肺炎球菌免疫血清库的建立及应用

1、 肺炎球菌免疫血清库的建立及应用刘倩，张丽芝，张新庄，任克明，陈晓航，王剑虹，张钦，沈荣 兰州生物制品研究所有限责任公司第一研究室 甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃 兰州730046摘要：目的 建立24个血清型的肺炎链球菌（简称肺炎球菌）免疫血清库，为肺炎球菌疫苗中各型多糖含量准确测定提供可靠保障。方法 制备肺炎球菌各型免疫血清：用肺炎球菌菌株制备免疫原，按免疫程序接种青紫蓝兔，将符合规定的免疫血清合并、除菌、分装后建档。鉴定肺炎球菌各型免疫血清：全程采用速率散射比浊法进行鉴定。首先确定肺炎球菌免疫血清工作浓度，再通过特异性和线性对免疫血清进行初步筛查（将筛出有交叉反应的免疫血清进行吸收），然

2、后用血清交叉试验进行再次筛查，最后通过绘制反应曲线（截取多糖质量浓度1.0 5.0 g/mL的线段）对免疫血清进行线性评定。肺炎球菌免疫血清库的应用：用建成的肺炎球菌免疫血清库中各型免疫血清和丹麦国家血清研究所的诊断血清，检测5个厂家的23价肺炎球菌多糖疫苗的各型多糖含量，对比结果。结果 建成的肺炎球菌免疫血清库各型免疫血清效价较高；初步筛出的有交叉反应的免疫血清，经吸收后交叉反应消失且线性良好（R20.98）；通过血清交叉试验再次筛查，未见有交叉反应的免疫血清；反应曲线线段（多糖质量浓度1.0 5.0 g/mL）线性良好（R20.98）；应用两套血清检测23价肺炎球菌多糖疫苗的多糖含量，差异

3、无统计学意义（P 0.05）。结论 成功建立了肺炎球菌免疫血清库，且各型免疫血清稳定、无交叉反应，可用于肺炎球菌疫苗及其疫苗血清型多糖的各项免疫学检测。关键词: 肺炎球菌免疫血清；血清型；多糖；血清库；速率散射比浊法中图分类号: R378 文献标志码: A 文章编号： DOI:Set up a pneumococcal antisera bank and related applicationLIU Qian, ZHANG Li-zhi, ZHANG Xin-zhuang, REN Ke-ming, CHEN Xiao-hang, WANG Jian-hong，ZHANG Qin, SHEN

4、rongFirst Department of Research, Lanzhou Institute of Biological Products Co., Ltd., Center for Gansu Provincial Vaccine Engineering Research, Lanzhou 730046, Gansu Province, ChinaCorresponding author: SHEN rong, E-mail:rshen guaranteeAbstract:Objective A pneumococcal antisera bank contained 24 ser

5、otypes of antiserums was set up, in order to provide a reliable guarantee in accurate determination of related polysaccharides contents in streptococcus pneumoniae vaccine. Methods All types of pneumococcal antiserums were prepared by using each serotype of pneumococcal strains as immunogen, respect

6、ively, the Chinchilla rabbits were immunized according to immunization schedule. The antiserums were mixed, filter-sterilized, aliquoted certified, then filing. The identification was carried out by rate nephelometry. First, the working concentration of pneumococcal antisera was determined. Secondly

7、 preliminary screening of antiserums were performed in both tests for specificity and linearity (the screened antiserums with cross-reaction were absorbed). Thirdly, all antiserums were performed by orthogonal test. Finally, each type of antiserum was evaluated linearity by plotting the reaction cur

8、ve (intercept the line segment of 1.0 - 5.0 g/mL of polysaccharide mass concentration). Application: twenty-three valent pneumococcal polysaccharide vaccine from 5 manufacturers were tested by the pneumococcal antisera banks, which included the set bank and the bank containing diagnostic serums form

9、 Statens serum institut, and the results were compared. Results The each type serum contained in pneumococcal antisera bank has a higher titer, and the cross-reaction was removed and showed a good linearity after absorption (R20.98). There was no cross-reaction in all antiserums screened by orthogon

