利用基因工程生产的药物主要是医用活性蛋白和多肽免疫性蛋白如课件

1、 第十章 外源基因表达与基因工程药物 第一节 概 述 生物技术的核心是基因工程，基因工程技术最成功的成就是用于新型生物药物的研制。之前，许多在疾病诊断、治疗和预防中有重要价值的内源性生理活性物质（激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋白、酶类、凝血因子等）以及某些疫苗，由于材料来源困难；提取技术问题；或因为造价太高使患者望而却步；或由于免疫抗原等缘故使传统生物药物的使用受到限制 而应用基因工程技术就可以从根本上解决上述问题，它的应用使人们在解决癌症、心血管疾病和内分泌疾病等方面取得明显效果，它为上述疾病的预防、治疗和诊断提供了新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂 基因工程技术在医药行业中为预防、诊断、治

2、疗癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病等疑难病方面提供了新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂；利用基因工程生产的药物主要是医用活性蛋白和多肽免疫性蛋白：如各种抗原和单克隆抗体细胞因子：如干扰素、白介素、生长因子激素：如胰岛素、生长激素酶类：如尿激酶、链激酶、超氧化物歧化酶 一、基因工程药物的类型二、利用基因工程技术生产药物的优点 1.可大量生产（过去难以获得的）生理活性蛋白和多肽，以保障临床供应2.可提供足量的生理活性物质，以便进行深入研究，从而扩大这些物质的应用范围3.可以发现、挖掘出更多的内源性生理活性物质4.可通过基因工程和蛋白质工程技术对内源生理活性物质的不足之处进行改造和去除5.可获

3、得新型化合物，扩大药物筛选来源 我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差，重点放在运用现代生物技术手段开发化学合成法难以生产的医药产品，如1997年，我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技产品1b性干扰素三、国内基因工程制药现状第二节 基因工程药物生产的基本过程 就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术 通过基因工程技术，可以大规模生产很多从自然界很难或不能获得的蛋白质或多肽类物质。如以E.Coli为宿主，表达病毒抗原基因，获得病毒抗原，再通过一定手段除去抗原的反应性，而保留抗原原性，

4、就得到了病毒疫苗 一、基因工程技术的概念二、基因工程药物生产的主要程序目的基因的分离与克隆（目的基因来源于人体或病原体）构建DNA重组体（通常将目的基因与质粒DNA整合，组建重组质粒）将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌工程菌的发酵（在工程菌的发酵培养过程中，目的基因同时表达）外源基因表达产物的分离纯化（用生物技术及化学、化学方法）成品的检验 及包装等附：制备基因工程药物的一般程序 目的基因 组建重组质粒 构建基因工程菌 培养工程菌 除菌过滤 产物分离纯化 半成品检定 成品检定 包装表达系统：原核生物系统和真核生物系统。选择表达系统主要考虑：保证表达的蛋白质的功能 其次是表达量的多少和分离纯化的

5、难易说 明上游阶段：在实验室完成，获得目的基因后，用限制性内切酶和连接酶将目的基因插入载体，并转入宿主菌下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，为获得高质量、高产量的表达产物，需对影响表达及分离纯化的因素进行分析（如新型生物反应器、高效分离介质及装置、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术等）第三节 目的基因的获得 对于原核生物，其基因总量不大，可以选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因，而真核生物的目的基因不能进行直接分离 真核细胞中基因总量较大，单拷贝目的基因只是染色体DNA中很小的一部分，直接分离纯化极为困难；另外，真核基因一般都有内含子，若以原核细胞作为表达系统，即使分离出真核基因，由

6、于原核细胞缺乏mRNA转录后的加工系统，真核基因转录的mRNA也不能被加工、拼接成为成熟的mRNA ，因此不能直接克隆真核基因。 克隆真核基因常用的方法有逆转录法和化学合成法 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补DNA，然后进行互补DNA的克隆表达。从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA，再以互补DNA为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶作用下，最终合成编码该蛋白质的双链DNA序列，该序列不含内含子 细胞内含有三种RNA，mRNA占RNA总量的2%-5%，相对分子量大小不一致，分离也有很大的困

