实验二 过氧化氢的测定

1、实验二：植物组织过氧化氢含量的测定一、实验目的掌握植物组织中过氧化氢含量的定量测定原理了解H2O2对植物大分子物质的损害机理二、实验原理植物组织内积累的H2O2是由一些氧化酶（主要是超氧化物歧化酶SOD） 催化超阳阴离子发生氧化反应而形成。H2O2相对超阳阴离子性质较稳定，但 还是一种催化剂，它的存在可以直接或间接地导致细胞膜脂过氧化损害，加 速细胞衰老和解体。同时也有积极地一面，如参与植物抗病性和抗逆性的启 动和诱导性过程。因此，了解植物组织中H2O2的代谢具有重要意义。H2O2与硫酸钛（或四氯化钛）反应生成过氧化物一一钛复合物黄色沉淀， 溶解于硫酸后，在波长410nm出有最大吸收峰，可以进

2、行比色测定。在一定 范围内，其颜色深浅与H2O2浓度成线性关系TiSO4 + NH3 + H2O2 O2-TiSO （TiO ） + HO - TiO（HO）l + H SO, 4、22 22 2 2 224三、实验材料、设备和试剂实验材料：雀麦叶片（经过冰冻的和未经冰冻的）实验设备：研钵、离心管、离心机、试管、容量瓶、分光光度计等等实验试剂：4条件下处理的丙酮 5umol/ml H2O2浓氨水 5% TiSO4 2mol/L H2SO4四、操作步骤制作标准曲线取7支试管，编号1-7,在通风橱中向各试管加入表1所列试剂，混匀，充 分反应后会有沉淀形成，5000r/min,离心5min。留沉淀，

3、弃上清液，并向各试 管沉淀中加入2mol/L H2SO4 5ml，摇动，使沉淀完全溶解。以1号试管对照调零， 波长410nm处比色测定溶液的吸光度。以吸光度值为纵坐标，过氧化氢物质的量 为横坐标，制作标准曲线（图一）。表1H2O2浓度标准曲线试剂加入量项目管号12345675umol/ml H2O2/ml00.10.20.40.60.81.04预冷丙酮/ml1.00.90.80.60.40.20浓氨水/ml0.20.20.20.20.20.20.25% TiSO40.10.10.10.10.10.10.1相当于 H2O2的物质的量/umol 00.51.02.03.04.05.0测定样品中过氧

4、化氢的量称取样品3&，加入3ml预冷的丙酮，在通风橱中冰浴条件下（由于气温低， 可以不必使用冰浴）研磨成匀浆后，静置片刻，加丙酮定容至5ml，5000r/min,离心5min。留上清液，并取上清液1ml，加入5% TiSO4 0.1ml，浓氨水0.2ml， 出现沉淀后加入2mol/L H2SO4 5ml使之充分溶解，然后进行比色测定。五、结果处理根据溶液吸光度，在标准曲线上查出相应的过氧化氢的物质的量，表示单位 为鲜重，计算公式：过氧化氢含量（umol/g鲜重）二里二vs x m其中n为标准曲线查得的溶液过氧化氢物质的量（umol），v为样品提取液总体 积（ml），vs为吸取样品液总体积，m为

5、样品鲜重（g）由标准曲线查得的数据和实验所用数据分别为：冰冻的雀麦叶片 A1 =1.475，n=11.956umol，v=5ml，vs=1ml，m=3g贝。：过氧化氢含量二1.956x5（umol/g）=19.926 （umol/g）1 x 3未经冰冻的雀麦叶片 A2=0.921，n=7.422umol，v=5ml，vs=1ml，m=3g贝U：过氧化氢含量=7.422x5（umol/g）=12.370（umol/g）1 x 3结果表明：在寒冷条件胁迫下，雀麦叶片中过氧化氢的含量增加。说明由于 体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累，过氧化氢参与了植物抗逆性过程。六、注意事项丙酮在使用前必须要经过预冷处理，并且在4的条件下使用。因为， 在冰浴条件下丙酮保持4可以减少丙酮挥发，减少其对人体的毒害， 而且可以降低过氧化氢的分解过程。在先后加入5%TiSO4和浓氨水时，要进行摇动，摇动次数和时间应该保 持一致，以减少实验误差。根据比色皿的体积，加入硫酸的量要不小于5ml。标准曲线测定结果试管编号1234567过氧化氢物质的量/umol00.512345吸光度值00.0730.1630.2530.3580.5380.608过