Alport综合征：从基础到临床课件

1、Alport综合征：从基础到临床Alport综合征遗传性肾脏疾病临床表现: 血尿、感音神经性耳聋、听力减退、眼部异常进行性肾功能衰竭预后差大多数为 X连锁显性遗传（XLAS），由编码IV型胶原5 链的COL4A5基因突变所致主要问题 诊断 花费少 更有效 创伤小分子生物学发病机制Alport综合征Alport综合征:从基础到临床诊断通过皮肤穿刺进行临床诊断通过mRNA分析进行基因诊断机制 COL4A5基因突变后mRNA的表达量IV型胶原5 链甘氨酸替代的影响Alport综合征:从基础到临床通过皮肤穿刺进行临床诊断通过mRNA分析进行基因诊断COL4A5基因突变后mRNA的表达量IV型胶原5链甘

2、氨酸替代的影响Alport综合征:从基础到临床通过皮肤穿刺检测进行临床诊断通过mRNA分析进行基因诊断COL4A5基因突变后mRNA的表达量 IV胶原5链甘氨酸替代的影响临床诊断肾穿电镜-“金标准” GBM:增厚、变薄以及致密层的分裂年龄太小的患儿不能耐受既使在电镜下GBM也有不典型变化: 薄基底膜病的变化(年龄偏小的儿童和女性) 缺陷皮穿 方便 创伤小 31mm皮肤穿刺和5(IV)链染色诊断方法免疫荧光抗-5 (IV)链单克隆抗体正常:阳性XLAS男性：阴性XLAS女性:间断阳性丁洁，等：中华儿科杂志，35: 177, 1997 Ding Jie, et al: Chin Med J, 11

3、0: 584, 1997Alport综合征的临床诊断皮肤穿刺 抗IV胶原5链的单克隆抗体免疫荧光染色 皮肤基底膜 (EBM) 阴性: 男性XLAS 间断阳性: 女性XLAS 连续阳性: 正常人 个别XLAS 常染色体隐性患者（ARAS）EBM荧光染色 正常人XLAS男性XLAS女性ARAS1（IV）5（IV）肾穿组织荧光染色 正常人XLAS男性 ARAS1（IV）3（IV） 4（IV） 5（IV）皮肤穿刺 -IV型胶原5链免疫荧光染色诊断: 89家系, 199患者诊断率:96% Chin J Pediatr 1997; Pediatr Nephrol 2002Alport综合征的临床诊断 证实

4、COL4A5 基因突变:917GA 镜下血尿 偶有蛋白尿 Chin J Practic Pediatr 2003大多数:van der环, 36% (5/14) Kidney Int 1999 2(4%): EBM 5 (IV) 正常皮肤穿刺 -IV型胶原5链免疫荧光染色 年龄最小的1例: 1岁 第1例: 常染色体隐性 Chin J Pediatr 1999 血尿2年 无家族史 父母非近亲婚配 199例AS中2例为ARASAlport综合征临床诊断Alport综合征:从基础到临床通过皮肤穿刺进行临床诊断通过mRNA分析进行基因诊断COL4A5基因突变后mRNA的表达量IV型胶原5链甘氨酸替代的

5、影响Alport综合征:从基础到临床通过皮肤穿刺进行临床诊断通过mRNA分析进行基因诊断COL4A5基因突变后mRNA的表达量IV型胶原5链甘氨酸替代的影响基因诊断明确的遗传性疾病遗传方式: X连销显性遗传、常染色体隐性遗传和常染色体显性遗传基因诊断 遗传咨询 产前诊断 了解发病机制基因诊断基因组DNA分析: PCR-SSCP: 检测率 5079% Hum Mutat 1999; Am J Kidney Dis 2001PCR-直接测序: 检测率85% J Am Soc Nephrol 1998 COL4A5 基因大小: 250kb 基因结构: 51外显子 无 “热点突变”花费高 (51外显子

6、)已报道的检测率不高(不超过85%)2/3免疫荧光1/3皮肤成纤维细胞培养RNA提取新技术- 5(IV)链mRNA分析RT-PCR 5个相互重叠的片段皮肤穿刺方便创伤小31mm RT-PCR 电泳: 大的缺失/插入直接测序: 小的/点突变 通过基因组DNA证实新技术: 5(IV)链mRNA分析检测率: 90.3%3/28 (10.7%) 小的插入或缺失 12/28 (42.8%) 错义突变2/28 (7.1%) 无义突变4/28 (14.4%) 单体型7/28 (25.0%) 剪切突变 基因诊断 4/28 (14.3%) 典型的剪切位点 3/28 (10.7%) 不典型或隐藏的剪切位点Kidn