7、难，但是mRNA的3末端常含有一多聚腺苷酸(polyA)组成的末端，长达20-250个腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸-纤维素上，从而可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的mRNA1.mRNA的纯化 mRNA的3末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脱氧胸苷酸为引物，在逆转录酶的催化下，开始互补DNA的合成。在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的dNTP掺入量，计算出互补DNA的合成效率，在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应条件2.互补DNA第一链的合成 先用碱解或核酸酶酶解(RNaseH 酶活性)

8、的方法除去互补DNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以互补DNA第一链为模板合成第二链，并用核酸酶S1专一性切除单链DNA 3.互补DNA第二条链的合成 载体有两种质粒和噬菌体，根据重组后插入的互补DNA是否能够表达、能否经转录和翻译 合成蛋白质，又将载体分为表达型载体和非表达型载体。互补DNA插入片段小于10千碱基对，可选用质粒载体，如大于10千碱基对则选用噬菌体作为载体 4.互补DNA克隆（1）载体的分类用于cDNA克隆的载体质粒DNA，如 PUC、PBR322等噬菌体DNA，如 gt 10、 gt 11等（2）载体的特点 PUC和gt 11属于表达型载体，而PBR322和gt 10属

9、于非表达型载体表达型载体：在cDNA插入位置的上游具有启动子序列，重组后插入的cDNA能够表达，并经转录和翻译合成相应蛋白质的载体非表达型载体：在cDNA插入位置的上游无启动子序列，重组后插入的cDNA不能表达，不能经转录和翻译合成相应蛋白质的载体质粒载体容量小（只能插入小于10kb的cDNA 片段）；而要插入大于10kb的外源cDNA 片段时，只能选用噬菌体作为载体（噬菌体作为载体，克隆效率高，容量大）（3）cDNA与载体的连接加同聚尾连接法在3-末端脱氧核苷酸转移酶的催化下，将载体和cDNA的3-端加上互补的同型多聚体序列（A-T、G-C），借助同型多聚体的退火作用形成重组分子在T4DNA

10、连接酶作用下，封口环化加人工接头连接法 在T4DNA连接酶作用下，人为地在目的基因两端接上人工接头，使DNA发生连接的方法人工接头：由人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡聚核苷酸片段。它能使目的基因产生粘性末端，从而与载体连接5.将重组体导入宿主细胞 此过程是一个非同源DNA重组的过程；即让质粒或噬菌体转化或感染感受态的大肠杆菌，从而将重组体引入宿主（E.Coli）细胞内6.cDNA文库的鉴定根据重组体表型进行初步筛选然后采用凝胶电泳、分子杂交、DNA序列分析等方法进一步筛选和鉴定抗性基因失活法菌落或噬菌体颜色改变法7.目的cDNA克隆的分离纯化核酸探针杂交法 用层析和电泳技

11、术纯化目的蛋白，根据目的蛋白的氨基酸序列分析结果人工合成相应的单链寡聚核苷酸序列作为探针；然后从cDNA文库中分离出特异cDNA克隆免疫反应鉴定法 在无目的基因表型特征和核酸探针的情况下，本法是筛选特异cDNA克隆的重要途径，即用目的蛋白的抗体寻找相应的特异cDNA克隆二、化学合成法 1.适用条件：只能合成较小蛋白质或多肽的编码基因 目的基因的核苷酸序列必须清楚；或目的蛋白质的氨基酸序列清 楚，然后按相应的密码子反推DNA碱基序列2.过程：用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火 成为两端形成粘末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次 序进行退火使连接成较长的D

12、NA片段，再用连接酶连接成完整的基因3. 局限性：1.不能合成太长的基因，50-60个碱基对 2.人工合成碱基对时，遗传密码的简并性为选择密码子带来很大的困难 3.费用较高 第四节 基 因 表 达 是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程用基因工程制备药物，必须使目的基因进行高效表达 一、基因表达目的产物产量高目的产物质量高表达产量分离纯化产物的稳定性产物的生物学活性高效表达二、宿主细胞的选择 （一）宿主细胞应满足以下要求 1.容易获得较高浓度的细胞 2.能利用廉价易得的原料培养 3.不致病、不产生内毒素 4.发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态 5.容易进行代谢调控 6.容易