10、al test. The response curve segment (the line segment of 1.0 -5.0 g/mL of polysaccharide mass concentration) showed a good linearity (R20.98), by using the two banks to detect the polysaccharide content in the vaccine, and tested difference had no a statistical meaning (P0.05). Conclusion The pneumo

11、coccal antisera bank was successfully prepared, and all of contained antiserums were stable and no cross-reaction, it can be used in immunological detection of pneumococcal vaccine and related types of polysaccharides . Key words: Pneumococcal antisera; Serotype; Pneumococcal vaccine; Sera bank; Rat

12、e nephelometry_ 基金项目：国家高技术研究发展计划项目（2012AA02A401）作者简介：刘倩（1984-）,女, 助理研究员, 主要从事细菌性多糖疫苗的研发工作。通信作者：沈荣,研究员, E-mail: rshen 肺炎链球菌（Streptococcus pneumonia）简称肺炎球菌，是引起儿童和老年人获得性感染的主要病原菌，其感染所致疾病主要包括肺炎、菌血症、脑膜炎、中耳炎等1。疫苗接种是预防肺炎球菌感染最有效的方法，目前上市的肺炎球菌疫苗主要有23价肺炎球菌多糖疫苗和13价肺炎球菌结合疫苗两类。根据欧洲药典规定，23价肺炎球菌多糖疫苗及13肺炎球菌结合疫苗均需采用免疫

13、学的方法对各型肺炎球菌荚膜多糖（pneumococcal capsular polysaccharide，PnPS）含量进行测定，且所用的各型肺炎球菌免疫血清均须为特异性血清2。PnPS是肺炎球菌疫苗的主要免疫原性成分，其含量的测定是肺炎球菌疫苗一项重要质量控制指标。因此，建立稳定、无交叉反应的肺炎球菌免疫血清库是控制肺炎球菌疫苗质量的关键因素。本研究拟建立包含1、2、3、4、5、6A、 6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22、23F、33F在内的24个疫苗血清型的肺炎球菌免疫血清库，并对其进行鉴定，用于PnPS含量的测定，

14、为控制肺炎球菌疫苗质量提供保障。现将结果报告如下。1材料与方法1.1 菌株 肺炎球菌菌株1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22、23F、33F型均由中国医学细菌保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC）提供。1.2 多糖及诊断血清 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22、23F和33F型PnPS均由兰州生物制

15、品研究所有限责任公司（简称兰州多糖）提供和购自美国菌种保藏中心（简称ATCC多糖），其中兰州多糖各项质量检定结果均符合欧洲药典中23价肺炎球菌多糖疫苗制造和检定规程的相关要求2 ，1H-NMR核磁检定结果与默克公司公布的结果一致；对应的肺炎球菌诊断血清均购自丹麦国家血清研究所（Statens serum institut，SSI），简称SSI血清。1.3疫苗 23价肺炎球菌多糖疫苗分别由厂家1、厂家2、厂家3、厂家4和厂家5提供（厂家1、厂家2和厂家3的疫苗为未上市疫苗；厂家3和厂家4的疫苗为已上市疫苗）。1.4 实验动物 SPF级青紫蓝兔，体重约2.5kg，由兰州生物制品研究所有限责任公司实

16、验动物室提供。1.5 主要试剂及仪器 8%羊血哥伦比亚琼脂平板培养基（固体培养基）购自甘肃荣昌生化制剂厂；胰蛋白酶大豆肉汤培养基（tryptic soy broth, TSB）购自德国Merck KGaA；液体培养基由兰州生物制品研究所有限责任公司第一研究室制备4。APPLIKON BIO 30L发酵罐购自荷兰APPLIKON公司；特定蛋白分析仪IMMAGE 800、UDR试剂盒、反应杯及配套的缓冲液、洗液均购自美国贝克曼库尔特公司。1.6 肺炎球菌各型免疫血清库的建立1.6.1免疫原的制备 将肺炎球菌菌株1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15