7、ey Inter, 67(4):1268-1274, 2005 不典型或隐藏的剪切位点:10% g.668-12GA- skipping E9 g.1036+5GT- skipping E14 g.1625+56_1625+57insC- partially skipping E21基因诊断被忽视或被认为是基因组DNA内含子的多态性基因诊断通过5(IV)链mRNA分析检测COL4A5基因突变 简单、创伤小 (1个皮肤样本) hair-root (鉴定24个突变) Hum Genet 2002 更经济 (费用仅为基因组DNA分析的1/61/7) 基因诊断通过5(IV)链mRNA分析检测COL4A

8、5基因突变:可信、一致每一个突变均在DNA水平进一步得到证实 Kidney Inter, 67(4):1268-1274, 2005 成纤维细胞没有可变剪切体其他组织 肾脏: 有41A和41B外显子 Kidney Int 1993 白细胞: 无41A和41B外显子 Pediatr Nephrol 2001 90.3% (28/31) XLAS患者突变检测 19 新突变Chin J Pediatr 1999; Pediatr Nephrol 2002; Chin J Nephrol 2003 基因诊断 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 3

9、5 37 39 41 43 45 47 49 51 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 COL4A5 基因53Alport综合征:从基础到临床通过皮肤穿刺进行临床诊断通过mRNA分析进行基因诊断COL4A5基因突变后mRNA的表达量IV型胶原5链甘氨酸替代的影响Alport综合征:从基础到临床通过皮肤穿刺进行临床诊断通过mRNA分析进行基因诊断COL4A5基因突变后mRNA的表达量IV型胶原5链甘氨酸替代的影响突变mRNA的表达量XLAS女性患者临床表现不一 大多数女性: 镜下血尿 无或轻

10、微蛋白尿 肾功能正常8-15% 肾功能衰竭（CRF） NDT 1990; Am J Kidney Dis 200140岁出现终末期肾衰（ESRD）: 大约12%60岁出现终末期肾衰: 大约30-40% J Am Soc Nephrol 2000日本报道: EBM中5(IV)表达阴性率和疾病的程度相关 J Am Soc Nephrol 1998突变mRNA的表达量XLAS 女性患者临床表现不一 家族之间肾脏疾病的严重程度明显不同推测X染色体随机或非随机失活所致?突变mRNA的表达量X连锁女性临床资料 PatentGross hematuriaMicroscopic hematuriaDegree

11、 of proteinuria Renal insufficiencyEBM 5 (IV) stainingLL Yes + + No MosaicLY No + + No MosaicSL No + -+ No MosaicWS Yes + - No MosaicZF No + + Yes MosaicZY No + + No Mosaic 方法成纤维细胞培养RNA提取RT-PCRPAGE光密度比值分析突变mRNA的表达量Normal band Mutant band突变mRNA的表达量PatientTimes of PCRRange of OD of normal fragmentRang

12、e of OD of abnormal fragmentRatio of mutant mRNA/total mRNALL8637010556, even no normal fragment38907544500.85LY8no normal fragment4715309401SL861742410211505290, even no abnormal fragment0.19WS4150002945811925208000.42ZF44601175956118352130.67ZY420952453565520227700.25光密度比值分析 突变mRNA的表达量蛋白尿和mRNA表达量的

13、关系突变mRNA的表达量结论:突变COL4A5 基因的mRNA表达量和 XLAS 女性患者的表型相关 XLAS女性患者突变COL4A5 基因的mRNA表达量多者表型更严重Alport综合征:从基础到临床通过皮肤穿刺进行临床诊断通过mRNA分析进行基因诊断COL4A5基因突变后mRNA的表达量IV型胶原5链甘氨酸替代的影响Alport综合征:从基础到临床通过皮肤穿刺进行临床诊断通过mRNA分析进行基因诊断COL4A5基因突变后mRNA的表达量IV型胶原5链甘氨酸替代的影响甘氨酸替代 发病机制假说: 突变的COL45A基因编码异常的5(IV) 链: 易降解 不能和其他的(IV)链形成复杂的网状结构

14、Medicine 1999 进一步的实验发现: 突变5(IV)连几乎不能和其他(IV)链形成三螺旋结构 或者:形成的三螺旋结构中含有突变的5(IV)链: 很少一部分 Kidney Int 2003甘氨酸替代35NC11430 aa 5(IV)链中2530%的甘氨酸 大约3040%突变涉及甘氨酸残基的替代 J Am Soc Nephrol 2000NH2229 aa（interrupted Gly-X-Y repeats） COOHNC1甘氨酸替代同一位点的甘氨酸被不同氨基酸替代 不同位点的甘氨酸被同一氨基酸替代 青少年型 AS 成人型 AS甘氨酸替代两例甘氨酸替代患者Glycine - SerineGlycine - Valine 方法质粒构建 pET-28a蛋白表达 E.Coli蛋白鉴定 immunoblot + mass spectrometry 圆二色普检测 甘氨酸替代 甘氨酸替代Blue: normal圆二色普检测green- G1030S (Adult-type) black- G1015V (Juvenile-type)甘氨酸替代 重组蛋白的二级结构组成（%） 研究对象 -螺旋