DB33_T 2247-2020鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法(高清正版）

1、ICS 65.020.30B 43DB33浙江省地方标准DB33/T 22472020鸭坦布苏病毒 RT-PCR 和实时荧光定量RT-PCR 检测方法Method of RT-PCR and the real-time RT-PCR for the detection of duck tembusu virus disease2020 - 03 - 03 发布2020 - 04 - 03 实施浙江省市场监督管理局发 布DB33/T 22472020I前 言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。本标准由浙江省农业农村厅提出。本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。本标准起

2、草单位：浙江省动物疫病预防控制中心、浙江省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：云涛、徐辉、周彩琴、张存、赵灵燕、余斌、吴赟竑、张传亮、吴雪军、黄晓兵、冯肖肖、华炯钢、吕见涛、张娟敏、鲍伟华。DB33/T 22472020 PAGE 6鸭坦布苏病毒 RT-PCR 和实时荧光定量 RT-PCR 检测方法范围本标准规定了鸭坦布苏病毒的反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时荧光定量RT-PCR的实验条件、操作步骤和结果判定等要求。本标准适用于鸭坦布苏病毒核酸的检测。术语和定义2.1鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus，DTMUV）属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒类、Ntay

3、a病毒群，可引起鸭、鹅产蛋下降，雏鸭、雏鹅发病死亡。实验条件主要仪器设备PCR 仪。荧光定量 PCR 仪。微量移液器。组织匀浆器。电泳仪。电泳槽。水浴锅。紫外凝胶成像系统。高速台式低温离心机。生物安全柜。试剂0.01M 磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH7.4 PBS）：称取 8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.9 g Na2HPO412H2O、0.2 g KH2PO4，将上述试剂溶于 800 mL 去离子水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将 pH 调节至 7.4，然后加去离子水定容至 1 L，高温灭菌 30 min，室温保存。氯仿。异丙醇。焦炭酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌去离子

4、水：用 DEPC 50 L，加超纯水至 100 mL，室温过夜， 121高压灭菌 15 min，分装到 1.5 mL DEPC 处理过的离心管，冻存备用。75%乙醇：取新开启的无水乙醇 75 mL，加 DEPC 水至 100 mL，混匀，-20预冷。溴化乙锭 （EB）：取 1.0 g 溴化乙锭，加去离子水，定容至 100 mL。充分溶解后的溴乙锭溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存，其工作浓度为 0.5 g /mL。1TAE 缓冲液：取 242 g 羟基甲基氨基甲烷（Tris）、37.2 g 二水乙二铵四乙酸二钠、57.1 mL 冰乙酸，加去离子水定容至 1 L，配置成 50TAE 电泳缓冲液；量

5、取 20 mL 的 50TAE 电泳缓冲液，加入去离子水定容至 1 L，室温保存。1%琼脂糖凝胶：称取 1.0 g 琼脂糖，加入 1TAE 电泳缓冲液 100 mL，轻轻混匀后加热，使琼脂糖完全熔化。待琼脂糖胶冷至 5060时，加 EB 溶液（终浓度 0.5 g/mL）或 5 L 核酸染料，摇匀后倒入制胶板中，厚度为 3 mm5 mm，室温凝固后取下电泳梳子，备用。DNA 相对分子质量标准物 Marker：DL 2000。10加样缓冲液：称取 25 g 聚蔗糖、0.1 g 溴酚蓝、0.1 g 二甲苯青，加入灭菌双蒸水定容至100 mL。商品化的一步法实时荧光 RT-PCR 反应试剂盒。One

6、Step Prime Script RT-PCR Kit（Perfect Real Time，TAKARA)，含有 RT-PCR 缓冲液，酶混合物，dNTP 混合物，无 RNA 酶的水等。M-MLV 反转录酶。RNA 酶抑制剂。TaqDNA 聚合酶。dNTPs。引物：RT-PCR 扩增引物,见表 1；实时荧光定量 RT-PCR 引物和探针，见表 2。表1 RT-PCR 扩增引物引物名称引物序列DTMUV引物P15- GCAACCAGGCAAAGAGGTCATA -3DTMUV引物P25- AAGTGAGCCTCATCCATAATGAACA -3表2 实时荧光定量 RT-PCR 引物和探针引物名

7、称引物序列(5-3)DTMUV 引物 P3AAGTCAGGCCAGGGAATCCDTMUV 引物 P4CATGCACCCAGATTTGTTAACCDTMUV探针FAM-CCGTCATCCAACATC-MGB操作步骤与结果判定样品采集与处理组织器官用无菌镊子和剪刀采集患病或病死禽类各种组织与器官（肝脏、卵巢、脑、脾脏、胸腺等）， 装入一次性塑料袋或其它灭菌容器，编号。取待检组织样品适量（0.1g），按1:5 倍（W/W）加入无菌 0.1M PH 7.4 PBS，于灭菌并烘干的研钵或组织匀浆器中充分研磨，反复冻融2次后，4 ，3000 r/min 离心5 min，取上清1 mL转至无菌的 1.5