17、B、17F、18C、19A、19F、20、22、23F、33F型作为菌株分别传种于固体培养基上，然后刮取菌苔经液体培养基传种于发酵罐继续培养，将发酵罐收获的各型菌液用热灭活方式处理后，经 4 200 r/min离心半径（10.82cm）30 min，弃上清，收集菌体。生理盐水洗涤菌体两次，用比浊法将菌体浓度稀释至80亿/mL后分装备用。1.6.2免疫血清的制备 将制备好的免疫原（各型肺炎球菌）经兔耳缘静脉注射，基础免疫4周（免疫8次），加强免疫2周（免疫4次），免疫程序见表1。完成免疫程序后58 d经耳缘静脉采血，10 000 r/min离心半径（6.6cm）10 min收集上清，用生理盐水稀

18、释4倍后，以特定蛋白分析仪检测效价。当上清的反应浊度值400时，结束免疫，颈动脉采全血。待血清过夜析出后，经4 200 r/min离心半径（10.82cm）30 min，收集上清，加入0.01%硫柳汞溶液。将上述获得的肺炎球菌各型免疫血清分别合并，经0.2 m滤膜过滤、分装后，保存于-70 冰箱。表1 免疫程序Tab.1 Rabbit immunization schedule免疫类型免疫时间(周)免疫剂量（mL）免疫次数（次）基础免疫第1周0.2 2第2周0.4 2第3周0.7 2第4周1.0 2加强免疫第5周1.5 2第6周1.5 2注：每周注射时间为每周一和周五各注射1剂。1.6.3 免

19、疫血清的建档 对免疫血清进行建档，填写各项免疫血清信息（血清批号、采血日期、分装日期、血清总量、分装管数、血清效价）及最终鉴定结果。将鉴定后的肺炎球菌各型混合免疫血清命名为兰州肺炎球菌免疫血清库（简称Lanzhou血清库）。1.7 免疫血清的鉴定 采用速率散射比浊法5，确定肺炎球菌各型免疫血清的工作浓度，并通过特异性和线性对免疫血清进行初步筛查，用血清交叉试验进行再次筛查，最后通过绘制反应曲线（截取多糖质量浓度1.0 5.0 g/mL的线段）对免疫血清进行线性评价。1.7.1 溶液配制 PnPS参考品1：24个血清型的PnPS（兰州多糖）用生理盐水配制的终浓度为50.0 g/mL的24价混合溶

20、液；PnPS参考品2：24个血清型的PnPS（ATCC多糖）用生理盐水配制的终浓度为50.0 g/mL的24价混合溶液；空白对照：0.86%的生理盐水溶液；阳性对照：PnPS参考品1用生理盐水稀释为质量浓度5.0 g/mL的24价混合溶液；阴性对照：依照文献5制备不含本型 PnPS的阳性对照（如1型的阴性对照为不含1型PnPS的阳性对照）；1.0 5.0 g/mL PnPS参考品：将PnPS参考品1系列稀释成质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/mL的24价混合溶液，分别记为1.0 g/mL- PnPS参考品、2.0 g/mL- PnPS参考品等；PnPS单价原液：24个血清型

21、的PnPS（兰州多糖）分别用生理盐水配制的终浓度为5.0 mg/mL的单价原液；PnPS单价溶液：将24个血清型的PnPS单价原液稀释为质量浓度5.0 g/mL的单价溶液；样品：23价肺炎球菌多糖疫苗用生理盐水稀释20倍备用（质量浓度为2.5 g/mL）。1.7.2 参数设置 特定蛋白分析仪采用非竞争性速率模式，参考品或样品20 L，免疫血清20 L，缓冲液200 L，信号放大系数（Gain）4，反应时间2.5 min，每份血清重复检测2次。1.7.3免疫血清的工作浓度的确定 标准曲线绘制：将1.0 5.0 g/mL PnPS参考品与工作浓度的免疫血清先后放入仪器，在1.7.2项设定的参数条件

22、下进行检测；定标结束后产生仪器响应（instrumental response, IR），IR值与参考品设定点浓度进行一阶多项式曲线拟合，仪器自动生成标准曲线y=A+Bx，并显示线性回归方程和决定系数（R2）6-8。样品检测：将备用的样品放入仪器进行检测，检测结束后仪器会根据之前生成的标准曲线计算并打印结果。工作浓度的确定：将待测免疫血清用生理盐水稀释8倍（基础稀释倍数），根据仪器显示的决定系数（R2）不断上调待测免疫血清的稀释倍数，至R20.98且标准曲线最低质量浓度（1.0 g/mL- PnPS参考品）与空白对照的IR值差异有统计学意义（P0.98；标准曲线最低质量浓度（1.0 g/mL-