13、进行DNA重组技术操作 7.产物的产量、产率高，产物容易提取 （二）宿主细胞的分类 1.原核细胞：如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌2.真核细胞：如酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞 （1）大肠杆菌 生长迅速、对其遗传学背景研究比较深入、透彻，所以是目前基因工程研究中最常用的原核表达体系特点：产物多为胞内产物（因为大肠杆菌的表达产物不存在信号肽） 真核蛋白质常以不溶性包含体的形式存在（故下游处理过程必须经过复 杂的变性和复性等工艺才能恢复其生理活性） 蛋白质产物不能糖基化（因为大肠杆菌的表达不存在翻译后修饰作用） 目的蛋白的N-端常带有一个多余的Met残基，易引起免疫反应 有时会产生很难除去的内毒素

14、（阴性杆菌的细胞壁成分） 有时会产生蛋白酶破坏目的蛋白1.原核细胞（2）枯草芽孢杆菌 特点：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中 不形成包含体 不能使蛋白质产物糖基化 有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行降解 链霉菌作为外源基因的表达体系，目前正逐步受到人们的重视主要特点：不致病、使用安全、分泌能力强、可将表达产物直 接分泌到培养液中，具有糖基化能力 （3）链霉菌2.真核细胞 （1）酵母 是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物特点 繁殖迅速 基因工程操作简单（可以廉价地大规模培养，没有毒性） 能将表达产物直接分泌到胞外 表达产物能糖基化 特点 有很强的蛋白质分泌功能 能正确进行翻译后加

15、工（包括肽剪切和糖基化等） 糖基化方式与高等真核生物相似 为无毒安全菌株 如：胰岛素原在分泌贮备小泡中向细胞外运送时，其中的C-肽被切除后才变成具有活性的胰岛素（2）丝状真菌（如霉菌）（3）哺乳动物细胞 特点： 产物可分泌到胞外，细胞培养液成分完全可控制，使产物纯化较容易 表达产物能糖基化，接近或类似与天然产物 动物细胞生产慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀 综上所述，目前使用最广泛的宿主仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。因为对它们的遗传背景研究得比较清楚，建立了许多适合于它们的克隆载体和DNA导入方式，并且许多外源基因在这两种宿主菌中得到表达成功 三、不同宿主菌中的基因表达 （一）大

16、肠杆菌中的基因表达 1.载体根据真核基因在原核细胞中表达的特点，表达载体应具备下列条件：载体能够独立复制，有复制起点，有严紧型和松弛型严紧型载体：伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主细胞中拷贝少（1-3）松弛型载体：其复制可不依赖于宿主细胞，在宿主细胞中拷贝多达3000个应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，利于外源基因的克隆、鉴定和筛选应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定所产生的mRNA必须具有翻

17、译起始信号 2.影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因在宿主中的表达受许多因素影响的，所以在建立表达体系时要综合考虑各种因素的作用，建立一个合适的表达体系，从而使外源基因得到最大的表达量，获得最多的表达产物（1）外源基因的拷贝数 外源基因是克隆到载体上的，所以载体在宿主中的拷贝数就直接与外源基因的表达相关，应将外源基因克隆到高拷贝的质粒载体上，这对于提高外源基因的总体表达水平非常有利（2）外源基因的表达效率 启动子的强弱在转录水平上直接影响基因的表达、核糖体结合位点的有效性、SD序列和起始ATG的间距、密码子的组成等都会不同程度地影响外源基因的表达 基因表达调控的关键环节是转录，要实现外

18、源基因的高效表达，首先必须保证外源DNA向mRNA的高效转录，而转录的顺利进行，必须依靠强有效的启动子，因此在载体的目的基因上游必须连有一个适当的启动子；另外，真核基因的启动子不能被大肠杆菌的RNA-pol识别，故将真核基因的编码区置于大肠杆菌RNA-pol能识别的强启动子（如 lac、trp等）控制下，并将其插入表达载体启动子的下游，以增加表达的机会启动子的强弱核糖体结合位点的有效性 核糖体结合位点是对真核基因在细菌中的高效表达十分重要；必须通过消除空间位阻等的影响增加其有效性SD序列和起始ATG的间距 SD序列与起始密码间的间距对非融合蛋白的合成水平有很大影响；距离过长或过短都不利于真核基

