，Cdk）周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制蛋白（Cdk inhibitor，CKI）细胞周期调控的

14、关键分子在细胞周期中呈周期性的积累和消失分子结构特点：含周期蛋白框、破坏框结构域Cyclin与Cdk形成二聚复合物，表现出激酶活性，Cdk为催化亚基，Cyclin为调节亚基在高等真核生物中，Cyclins主要包括 Cyclin A-H 8个成员周期蛋白（Cyclin）周期蛋白分类G1-Cyclins： Cyclin DG1/S-Cyclins：Cyclin ES-Cyclins：Cyclin AM-Cyclins：Cyclin BG1G1SG2Mconcentration与周期蛋白结合，进而表现出丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性在高等真核生物中至少有8种，即Cdk 1（Cdc 2）Cdk 8各种Cd

15、k在细胞周期内特定的时间被激活，通过磷酸化底物，驱使细胞完成细胞周期 周期蛋白依赖性蛋白激酶（Cyclin dependent kinase, Cdk）Cyclin磷酸化与去磷酸化(phosphorylation & dephosphorylation)CKICDK活性的调节因素CyclinCDKCKIPSubstrateSubstratePCDK/Cyclin活化位点：第161位的苏氨酸（T161） 抑制位点：第14位的苏氨酸（T14）抑制位点：第15位的酪氨酸（Y15） CDK1磷酸化位点CDK1CyclinBThr161Thr14Tyr15PPPPCDK1CyclinBThr161Thr

16、14Tyr15PPCDK1CyclinBThr161Thr14Tyr15PCDK1Thr161Thr14Tyr15PCDK1Thr161Thr14Tyr15CyclinBCDK1Thr161Thr14Tyr15CyclinBCyclinB degradationActive MPFMitosisCdc25Wee1Myt1inactiveRegulation of CyclinB/CDK1磷酸化调节蛋白质泛素化调节CyclinBCdk1CyclinBCdk1UbUbUbUbCdc20APC/CB细胞周期的驱动G1期：CyclinD与Cdk4、Cdk6结合，激活与DNA复制相关的基因表达G1-S期

17、：CyclinE与Cdk2结合，促使细胞通过G1/S检测点，启动DNA合成S期：CyclinA与Cdk2结合，使DNA复制得以延续M期：CyclinB与Cdk1结合，促进有丝分裂事件的发生G1/S transitionCDK2/CyclinE CDK4/6/CyclinD 活化RB 磷酸化E2F-1去抑制,激活转录G1S又称细胞促分裂因子（mitosis-promoting factor）、M期促进因子（M phase-promoting factor ）是 Cdk1（Cdc2）和 Cyclin B 形成的复合物促进细胞由G2期进入M期 成熟促进因子（maturation-promoting

18、factor ，MPF ）CDK1CyclinBThr161Thr14Tyr15PG2MG2/M transition对CDK激酶活性起负性调控的蛋白质与CDK或Cyclin-CDK复合物结合，拮抗Cyclin，抑制CDK的激活CKI分为CIP/KIP和INK4两大家族周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制蛋白（CKI）p21是CIP/KIP家族的典型代表与多种Cyclin-CDK复合物结合，抑制大多数Cdk的激酶活性与DNA复制聚合酶的功能亚基PCNA（增殖细胞核抗原）结合，直接抑制DNA的合成CIP/KIP家族p16是INK4家族的典型代表与Cyclin D竞争性结合Cdk4和Cdk6抑制Cdk 4和

19、Cdk 6的活性抑制Rb磷酸化阻止细胞由G1期进入S期INK4家族CKI 对细胞周期的调控CDKs/CyclinsMG1G2SCKIs: p15, p16, p21, p27Tumor suppressors: p53细胞周期调控二、细胞周期检验点（checkpoint）在长期进化过程中，细胞形成了一套保证细胞周期中DNA复制和染色体分配的监控机制，称为细胞周期检验点 高等真核生物和酵母细胞中普遍存在负反馈调节机制 细胞周期检验点S checkpoint二、细胞周期检验点（checkpoint）DNA损伤检验点（DNA damage check point ）：检测DNA有无损伤、合成有无错误

20、， DNA损伤、合成未完成，不能进入S期或M期G1/S检验点（G1/S checkpoint）G2/M检验点（G2/M checkpoint）早G1期和晚G1之间存在的一个特定检验点在酵母细胞中该点被称为启动点（start）高等真核细胞中该点被称为限制点（ R点，restriction point ）G1/S检验点是控制细胞增殖的关键，由此细胞可能有3种不同命运的出现G1/S检验点继续增殖细胞暂时不增殖细胞不增殖细胞DSBsSensorsTransducersEffectorsCell Cycle ArrestDNA RepairApoptosisDNA Damage Response (DDR)是控制细胞增殖的关键，由此细胞可能有3种不同命运的出现G2/M检验点继续增殖细胞暂时不增殖细胞不增殖细胞CDK1CDK1离子辐射DNA损伤激活细胞周期检验点的信号传导通路p53CHK2Pp21CDC25APCDK2p21CyclinECDK2p21CyclinEPPATMMDC153BP1MRNBRCA1MDC153BP1MR