23、 PnPS参考品）与空白对照的IR值/均值的差异有统计学意义（P0.05），见表2。表2 免疫血清的工作浓度Tab.2 Working concentration of antisera血清型稀释倍数（倍）决定系数（R2）空白对照均值1.0 g/mL- PnPS参考品均值a1480.99432.1477.842320.99551.4759.353320.99600.24105.714320.99781.1554.635240.99133.4942.276A200.99541.9022.656B480.99941.9034.397F480.99911.1554.508320.99862.0789

24、.819N480.99954.4461.499V320.99981.5518.2210A200.99875.2073.5811A320.99460.3660.2312F320.99023.0451.9214160.99581.8681.3415B240.99312.0536.3917F240.99811.8435.2518C480.99423.9084.6519A480.99511.1059.1519F320.99503.0346.9220320.99871.7455.9322F200.99941.64 193.0523F200.99740.4538.0633F320.99621.7534.8

25、0注：a表示与空白对照相比，P0.05），表明通过特异性检验，初步筛查出6A、6B、19A和19F型免疫血清为有交叉反应的免疫血清，见表3。表3 各型免疫血清的特异性Tab.3 Specificity of antisera血清型空白对照均值阴性对照均值阳性对照均值1 1.60 3.43 402.272 3.74 9.76 543.523 2.14 2.78 583.164 3.22 5.50 330.005 4.54 3.31 216.986A 5.47 265.62a 366.646B20.47 438.76a 590.057F 2.241.00 338.888 7.613.89 536.

26、079N 2.262.81 379.999V 7.08 6.00 161.1710A 3.22 1.12 458.0711A 1.23 2.24 233.5512F 2.13 1.72 304.7014 3.87 8.15 468.6015B 3.65 2.02 267.6817F 1.58 6.63 230.2618C 1.92 2.77 600.0019A 4.85565.20a 714.7619F 7.55 275.62a 471.9020 1.21 3.44 284.7522F 0.00 0.001104.2023F 1.93 1.10 242.5833F 1.08 0.62 307.

27、53注：a表示与空白对照相比，P0.05）；但免疫血清的工作浓度也相应降低，见表4。表4 免疫血清吸收前后对比Tab.4 Comparison of antisera before and after absorption血清型吸收前吸收后工作浓度（倍）空白对照均值阴性对照均值阳性对照均值工作浓度（倍）空白对照均值阴性对照均值a阳性对照均值6A20 5.47265.62366.6441.183.40229.266B4820.47438.76590.05161.473.44254.6419A48 4.85565.20714.76161.482.85497.1619F32 7.55275.6247

28、1.90161.560.00303.60注：a表示与空白对照相比，P0.05（采用秩和检验，Z=1.095，P=0.273） 。吸收前后免疫血清的线性回归分析结果显示，在设定条件下，1.0 5.0 g/mL PnPS参考品与相应IR值呈良好的线性关系，R20.98，见图1。注: 1a表示吸收前，4条标准曲线所对应方程及R2值： 6A型：y = 77.582x - 29.516，R = 0.9934；6B型：y = 105.88x - 67.393，R = 0.9969；19A型：y = 157.59x - 86.91，R = 0.9974；19F型：y = 127.26x - 44.093；R

29、 = 0.9988。 1b表示吸收后，4条标准曲线所对应方程及R2值： 6A型：y = 51.10 x - 26.652，R = 0.9954；6B型：y = 54.889x - 10.447，R = 0.9978；19A型：y = 109.39x - 65.479，R = 0.9973；19F型：y = 70.598x - 43.272；R = 0.9983。图1 吸收前后免疫血清的线性回归分析Fig.1 Linear regression analysis of antisera before and after absorption 2.1.4 血清交叉试验 结果显示，所有免疫血清（包括

30、无交叉反应血清和吸收血清）与本型 PnPS单价溶液反应值较高（IR值160）；和非本型 PnPS单价溶液反应值较低（IR值0.05），见表5。表明通过血清交叉试验的最终鉴定，未发现有交叉反应的免疫血清。表5 免疫血清的血清交叉试验Tab.5 Orthogonal test of antisera 血清型PnPS单价溶液（5.0 g/mL）123456A6B7F89N9V10A11A12F1415B17F18C19A19F2022F23F33F空白a1412.43.16.74.52.42.11.52.14.72.21.72.01.12.11.81.81.81.01.92.52.01.80.91.

