DOE试验设计在中药制药工艺研究中的应用

1、实验设计在制药工艺研究中的应用在制药工业中，提取溶媒浓度，溶媒倍量，提取时间，提取次数，药材粒度等多种因素都会影响药材中成分的提取率。解决类似问题实验设计流程如下： 可控因素不可控因素输入结果问题识别因子筛选试验设计实验执行数据分析结论建议提高成分提取率、增强药品稳定性等溶媒浓度、溶媒倍量、提取时间、提取次数、药材粒度、处方组成等单因素试验设计、析因试验设计（包括正交试验，均匀设计）。 设置因素个数、水平、重复次数时需综合考虑试验目的和工作量。直观分析、方差分析等综合指标的优劣和生产成本给出最佳工艺建议。有些情况需要进一步设计实验来明确尚不能确定的因素。为避免顺序误差，可以对试验顺序进行随机化

2、1.一次只改变一个参数，而其他参数都保持不变（One factor at a time），为减少未知因素造成的随机误差，每次改变需重复试验。单因素试验 2. 同时改变所有因素的试验设计，筛选因素对指标的影响（析因实验），是一 种多因素的交叉分组设计完全析因试验（全部因子的所有水平的所有组合都至少进行一次试验） 部分析因试验（包括正交试验，均因设计等）常用的试验设计方法影响试验结果的条件称为因素（Factor），因素所处的状态称为水平（Level），只考察一个因素的试验称为单因素试验。 适用于考察单一因素变化对结果的影响，方便考察较多的水平数，在明确某一因素（变量）对结果有主要影响时，可以采用该

3、试验设计方法考察该因素的不同水平对指标的影响。 例如：固定受热时间时，不同温度对药液中热敏成分降解率的影响；固定暴露时间时，不同环境湿度对药物粉末(颗粒)的吸湿影响；不同处方对固体制剂在RH75%下48h的吸湿增重影响；固定提取时间和提取次数时，溶媒倍量对提取率的影响；固定溶媒倍量和提取次数时，提取时间对提取率的影响；固定溶媒倍量和提取时间时，提取次数对提取率的影响； 单因素试验设计温度/6065707580提取率%8680837696单因素试验-I（每个水平只做一次试验）温度/607080908h降解率%12.1314.0619.0424.49例2.羊耳菊提取液中异绿原酸A的热稳定性考察例3

4、. 某中药不同温度浸提成分提取率相对湿度RH22.5%RH33.0%RH42.8%RH57.7%RH75.3%RH92.3%吸湿增重%4.285.076.188.0512.1616.55例1. 羊耳菊提取液中异绿原酸A的热稳定性考察特点：试验次数少，工作量小，有一定参考意义，但结果可靠性差。单一实验随机性较大，单次试验无法分析随机误差对结果的影响，因此单因素试验一般是需要有重复试验的，处方1处方2处方3处方4处方5重复111.128910.780911.070110.823213.4059重复211.424010.756710.941610.760913.3766重复311.191010.52

5、1110.888410.995013.6314平均11.24810.686210.966710.859713.4713例4.某药粉 RH75%环境72 h的吸湿百分率（%）影响因素：处方； 水平：5；每个水平重复次数：3；考察指标：吸湿百分率。单因素试验-II（每个水平重复若干次）特点：试验次数多，工作量大，可用统计学方法分析数据的可靠性。温度/6065707580提取率%8680837696898390819391889484959084858294平均提取率%8983.758880.7594.5单因素试验-II（每个水平重复若干次）影响因素：温度； 水平：5；每个水平重复次数：4；考察指标

6、：提取率。例5.某中药 不同温度浸提提取率（%）方差分析的意义：判读考察指标的变化是随机误差还是由因素水平变化造成的？即因素的不同水平对试验结果的影响有无显著意义。方差分析的一般步骤：（1）做出假设H0：各总体均值相等，在假设下，把各组（各个水平下）的全部试验数据看成是来自同一正态总体。算出总的离差平方和。（2）将总的离差平方和分解为两部分：组内离差平方和与组间离差平方和。将他们分别除以各自的自由度，得组内均方与组间均方。 （3）比较组间均方与组内均方的大小，计算前者对后者的比值。如果比值较大，超过一定的临界值，说明因素的水平改变对试验结果的影响显著地超过水机因素引起的差异，所以应该拒绝原假设

7、。反之，则不能拒绝原假设。单因素试验-方差分析相关概念第一类错误（typeerror），型错误： H0实际为真，而拒绝了它，这类“弃真”的错误称为第一类错误，犯这类错误的概率就是显著性水平。小概率事件： 小概率事件（即概率很小的时间）在一次试验中是几乎不可能发生的。为了对“小概率”的“小”有一个通用的尺度，习惯上树立一个“标”杆，将=0.01或=0.05视为“小概率”。 越小标志概率性质的反证法的推理水平越高么，故称为显著性水平，基于小概率原理的检验为显著性检验。总均值组内均值定义式：求解简化式：总离差平方和组内离差平方和组间离差平方和F值推导可得 解题过程：1.建立原假设H0：1= 2 =.