19、因的表达（一般距离1035bp较合适）密码子的组成 tRNA对密码子的“偏爱性”也是影响翻译效率的因素之一。真核基因与原核基因在编码同一氨基酸时所偏爱使用的密码子不尽相同，为了实现真核基因在大肠杆菌中的高效表达，在设计引物和合成基因时，应选择使用大肠杆菌“偏爱”的密码子（3）表达产物的稳定性 当外源基因大量表达时，由于应急反应，细胞内会迅速分泌大量降解该蛋白质的酶，所以即使原始表达量很高，实际产量也不一定高，那就得看被酶降解的程度。为了提高产量，必须提高表达产物的稳定性。具体措施如下：组建融合基因，产生融合蛋白利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙

20、中，而使外源蛋白不易被酶降解采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞 （4）细胞的代谢负荷 外源基因在宿主细胞内的大量表达，必然会影响宿主细胞正常的生长代谢，有些产物对宿主还会有毒害作用，将细胞杀死，为了减轻宿主细胞的代谢负荷，同时还得提高外源基因的表达水平，可采用两步培养法方法一 将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，当宿主细胞的生物量达到饱和时，再进行基因产物的诱导合成，以减低宿主细胞的代谢负荷方法二 将宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开，当宿主细胞迅速生长时，抑制重组质粒的复制，当细胞生长量累积到一定水平后，再诱导细

21、胞中重组质粒的复制，增加质粒拷贝数 （5）工程菌的培养条件 优化培养条件使外源基因大量表达 （1）融合蛋白（2）非融合蛋白（3）分泌型 3.真核基因在大肠杆菌中的表达形式（1）融合蛋白 概念：是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起所形成的蛋白质；其氨基 端是原核序列，羧基端是真核序列优点：基因操作简便 蛋白质在菌体内比较稳定 蛋白质在菌体内稳定性好，不易被细菌酶类所降解 容易实现高效表达缺点：不能作抗原使用（因为原核多肽序列可能会影响真核蛋白的免疫原 性；目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获 目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段 ） （2）非融合蛋白 表达非

22、融合蛋白的操纵子必须改建成 细菌或噬菌体的启动子细菌的核糖体结合位点（SD序列）真核基因的起始密码子结构基因终止密码（要求核糖体结合位点序列与翻译起始密码之间的距离要合适，稍有不适就会影响表达效率）优点：能够较好地保持原来的蛋白活性；缺点：容易被蛋白酶破坏 N-末端常常带有甲硫氨酸，在人体内用药时可能会引起免疫反应 将外源基因连接到信号肽的下游，利用大肠杆菌的信号肽，构建成分泌型表达质粒；当其在大肠杆菌中表达时，外源基因的表达产物（目的蛋白）在信号肽的帮助下，以生物活性形式被分泌到细胞外特点：提高了易被细胞内蛋白酶降解的表达产物的稳定 在细胞内表达时无活性的蛋白质，分泌表达时能按一定的方式 折

23、 叠，形成具有活性的蛋白质 分泌后的蛋白质产物不含起始密码所编码的Met（因为Met随着信 号肽被信号肽酶切割掉了） （3）分泌型蛋白（二）酵母中的基因表达 1.酵母载体（1）概念：是可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分 裂传递到子代细胞的DNA或RNA单位（2）酵母载体分类：普通表达载体和精确表达载体 普通表达载体只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物 的组成，特别是对其N-末端氨基酸是否有增减并无严格要求 精确表达载体要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切 酶位点，以利于接入外源基因，并使它在表达和加工后N-末端氨基酸 序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺

24、失的氨基酸 由于从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易得多，因此酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段再转入酵母中 （3）克隆载体（二）影响目的基因在酵母菌中表达的因素 1.外源基因的拷贝数 拷贝数要适当。高拷贝数的质粒载体可使外源基因高效表达，但会引起细胞生长量的降低；单拷贝的质粒载体对细胞的最大生长没有影响，但表达的效率不高，必须调节好这两方面的关系 外源基因在酵母中表达效率与启动子、分泌信号、终止序列有关（1）要使外源基因在酵母中表达，必须将外源基因克隆到酵母菌表达载体的启动子和终止子之间，构成表达框架（启动子-外源基因-终止子）（2）分泌信号包括信号肽部分以及前导

