基因表达谱测序

1、基因表达谱测序背景介绍基因表达谱分析利用HiSeq 2000高通量测序平台对mRNA进行测序，获得10M读长为 49nt的原始reads，每一个reads可以对应到相应的转录本，从而研究基因的表达差异情况。 与转录组测序相比，基因表达谱分析要求的读长更短，测序通量更小，仅可用于基因表达差 异的研究。该方法具有定量准、可重复性高、检测阈值宽、成本低等特点，能很好的替代以 往的数字化表达谱分析。技术路线总RNA提取提取并纯化mRNAmRNA片段化反转录成cDNA构建Illumina SE文库上机测序生物信息学分析生物信息学分析原始数据处理原始测序数据有效数据统计去除接头和质量剪切标准生物信息分析表

2、达谱mapping至参考图谱分析表达差异V-J高级生物信息分析送样要求样品要求所需Total RNA的量均不少于20Mgt库，Total RNA可以保存在DEPC处理过的水中、75%的乙醇、异丙醇中，具体以什么方式保存请注明。如提供实验材料为动物组织材料，样品质量需大于2g；如提供实验材料为植物样品，样品质量需大于4g；如提供实验材料为培养细胞，请提供1x107培养好的细胞；如提供实验材料为血液样品，请提供2ml的样品。我们强烈建议在送样的同时客户做好备份，以备后续实验之用。样品纯度要求1. OD260/OD280在1.8-2.0之间，RNA无降解、28S和18S核糖体RNA条带非常亮且清晰（

3、其 大小决定于用于抽提RNA的物种类型），28S的密度大约是18S的2倍；Agilent 2100检测仪分析RNA完整性数据RIN8o2.无蛋白质、基因组DNA污染，如有污染请去蛋白并进行DNase I处理。请提供至少一种样品的凝胶电泳或者Agilent 2100检测仪检测图片，并注明其浓度、体积、 od260/od280、溶剂名称、制备时间、物种来源以及特别备注。最终以我方定量、质检为准。样品采集为了保证提取RNA的完整性，确保后续实验的顺利进行，请务必确保样品的新鲜，对于如 何确保样品的新鲜针对不同的样品获取材料的方法如下：动物组织：从活体上迅速的取下组织（切成黄豆粒大小的块状）每切成一个

4、黄豆粒大小 的块状立即放入液氮中，重复上述操作，直至足够提取总RNA的量；准备一个50ml的离 心管，做相应的标记（样品名称、编号、客户姓名、时间），最好既在管盖上做好标记，也 在管壁上做好相应的标记，先放入液氮中预冷2-3min，拿出离心管（离心管的下部分还是 保持在液氮中），打开离心管的盖子，将液氮中黄豆粒大小的块状收集进离心管中。植物组织：（1）如所采集的是果实、麦穗等体积偏大的样品，收集样品请参照1.动物组织取样方法；（2）如采集的是叶片等体积偏小的样品，请尽量采集嫩叶、幼芽等，每采集一片叶片立即 放入液氮中，直至足够提取总RNA的量，后续操作请参照动物组织的采集。（3）如是植物的花，在采集花骨朵的时候请尽量不要采集到花萼、叶片等，每采集一个花 骨朵请立即放入液氮中，直至足够提取总RNA的量；后续操作请参照动物组织的采集。如提供实验材料为菌丝体，请取500/的菌液于1.5ml离心管中，离心去上清，剩余菌丝 体放入液氮或干冰中，请提供不少于5管的菌丝体。样品运输从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。请填写完整订单， 放入自封袋中与样品一起邮寄。为防止RNA的降解，请确保干冰的量足够运送到目的地。 我们强烈建议在寄送RNA样品时将RNA保存