8、= k;即所有水平组无显著性差异。2. 根据上述公式计算得到F值，由给定的，查F分布表，得临界值F1-（k-1，n-k）3. 当F F1- ，则拒绝H0，即因素水平的变化对考察指标有显著影响。否则不拒绝H0可用Excel计算k1 k21234568122412345 678910 1112131415 16171819202122232425 2627282930 4060120161.418.5110.137.716.61 5.995.595.325.124.96 4.844.754.674.604.54 4.494.454.414.384.354.324.304.284.264.24 4.

9、224.214.204.184.17 4.084.003.923.84199.519.009.556.945.79 5.144.744.464.264.10 3.983.883.803.743.68 3.633.593.553.523.493.473.443.423.403.38 3.373.353.343.333.32 3.233.153.072.99215.719.169.286.595.41 4.764.354.073.863.71 3.593.493.413.343.29 3.243.203.163.133.103.073.053.033.012.99 2.982.962.952.93

10、2.92 2.842.762.682.60224.619.259.126.395.19 4.534.123.843.633.48 3.363.263.183.113.06 3.012.962.932.902.872.842.822.802.782.76 2.742.732.712.702.69 2.612.522.452.37230.219.309.016.265.05 4.393.973.693.483.33 3.203.113.022.962.90 2.852.812.772.742.712.682.662.642.622.60 2.592.572.562.542.53 2.452.372

11、.292.21234.019.338.946.164.95 4.283.873.583.373.22 3.093.002.922.852.79 2.742.702.662.632.602.572.552.532.512.49 2.472.462.442.432.42 2.342.252.172.09238.919.378.846.044.82 4.153.733.443.233.07 2.952.852.772.702.64 2.592.552.512.482.452.422.402.382.362.34 2.322.302.292.282.27 2.182.102.021.94243.919

12、.418.745.914.68 4.003.573.283.072.91 2.792.692.602.532.48 2.422.382.342.312.282.252.232.202.182.16 2.152.132.122.102.09 2.001.921.831.75249.019.458.645.774.53 3.843.413.122.902.74 2.612.502.422.352.29 2.242.192.152.112.082.052.032.001.981.96 1.951.931.911.901.89 1.791.701.611.52254.319.508.535.634.3

13、6 3.673.232.932.712.54 2.402.302.212.132.07 2.011.961.921.881.841.811.781.761.731.71 1.691.671.651.641.62 1.511.391.251.00F分布临界值表 F1- （k1，k2）， =0.05处方1处方2处方3处方4处方5重复111.128910.780911.070110.823213.4059重复211.424010.756710.941610.760913.3766重复311.191010.521110.888410.995013.6314平均11.24810.686210.96671

14、0.859713.4713方差0.0242 0.0206 0.0087 0.0147 0.0194 例4.某药粉 RH75%环境72 h的吸湿百分率（%）差异源离差平方和自由度均方F值F1-0.05 临界值P组间SA15.875343.9688226.78863.48P0.05组内S E 0.1753100.0175总计ST 16.050714Excel 计算 ST=VAR( 全部数据)*14 SE=VAR(处方1)*2+VAR(处方2)*2+.+VAR(处方5)*2 SA=ST-SE; F=(SA/4)/(SE/10); 查表F1-0.05 （4,10）临界值=3.48结果：F值大于F1-0

15、.05 临界值，不同辅料对该药粉的整体吸湿防潮性能的影响有显著性差异（P0.05）。方差分析表Excel计算供试品间比较SdLSD-tP 1-20.56170.10815.19570.0011-30.28130.10812.60190.051-40.38830.10813.59170.011-52.22330.108120.56740.00012-30.28050.10812.59450.052-40.17350.10811.60470.052-52.78510.108125.76380.00013-40.10700.10810.98980.053-52.50460.108123.16930.