25、肽部分的编码序列，它帮助后面的表达产物分泌出酵母细胞，并在适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物（3）终止序列保证了转录产物在适当的部位终止，并加上polyA，形成的mRNA比较稳定并被有效地翻译 2.外源基因的表达效率3.外源蛋白的糖基化 外源蛋白在酵母中可发生N-糖苷键（Asn连接）和O-糖苷键（Ser或Thr连接）两种不同的糖基化，并在分泌过程中正确识别外源蛋白的糖基化信号，使其进行正确折叠和分泌到细胞外 酵母细胞分泌的“异源”蛋白糖基化产物与天然产物完全相同，这也是为什么酵母细胞被广泛应用生产各种医用蛋白的原因 不同的酵母菌株及其生理状态对外源基因

26、的表达有明显影响， 用作表达的酵母宿主菌株应具备下列要求 菌体生长力强 菌体内源蛋白酶较弱 菌体性能稳定 分泌能力强 4.宿主菌株的影响五、动物细胞中的基因表达 动物细胞表达的特点：产物可分泌到细胞外，培养液成分可人工调控，产物纯化比较容易，产物是糖基化的，接近或类似于天然产物；但动物细胞生长慢，单位体积生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较小 第五节 基因工程菌的稳定性 基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，有分裂不稳定和结构不稳定。不管是哪一种不稳定，都将使不含目的基因的细胞成为优势菌，从而减少基因表达的产物分裂不稳定：是指工程菌分裂增殖时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象

27、质粒结构不稳定：是指外源基因从质粒上丢失或突变，或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变一、引起质粒不稳定的原因 在基因工程菌培养过程中，质粒的不稳定通常表现为分裂不稳定，主要与两个因素有关含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；这两种菌的比生长速率差异的大小1.对于含低拷贝质粒的工程菌，若工程菌的比生长速率较快，则容易产生不含质粒的子代菌（此时可通过降低工程菌的生长速率或增加工程菌中的质粒拷贝数能提高质粒的稳定性）2.含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质 粒的存在使含质粒菌的生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌（因而对这类工程菌

28、而言，进一步提高质粒拷贝数反而会增加含质粒菌的生长负势，对质粒的稳定性不利） 将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂布于不含抗性标记抗生素的平板培养基上，培养10-12小时，然后随机挑出100个菌落接种到含抗性标记抗生素的平板上，培养10-12小时，统计长出的菌落数，每一样品应取3次重复的结果，计算出比值，该比值反映了质粒的稳定性质粒稳定性的分析方法二、提高质粒稳定性的方法 1.两阶段培养法：第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达2.选择性压力（如抗生素等）：通过向培养基中加入“压力”，抑制质粒丢失菌的生长3.间歇供氧法4.改变稀释速率法 利用重组菌对发酵环境改变的反应较质粒丢

29、失菌迟钝的性质，通过改变培养条件（如调控温度、pH、培养基组分、溶解氧，通过间歇供氧和改变稀释速率），抑制质粒丢失菌的生长，使工程菌生长速率具有优势 第六节 基因工程菌生长代谢的特点 菌体生长是菌体各成分尤其是生物大分子核酸和蛋白质的综合表现，通常用比生长速率来表示。工程菌培养可通过选用不同的碳源、控制补料或稀释速率等方法来控制菌体的生长。控制菌体生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物的积累、提高外源蛋白产率都有重要意义对菌体生长的调控主要有两种观点能量的供应决定了菌体的最大比生长速率小分子前体和催化组分（RNA聚合酶、核糖体）的限制决定了菌体的最大比生长速率 这两种观点分别从能量和合成反应的

