伽玛刀对红藻酸致痫大鼠学习记忆能力的影响

1、伽玛刀对红藻酸致痫大鼠学习记忆能力的影响【摘要】目的：观察丁酸钠对食管癌EC970名田胞增殖、细胞周期及NDRG蛋白表达的影响.方法：采用0.5mmol/L丁酸钠作用于食管癌EC970名田胞，用MT砧检测处理不同时间时细胞增殖的变化，采用流式细胞仪检测细胞周期的变化，采用免疫组化方法检测NDRG蛋白表达的变化.结果：MTT实验结果显示，丁酸钠作用15d时各组吸光度均低于对照组，经统计学处理差异有显著性意义(P0.05)；丁酸钠不同作用时间的细胞增殖抑制率分别为：1d组21.2%，3d组23.5%，5d组25.6%，且随作用时间延长抑制率升高.细胞周期检测结果为(衿:G1期细胞：对照组57.00

2、1.10,1d组63.100.78,3d组67.200.58,5d组69.700.64;S期细胞：对照组25.300.27,1d组20.200.66,3d组20.400.82,5d组20.900.50;M期细胞：对照组17.201.00,1d组16.700.69,3d组12.100.41,5d组9.400.23.各组G1期结果分别与对照组结果比较，差异有显著性意义(P0.01).丁酸钠可上调NDRG蛋白表达水平，随作用时间增长蛋白表达增强.结论：丁酸钠可抑制食管癌细胞增殖，这一作用可能与NDRG蛋白表达增加有关.【关键词】食管肿瘤；肿瘤细胞；NDRG基因；丁酸钠0引言丁酸钠是一种四碳脂肪酸盐，

3、是重要的肠道黏膜营养剂.研究证实丁酸钠能抑制胃癌、肝癌、结肠癌等肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞分化，改变瘤细胞形态结构及基因表达，诱导细胞凋亡1-3,因而丁酸钠作为一种极具潜力的抗癌药物越来越受到关注.NDRG1基因是一种与细胞分化有关的基因，升高其表达可抑制肿瘤细胞的增殖4-5.我们采用MT馁验及流式细胞技术检测丁酸钠作用于食管癌EC970名田胞后细胞增殖和细胞周期的变化，并观察丁酸钠对NDRG衰达的影响，为丁酸钠用于食管癌诱导分化治疗提供理论依据.1材料和方法材料食管癌EC9706细胞系由中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室赠送.丁酸钠（servafeinbiochemicaheid

4、elberg公司）,RPMI1640细胞培养基（GibcoBRL公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），羊抗人NDRG修克隆抗体（SantaCruz生物技术公司），丫咤橙（Sigma公司），CO洲育箱（美国FormaScientific公司），流式细胞仪（德国PartecPAS公司），Fax拟250酶标仪（英国Stat公司）.方法细胞培养将人食管癌EC9706细胞单层贴壁生长于含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中，种植于含盖玻片的六孔板及75cm2培养瓶中.37C,50mL/LCO2培养箱中培养，隔日换液，取对数生长期细胞进行试验.MTT实验取对数生长期的EC9706细胞，调

5、整细胞密度为7.5X107/L,按每孔0.2mL接种于96孔细胞培养板中.设空白对照组和0.5mmoL/L丁酸钠实验组，每组均设10个复孔.实验终止前4h向细胞液中加入MTT20wL,细胞被染色后以二甲亚碉200wL溶解甲瓒颗粒，于酶标仪上测定A492nm.实验重复2次.细胞抑制率=（A对照-A实验）/A对照X100%.丁酸钠处理及细胞周期检测用RPMI1640培养液将丁酸钠调终浓度为0.5mmol/L,对照组为不含丁酸钠的培养液.取丁酸钠作用1,3,5d的细胞爬片及对照组细胞爬片从六孔板取出后经pH7.4的PBS冲洗，800mL/L丙酮固定30min后用中性树胶黏于载玻片上，4保存，用于免疫

6、组化实验.分别取丁酸钠作用1,3,5d的细胞进行如下处理：培养瓶中的细胞经pH7.4的PBS冲洗后加入2g/L胰蛋白酶消化，离心后用预冷的PBS洗涤2次，加入700mL/L乙醇1.0mL固定细胞用于细胞周期测定.上机前将细胞离心洗涤制成单细胞悬液,加丫啶橙染色,暗室放置,300目尼龙膜过滤,用流式细胞仪检测细胞周期分布.细胞免疫组织化学染色采用SP试剂盒进行免疫组化实验.按说明书步骤进行操作，DAB显色，苏木素复染，光镜观察细胞显色强度.结果判定：在高倍镜下观察免疫组化着色情况，以信号强弱评定NDRG衰达的强弱.统计学处理：采用SPSS11.0软件进行统计学处理，数据均采用x士s表示，检验水准