16、00014-52.61160.108124.15910.0001自由度为组内误差自由度10，查t临界值表可得到下列分组配对比较的显著性。单因素试验-各组数据比较温度/6065707580提取率%8680837696898390819391889484959084858294平均提取率%8983.758880.7594.5方差4.6667 10.9167 24.6667 11.5833 1.6667 例5.某中药 不同温度浸提提取率差异源离差平方和自由度均方F值F1-0.05 临界值P组间SA 442.74110.6810.343.06P0.05组内S E 160.51510.7总计ST 603

17、.219方差分析表结果：F值大于F1-0.05 临界值，不同辅料对该药粉的整体吸湿防潮性能的影响有显著性差异（P B提取时间A溶媒倍量C提取次数正交试验设计举例-三因素三水平33-直观分析主要因素 次要因素C提取次数，B提取时间，A溶媒倍量 从直观分析可得出A3B3C3平均收率最高，即10倍量水，沸腾后提取1.5h，提取3次。但综合考虑提取效率和成本，提取时间从1小时与1.5小时提高量不足3%，溶媒倍量6倍与10倍相比提取量只提高5%，且在610倍溶媒倍量时，溶媒倍量对提取量影响最小，因此可选A1B2C3作为多囊卵巢综合征方的最佳提取工艺，即6倍水，沸腾后提取1小时，提取3次。本例中因素C的极

18、差最大（85.05）为主要因素；因素B极差较次（31.40）；因素B的极差最小（9.44）是否每个因素都要使用平均提取量最高的那个水平？ 如果能分清主要因素和次要因素，则主要因素取最高的水平，而次要因素可根据成本和效率综合考虑来选择适当的水平。实践中常常要求区分因素的主次，即比较不同因素对试验指标影响的相对大小，并在此基础上来确定各因素水平的的最佳搭配。直观分析的优点是简单、直观、计算量小，缺点是不能估计试验误差，因而不能回答个因素的水平变化对试验结果的影响是实质性的还是偶然性的。为了解决上述问题需要采用方差分析法。如果F值大于F1-临界值，则说明该因素对试验结果的影响有显著意义。正交试验设计

19、举例-三因素三水平33-方差分析因素偏差平方和自由度均方F比F临界值（=0.05）显著性（=0.05）A溶媒倍量S1 153.4276.70 0.83919B每次提取时间S2 1753.3412876.67 9.59319C提取次数S3 11049.2725524.64 60.45619 * 误差S4 182.76291.38 i 水平，j 列，nj该列同水平重复数主要因素 次要因素C提取次数，B提取时间，A溶媒倍量结论:方差分析显示影响因素的主次顺序和直观分析一致，且提取次数对结果的影响有显著意义（P0.05)。支持A1B2C3为最佳工艺， A1B1C3也可作为备选工艺。正交试验设计举例-三

20、因素三水平33-方差分析S4可认为只是随机因素引起试验误差SE所在列1234结果因素A加水倍量B每次提取时间C提取次数空白列(误差列)提取量实验160.51186.56实验26122176.83实验361.533211.54实验480.523146.05实验58131197.46实验681.512126.71实验7100.532189.8实验810113130.39实验9101.521178.34水平1 K1474.93422.41343.66462.36水平2 K2470.22504.68501.22493.34水平3 K3498.53516.59598.8487.98离差平方和153.41

21、753.34111049.27182.7638因素偏差平方和自由度F值F临界值（=0.05）显著性A溶媒倍量S1 153.420.83919B每次提取时间S2 1753.34129.59319C提取次数S3 11049.27260.45619 * P0.05误差S4 182.762Excel计算因素偏差平方和自由度F值F临界值（=0.05）显著性A溶媒倍量S1 153.420.83919B每次提取时间S2 1753.34129.59319C提取次数S3 11049.27260.45619 * P0.05误差S4 182.762方差分析时的误差合并因素偏差平方和自由度F值F临界值（=0.05）显

22、著性B每次提取时间S2 1753.341210.4319C提取次数S3 11049.27265.7419 * P0.5组内S E 278.86469.72总计ST 538.805Excel 计算 ST=VAR( 全部数据)*（2*3-1） SE=VAR(0.5h)*2+VAR(1h)*2 SA=ST-SE; F=(SA/1)/(SE/4); 查表F1-0.05 （1,4）临界值=7.71结论：提取时间对提取量的影响无显著差异（P0.05），最佳提取时间可确定为A1B1C3，即6倍水，每次0.5h，提取3次。例. 羊耳菊水提取工艺研究指标选择：3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸，总固体物收率吸水量考察

23、单因素试验考察部分因素：热水投料or冷水投料、粉碎粒度考察正交试验优化提取参数：溶媒倍量、提取时间、次数正交表选择：L9(34)药材用量：100g/次吸水量考察：取羊耳菊6份，每份100g，加10倍水浸泡，于不同时间滤出浸泡液，计算吸水量。吸水量0.5h1481h2102h2753h2924h3015h295也可以加水煮沸一次，滤出药液，计算吸水量结果显示：羊耳菊吸水量在约为3倍，在提取前每个实验可先加3倍水。热水（80）投料or冷水投料：8目筛、10倍水，3次，每次1h，考察投料方式的区别。3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸收率%实验次数冷水投料热水投料161.1988.44259.8983.79