30、前体这两个不同的角度研究菌体的生长 一、菌体生长与能量的关系 （一）菌体生长与能量供应的关系 菌体生长是由呼吸控制的，各种碳源通过有限的呼吸能力所提供的最大能量决定了菌体在这种培养基中的最大比生长速率 当菌体生长所需能量超过菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸（二）如何实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平分批培养中选用不同的碳源补料培养中控制补料速度连续培养中控制稀释速率向培养基中补加甲硫氨酸和酵母提取物适当提高培养基的pH值，可减少乙酸的抑制作用 这些培养方法的实质是控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰CoA的积累和乙酸

31、的产生二、菌体生长与前体供应的关系 （一）菌体生长与前体供应的关系 菌体中小分子前体和催化结构（如 氨基酰-tRNA）是有限的，因而生物大分子的合成处于亚饱和状态，限制了菌体的比生长速率 在基础培养基中加入氨基酸能使菌体比生长速率提高，使蛋白质合成增加，对工程菌而言，由于质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，从而进一步加剧了这些成分的不足。因此，在同等培养基条件下，工程菌的比生长速率低于其宿主细胞（特别是工程菌诱导后表现更明显）（二）工程菌所含质粒拷贝数与前体供应的关系在含中等拷贝质粒（5060拷贝）的工程菌中，一些与前体物合成有关的酶的相对水平增高在含高拷贝

32、质粒的工程菌中（200拷贝以上），前体物、核糖体、一些与翻译有关的酶及延长因子等产生“严紧反应”严紧反应：在高拷贝质粒工程菌中，由于质粒复制和外源基因的转录、翻译消耗了大量前体物和催化结构，造成蛋白质合成过程中，因前体物和氨基酰-tRNA的不足使核糖体在密码子上停留，并合成“魔点”ppGpp现象 ppGpp是一个重要的调控因子，其浓度的增加会导致在合成mRNA和rRNA时RNA-pol在模板上的移动停顿下来，RNA链延长速度减慢，并使游离RNA-pol浓度降低（转录过程抑制）第七节 基因工程菌的发酵 不同的发酵条件，工程菌的代谢途径也可能不一样，对下游的纯化工艺会造成不同影响。因此，在高表达、

33、高密度的前提下，要尽可能建立有利于下游纯化的发酵工艺，以提高产品的纯度及改善其性质一、基因工程菌的培养方式1.补料分批培养 将种子（基因工程菌）接种至发酵反应器，经过一段时间培养后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法 在此培养方法中，为保持工程菌生长所需的良好微环境，延长对数生长期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料结合起来，根据工程菌的生长规律调节补料的流加速率2.连续培养 将种子（基因工程菌）接种至发酵反应器中，搅拌培养至一定菌体浓度后，启动进料蠕动泵，以控制稀释率进行不间断地培养，为微生物提供一个相对恒定的生活环境，控制其比生长速率 但由于基因工程菌不够稳定，连续培

34、养比较困难，为了解决这一问题，人们研究出两阶段连续培养法 在此培养系统中，应控制的参数：诱导水平、稀释率和细胞比生长速率阶段：阻遏外源基因的表达，增加工程菌的生物量阶段：消除阻遏子的阻遏作用，诱导外源基因高效表达3.透析培养原理：利用膜的半透性原理，使代谢物和培养基分离，去除培养液中 代谢物对工程菌的不利影响如 乙酸等代谢废物的过高积累，会限制工程菌的生长及外源基因的表 达，而用透析法培养时就可以解决这类问题4.固定化培养 此种方法特别适用于分泌型菌体的培养 基因工程菌培养的一大难题就是如何维持质粒的稳定性。将固定化技术应用到这一领域，发现工程菌固定化以后，质粒的稳定性大大提高，便于连续培养（

35、两阶段连续培养），因此这种培养方法的研究进展很快二、基因工程菌的发酵工艺设计 基因工程菌培养目的是为了使外源基因大量表达，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染 外源基因的高效表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因之间的相互关系，而且也与其所处的环境密切相关。不同的发酵条件，代谢途径也不相同，对下游的纯化工艺就会造成不同的影响 1.培养基的影响 培养基为基因工程菌的生长和外源基因的表达提供一切能源物质。培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持重组质粒的稳定性，使外源基因能够高效表达碳源：有机氮源：酪蛋白水解物作为氮源有利于产物的合成与分泌 磷：无机磷是许多初级代谢的酶促反应中的效应因子，过量的无机