7、X=0.05.2结果MTT检测不同时间的各组平均吸光度值均低于对照组，其差异有显著性意义（P0.05，表1）；随丁酸钠作用时间延长，其抑制率升高.表1丁酸钠对人食管癌细胞EC9706的增殖抑制作用确良（略）丁酸钠对食管癌细胞细胞周期的影响实验组G1期细胞比例与对照组比较明显增高，而S,M期细胞比例减少，经统计学处理，差异有显著性意义（P0.01,表2）.表丁酸钠对食管癌EC970名田胞周期的影响（略）2.3丁酸钠对食管癌细胞NDRG11白表达的影响免疫组化染色结果显示，在作用15d时，细胞胞质黄色着色较对照组明显加深，且随作用时间延长而增强（图1）.讨论食管癌是人类常见的消化道恶性肿瘤，食管癌

8、的治疗方法除手术治疗、放疗等方法外，还有许多新的治疗方法，如基因治疗、免疫治疗、抗血管生成治疗、诱导分化治疗等6.其中诱导分化治疗是肿瘤化学治疗的一个新领域.诱导分化是指恶性肿瘤在体内外分化诱导剂存在下，细胞恶性行为降低，恶性表性发生改变，形态学趋于正常，呈现出向良性或趋向良性细胞分化的现象.利用分化诱导剂可使肿瘤细胞部分或全部恢复分化潜能，转变为正常细胞或导致细胞凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的.我们的结果表明，丁酸钠作用15d后细胞增殖的抑制率由17.4%曾力口至U23.8%,表明丁酸钠可抑制食管癌细胞增殖，实验中增高丁酸钠浓度至1mmol/L23d（结果未列出），可见培养的细胞死亡显著增多，

9、说明其抑制率随丁酸钠浓度增加而升高；具增殖抑制作用与丁酸钠使食管癌EC9706细胞细胞周期发生变化有关，丁酸钠可使G1期细胞增加；S期细胞比例、M期细胞比例显著降低，从而使细胞增殖周期延长，导致细胞增殖减慢.丁酸钠作用于食管癌EC970名田胞后，NDRG1的蛋白表达水平显著升高，而升高NDRG基因表达可抑制结直肠癌细胞增殖，促进其分化4-5,因此丁酸钠对食管癌细胞的增殖抑制作用可能与NDRG候达增力口有关，NDRG基因表达升高可促进p53基因介导的细胞增殖抑制和细胞凋亡过程7.目前，丁酸钠对食管癌细胞NDRG基因表达调控的机制尚不清楚.Guan等8研究表明，NDRG1的表达部分受DNA甲基化调

10、控，同时三丁酸甘油酯、TrichostatinA（一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂）等对组蛋白去乙酰化酶有抑制作用的物质可诱导NDRG的表达及许多不同类型细胞株的分化9.丁酸钠是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可引起细胞核内多种变化，包括组蛋白的超乙酰化、DNA的甲基化及非组蛋白的修饰.其中以组蛋白的超乙酰化最为重要，与基因表达和抑制细胞生长有关.而组蛋白超乙酰化可导致DN解口组蛋白分离，使转录因子激活某些基因10-11.丁酸钠可能是通过这种机制诱导NDRG基因表达，进而抑制食管癌EC970名田胞生长，并诱导细胞分化.【参考文献】1狄茜，李扬，赵雪俭，等.丁酸钠对前列腺癌PC3M细胞的增殖抑制和凋亡诱导

11、作用J.吉林大学学报(医学版),2004,30(5):710-712.HinnebuschBF,MengS,WuJT,etal.TheeffectsofshortchainfattyacidsonhumancoloncancercellphenotypeareassociatedwithhistonehyperacetylationJ.JNutr,2002,132(5):1012-1017.MunsterPN,TrosoSandovalT,RosenN,etal.Thehistonedeacetylaseinhibitorsuberoylanilidehydroxamicacidinduces

12、differentiationofhumanbreastcancercellsJ.CancerRes,2001,61(23):8492-8497.VanBelzenN,DinjensWN,DiesvaldMP,etal.AnovelgenewhiehisupregulatedduringcolonepithelialcelldifferentiationanddownregulatedincoloreetalneoplasmsJ.LabInvest,1997,77(1):85-92.KurdistaniSK,AriztiP,ReimerCL,etal.Inhibitionoftumorcell

13、growthbyRTP/rit42anditsresponsivenesstop53andDNAdamageJ.CancerRes,1998,58(19):4439-4444.6李沛，凌志强，杨洪艳，等.食管癌基因表达谱及其与细胞分化的相关性研究J.第四军医大学学报，2006,27(9):821-824.SusanneS,EmilyK,ThomasBH,etal.NDRG1IsNecessaryforp53dependentApoptosisJ.JBiolChem2004,279(47):48930-48940.GuanRJ,FordHL,FuY,etal.Drg1asadifferentia

14、tionrelated,putativemetastaticsuppressorgeneinhumancoloncancerJ.CancerRes,2000,60(3):749-755.HinnebuschBF,MengS,WuJT,etal.TheeffectsofshortchainfattyacidsonhumancoloncancercellphenotypeareassociatedwithhistonehyperacetylationJ.JNutr,2002,132(5):1012-1017.YoshidaM,FurumaiR,NishiyamaM,etal.HistonedeacetylaseasanewtargetforcancerchemotherapyJ.