24、365.0686.17平均62.0586.13差异源 离差平方和 自由度 均方 F值 F1-0.05 临界值 P 组间 870.25 1870.25 137.71 7.71P0.5 组内 25.28 46.32 总计 895.53 5热水投料or冷水投料考察方差分析方差分析结果显示投料方式对收率有显著差异，所以投料方式应定为热水投料。3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸收率%实验次数8目筛切段185.4072.04281.8074.00382.7769.92平均83.32 71.99 药材粒度考察：10倍水，3次，每次1h，考察药材粒度的区别。差异源 离差平方和 自由度 均方 F值 F1-0.05 临

25、界值 P 组间 192.78 1192.78 50.51 7.71PBA，最佳工艺条件为A2B2C3。即10倍水，每次提取1h，提取3次ABC工艺验证工艺验证结果表明通过正交试验确定的水提工艺稳定可行重复正交试验的方差分析 正交表的各列都已安排满因素或交互作用，没有空列，为了评估试验误差和进行方差分析，需要进行重复试验；正交表的列虽未安排满，但为了提高统计分析精确性和可靠性，往往也进行重复试验。重复试验，就是在安排试验时，将同一条件下的试验重复若干次，从而得到同一条件下的若干次试验数据。 重复试验的方差分析与无重复试验的方差分析没有本质区别，除误差平方和、自由度的计算有所不同，其余各项计算基本

26、相同。所在列1234小檗碱提取量（mg）因素A乙醇浓度B溶媒倍量C提取时间D提取次数Test1实验11111519.09实验21222771.25实验31333971.47实验42123910.98实验52231700.89实验62312885.46实验73132787.83实验83213857.29实验93321617.08均值1753.94 739.30 753.95 612.35 均值2832.44 776.48 766.44 814.85 均值3754.07 824.67 820.06 913.25 R78.38 85.37 66.12 300.89 水平 A乙醇浓度 B溶媒倍量 C提

27、取时间 D提取次数 1 50 %6 1 h 1 2 70 %8 1.5 h 2 3 90 %10 2 h 3 例.黄连乙醇提取正交试验考察L9(34)正交表无空列？怎么选取误差项做方法分析？选择一：选取偏差平方和最小的项作为误差项。（误差较大）选择二：重复试验，用重复试验的误差做误差项。（2倍试验量，结果较精确）因素 偏差平方和 自由度 均方 F比 F临界值（=0.05） 显著性（=0.05） A乙醇浓度 12306.2 26153.1 1.6619B溶媒倍量10992.7 25496.4 1.4819C提取时间7403.2 23701.6 119 D提取次数141222.9 270611.5

28、 19.0719* P0.05选取偏差平方和最小的项作为误差项所在列1234小檗碱提取量（mg）因素A乙醇浓度B溶媒倍量C提取时间D提取次数Test1Test2和平均实验11111519.09536.42 1055.51 527.75 实验21222771.25804.07 1575.32 787.66 实验31333971.47925.01 1896.48 948.24 实验42123910.98935.59 1846.57 923.29 实验52231700.89713.18 1414.07 707.03 实验62312885.46924.59 1810.05 905.02 实验73132

29、787.83770.80 1558.63 779.32 实验83213857.29875.24 1732.53 866.26 实验93321617.08607.65 1224.73 612.37 K14527.3134460.7084598.0833694.309K25070.6894721.9184646.6294944.003K34515.8934931.2694869.1835475.585极差R554.7959470.5609271.09991781.276 n正交表试验总试验数：9 s各号试验重复数：2 Xit第i号试验第t 次重复试验数据 T所有试验数据之和（包括重复试验） r每列各水平重复数：3 m水平个数：3 Se总误差平方和 Se1空列误差平方和，本例中没有空列 Se2重复试验误差误差平方和 水平 A乙醇浓度 B溶媒倍量 C提取时间 D提取次数 1 50 %6 1 h 1 2 70 %8 1.5 h 2 3 90 %10 2 h 3 重复正交试验的方差分析例.黄连乙醇提取正交试验考察主要因素 次要因素 D A B C 最佳工艺：A2B3C3D3Excel计算重复试验，用重复试验的误差做误差项因素平方和自由度方差F值F1-0.05临界值PA乙醇浓度33510.4 216755.1846.225394.26*P0.05B 溶媒倍