31、82.120.0523.90.72.11.31.21.21.00.80.21.11.11.51.20.02.12.52.12.81.96.91.51.61.51.530.00.2560.30.04.83.90.42.10.40.40.20.40.10.50.40.60.00.10.22.59.81.20.81.30.242.31.51.6330.00.80.60.40.62.12.30.90.90.90.10.20.40.70.20.20.30.30.60.90.51.253.01.45.52.8216.92.71.65.43.23.51.11.11.32.62.71.41.71.03.50.

32、81.90.32.32.43.56A2.01.43.31.51.2295.82.12.12.01.71.91.51.11.81.51.72.02.12.20.12.11.11.01.33.16B4.20.30.60.41.53.9295.02.52.22.41.50.20.55.12.83.12.22.30.62.59.81.20.81.31.27F1.12.310.31.72.41.62.5338.02.62.23.51.83.63.93.44.02.91.32.21.41.71.92.24.62.182.53.09.41.91.41.92.30.8536.01.31.72.22.51.91

33、.41.91.92.41.30.72.91.12.90.54.49N1.61.51.41.31.52.42.02.31.0379.02.11.52.710.71.91.41.41.22.51.51.92.53.80.31.69V4.32.73.71.63.22.01.14.82.83.4161.02.63.12.53.43.02.72.62.83.02.31.45.43.15.210A2.22.51.31.51.20.61.81.21.71.00.2458.00.70.80.40.30.20.50.20.10.20.70.10.40.411A2.33.12.62.84.93.32.74.83.

34、13.22.04.0233.02.42.02.33.63.83.83.02.13.23.63.03.012F2.14.07.63.94.01.53.24.62.73.54.03.91.4304.04.14.73.92.09.22.63.01.12.52.41.9142.34.03.03.51.85.32.15.12.02.03.21.42.00.9468.01.72.84.11.85.73.32.92.44.82.115B4.32.62.23.01.81.50.93.55.81.13.14.65.27.11.6267.01.92.12.16.31.71.41.62.41.817F3.72.04

35、.60.81.21.53.86.53.11.71.11.52.44.26.05.7230.01.83.13.42.53.92.02.83.918C0.03.72.32.20.31.21.23.20.92.20.70.50.70.61.71.12.9600.00.70.60.32.51.90.01.119A2.82.33.23.03.32.22.22.31.52.82.40.63.13.22.72.36.81.9357.82.32.93.72.91.93.019F0.71.97.82.12.44.04.42.22.52.93.22.62.22.03.411.82.92.93.8459.01.91

36、.41.81.61.7204.97.52.94.62.32.92.40.72.21.72.02.11.53.92.03.31.42.10.73.5284.02.42.54.91.622F5.52.21.22.01.30.00.53.02.35.70.83.50.62.01.20.31.02.20.60.71.1393.01.29.70.523F3.91.53.63.22.81.63.53.22.52.02.92.12.92.12.44.04.14.91.85.01.23.3242.03.31.833F2.85.94.44.84.33.84.53.42.94.63.23.03.11.83.23.