8、mL离心管中液，编号备用。抗凝血、血清抗凝血用无菌注射器直接吸取全血，加入含抗凝剂（除肝素外）的抗凝管中，充分混匀，编号备用。血清用无菌注射器直接吸取全血，自然凝固，3000 r/min 离心5 min，取上清液。咽拭子、肛拭子用无菌棉签刮取家禽的咽部或泄殖腔粘膜，放入含0.1 M PH 7.4 PBS的离心管内。3000 r/min 离心5 min，取上清液，编号备用。样品保存制备样品在冷藏条件不宜超过4 h，长期保存应放入-70保存。RNA 提取设立阳性、阴性样品对照，阳性对照为灭活的鸭坦布苏病毒感染 SPF 鸡胚尿囊液或者感染禽的组织，阴性对照为正常 SPF 鸡胚尿囊液或者正常禽组织。按

9、下列步骤完成 RNA 提取，也可采用商品化 RNA 试剂盒提取：样品处理好后，在样品处理区，取 n+2 个 1.5 mL DEPC 处理过的灭菌离心管，其中 n 为待检样品数、1 个阳性对照管和 1 个阴性对照管，对每个管进行编号标记；取 250 L 匀浆液，加入 750 L RNA 提取试剂 Trizol 置入一个 1.5 mL 离心管，震荡数次， 静置 5 min；加入 200 L 预冷的氯仿，震荡混匀，室温静置 5 min，412 000 r/min 离心 15 min；吸取上层水相至一新离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温静置 15 min，4 12 000 r/min 离心 15

10、min，离心后在离心管边和底部可见有胶样 RNA 沉淀，弃上清；吸弃上清，加入 500 L 75%乙醇，小心颠倒以漂洗沉淀及管壁，清洗 2 次，4 12 000 r/min 离心 5 min；吸弃上清，沉淀置室温条件下干燥后，加入 20 L DEPC 处理水溶解；提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增；若需长期保存，需置于-70冰箱保存。RT-PCR 反应一步法 RT-PCRRT-PCR 反应体系设立阴性对照和阳性对照，按顺序加入表3中的成分。表3 一步法 RT-PCR 反应体系试剂体积2一步法RT-PCR缓冲液12.5 LDTMUV引物P1（20 mol/L）0.5 LDT

11、MUV引物P2（20 mol/L）0.5 L表3（续）试剂体积RNA提取液2.0 L酶混合液1.0 LDEPC水8.5 L反应条件反转录：50 30 min；预变性：94 2 min；扩增：94 30 s，56 30 s，72 30 s， 共30个循环。72 延伸10 min。两步法 RT-PCR反转录取5 L RNA提取液, 加1 L DTMUV引物P2，70水浴5 min；冰浴2 min，继续加入表4中的成分， 37 水浴1 h，合成cDNA，取出直接进行PCR或置-20保存。表4 反转录反应体系试剂体积5反转录反应缓冲液4 L0.1 mol/L DTT2 L2.5 mmol/L dNTP

12、s2 LM-MLV反转录酶0.5 LRNA酶抑制剂0.5 LDEPC水5 LPCR 反应体系先加入去离子灭菌水，然后再按照顺序逐一加入表5中成分，每一次都应加入到液面以下。全部加完后，混匀，瞬时离心，使液体沉降到PCR管底。表5 PCR 反应体系试 剂体 积反转录产物1.25 LDTMUV引物P1（20 mol/L）0.5 LDTMUV引物P2（20 mol/L）0.5 L10PCR Buffer2.5 L2.5 mmol/L dNTPs2 LTaqDNA聚合酶0.25 L灭菌去离子水18 L反应条件预变性：94 3 min；扩增：94 30 s，56 30 s，72 30 s，循环30次；7

13、2延伸10 min。电泳反应结束后，分别取5 L各检测样品及阳性和阴性对照样品RT-PCR产物并与0.5 L加样缓冲液（10 Loading buffer）混合，然后加入到1.0 %琼脂糖凝胶板的加样孔中，随后加DNA分子量标准；以5 V/cm 的电压进行电泳，30 min后在紫外凝胶成像系统观察结果、拍照、记录。结果判定阳性对照扩增出 567 bp 目的条带，且阴性对照无相应目的条带，判定试验成立，否则试验无效。被检测样品扩增出567 bp目的条带，判定为阳性；未扩增出567 bp目的条带，判定为阴性。实时荧光定量 RT-PCR反应体系设立阴性对照和阳性对照，按顺序加入表6中的成分。全部加完

14、后，轻轻吹打混匀，500 r/min 离心 30s，使液体沉降到PCR管底。表6 荧光定量 RT-PCR 体系试剂体积浓度2One Step RT-PCR Buffer10 L1TAKARA ExTaq HS(5U/l)0.4 L2UPrime Script RT EnzymeMix0.4 L/10M DTMUV引物P30.4 L0.2 M10M DTMUV引物P40.4 L0.2 M50ROX Reference Dye0.4 L110M DTMUV探针0.8 L0.4 MRNA提取液2 L/灭菌去离子水5.2 L/反应条件反转录：42 5min；预变性：95 10 s；扩增：95变性5 s；58延伸31 s，共40个循环，58 延伸时采集荧光信号。荧光素的设定Report Dye设定为FAM，Quencher Dye 设定为MGB或 none。结果判定阈值设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器