37、42.22.74.42.75.22.52.7307.02.5注：a表示空白对照IR值与非本型 PnPS单价溶液IR值相比，P0.05（采用Dunnett T3检验）。2.1.5 免疫血清反应曲线 免疫血清分别与PnPS参考品1和PnPS参考品2的反应曲线，其中图2a和2b分别为兰州多糖和ATCC多糖3、4、5、8、9N、11A、17F、18C型的反应曲线，该组血清型的最高反应点均低于10.0 g/mL；图2c和2d分别为兰州多糖和ATCC多糖6B、9V、12F、14、15B、20、22F和23F型的反应曲线，该组血清型的最高反应点均为10.0g/mL；图2e和2f分别为兰州多糖和ATCC多糖1

38、、2、6A、7F、10A、19A、19F、33F型的反应曲线，该组血清型的最高反应点均高于10.0 g/mL。见图2。 注：2a、2c、2e为兰州多糖；2b、2d、2f为ATCC多糖。图2 免疫血清的反应曲线Fig.2 Reaction curves of antisera 在免疫血清的反应曲线（图2a、2c、2e）中，取多糖质量浓度1.0 5.0 g/mL的线段作线性回归分析。结果可见，各型免疫血清在多糖质量浓度1.0 5.0 g/mL时线性良好，R20.98，且标准曲线最低浓度（1.0 g/mL- PnPS参考品）与空白对照的IR值差异有统计学意义（P0.05（采用秩和检验，Z=4.197

39、，P=0.000）。2.2 肺炎球菌免疫血清库的应用 结果显示，用Lanzhou血清库和SSI血清分别检测来自5个厂家的23价肺炎球菌多糖疫苗的各型多糖含量，两种不同来源血清检测结果的差异无统计学意义（P0.05），CV值0.05（采用配对t检验，t值分别为0.725、0.524、2.38、0.241、0.695；P值分别为0.476、0.606、0.126、0.812、0.495）。3 讨 论 PnPS是肺炎球菌疫苗的主要免疫原性成分，PnPS含量的测定是肺炎球菌疫苗一项重要质量控制指标。肺炎球菌疫苗中各型PnPS免疫原性的分析完全依赖于特异性肺炎球菌免疫血清，稳定、无交叉反应的肺炎球菌免疫

40、血清库是控制肺炎球菌疫苗质量的关键因素。 速率散射比浊法是一种抗原-抗体结合反应的动态测定法，其快速灵敏，优于传统的免疫学检测方法（如免疫双扩散，凝集试验等）；不受带电抗原的限制，在中性多糖（如 7F、14、22F、33F型PnPS）检测方面优于火箭电泳法10-11。本研究全程采用速率散射比浊法用于肺炎球菌免疫血清库的建立和鉴定。用速率散射比浊法确定肺炎球菌各型免疫血清的工作浓度，结果显示在此工作浓度下，标准曲线线性良好，R20.98；且标准曲线最低浓度（1.0 g/mL- PnPS参考品）与空白对照的差异有统计学意义（P0.05），符合中国食品药品检定研究院对肺炎球菌各型免疫血清的考核标准，

41、即“非特异反应的IR值均低于特异性反应的10%，低于空白对照的23倍，最低稀释度的浊度值均高于空白对照的23倍” 。血清交叉试验证明，用速率散射浊度法检测混合溶液中的目标多糖含量时，肺炎球菌各型免疫血清中所含其他非特异性物质不会对试验结果造成影响。 为全面考察肺炎球菌各型免疫血清的反应性，使用Lanzhou多糖和ATCC多糖绘制反应曲线。结果证明，无论使用何种来源的多糖，免疫血清的反应趋势基本一致。这不仅说明各型免疫血清的反应性比较稳定，还表明lanzhou多糖和ATCC多糖的抗原性基本一致。多数多糖在质量浓度为0.3 50.0 g/mL时与对应血清的反应强度呈正相关（越过反应最高点，多糖浓度越高，反应浊度值越低，这是因为出现了抗原过量的情况），尤其是多糖质量浓度在1.0 5.0 g/mL时线性良好（R20.98）。因此在这个质量浓度范围内做定量标准曲线是可行的，定量结果也比较准确。 用Lanzhou血清库和SSI血清分别检测来自国内外5个厂家提供的23价肺炎球菌多糖疫苗的各型多糖含量，并将检测结果进行比较，差异均无统计学意义（P0.05）。证明本实验室制备的肺炎球菌免疫血清库（Lanzhou血清库）可替代SSI血清进行23价肺炎球菌多糖疫苗的各型多糖含量检测。截止2017年，Lanzhou血清库已包含24个肺