36、磷会刺激葡萄糖的利用、菌体的生长和氧消耗；但它会影响到目的蛋白的表达。即低浓度时影响菌体生长，高浓度时外源基因不表达，故起始磷酸盐浓度应一般控制在0.15mol/L左右较适宜甘油菌体得率较高 葡萄糖菌体产生的副产物较多，且葡萄糖对lac启动子有阻遏作用甘露糖不产生乙酸，但菌体的比生长速率和呼吸强度较小乳糖在作碳源的同时，还对lac启动子起诱导作用2.接种量的影响 定义：指移入的种子液体积和培养液体积的比例接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期，量小，菌体生长的延迟期延长，不利于外源基因的表达；量大，有利于对基质的利用，可以缩短生长延迟期，并使产生菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但会使菌体

37、生长过快，代谢产物累积过多，反而会抑制后期菌体的生长；所以实际工作中 ，接种量的大小应取决于工程菌种在发酵液中的繁殖速度 温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成上 复制:可通过控制复制来改变基因拷贝数，影响基因的表达 转录:可通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，来调控基因表达 翻译：影响mRNA的修饰和翻译水平 小分子调节分子：通过影响其合成，也可影响ppGpp的量，从而调控 基因表达 另外，温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成，T=30时，目的物表达量最高；T较低时，影响菌体生长，不利于目的产物的表达；T较高（37）时，由于细菌的热休克系统被激活，大

38、量蛋白酶被诱导，易使表达产物降解 3.温度的影响例 重组人生长激素在不同的温度培养条件下，产物的表达形式不同：30时产物可溶，而在37时产物形成包含体，对后续分离纯化带来困难4.溶解氧的影响 菌体在大量扩增过程中，进行耗氧的氧化分解代谢，溶解氧是工程菌培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数（特别是在对数生长期或对数生长期后期，营养和氧对菌群代谢繁殖影响尤为显著 ） 采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。在发酵前期，采用较低转速，即可满足菌体生长；在培养后期，提高搅拌转速才能满足菌体继续生长的要求 一般在对数生长期或对数生长期后期诱导表达，有利于提高外源蛋白的产量。对数

39、生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到109个每毫升为止，这时菌群数目倍增，对营养和氧的需求量急增，营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素 如 将2830培养的工程菌通过升温（42），使阻遏蛋白失活，启动子启动转录，提高目的基因的转录、翻译水平5.诱导时机的影响6.pH的影响 培养液的pH值对工程菌的正常生长和外源基因的高效表达都有影响，应根据工程菌的生长和代谢情况适当调节pH值 细胞生长的最佳pH范围在pH6.8-7.4，而外源基因表达时的最佳pH范围6.0-6.5。所以在两阶段培养工艺，培养前期着重于优化工程菌的最佳生长条件，培养液的pH范围值应控制在6.8-7.4；而培养后期着重于优化外源基

40、因的表达，培养液的pH范围值应控制在6.0-6.5三、基因工程菌的培养设备1.对发酵罐的特殊要求：能提供菌体生长的最适条件培养过程不得污染能够保证纯菌培养性质稳定，培养和消毒过程中不得游离出异物不能干扰细菌的代谢活动2.发酵罐的组成罐体搅拌装置温控系统灭菌系统空气滤菌装置残留气体处理装置参数测量与控制装置培养液配制及连续操作装置第八节 基因工程药物的分离纯化一、基因工程药物制备的特点1.目的产物在初始物料中含量较低2.含目的产物在初始物料组成复杂3.目的产物为生物活性物质，稳定性差4.与目的产物共存的物质种类繁多5.产物应用面广，对其质量、纯度要求高（如无菌、无热源等）二、建立分离纯化工艺的依

41、据1.含目的产物的初始物料的特点 宿主的类型及代谢特性，如表达方式等 培养基的组成 生产工艺和条件，如灭菌方法、生产方式等 初始物料的理化性质和生物学特性2.物料中杂质的种类和性质 包括杂质的含量、化学性质、分子量、带电性、溶解性、分配系数、挥发性等3.目的产物的特性 包括产物的理化性质、生物学特性4.产品质量的要求 根据产品的质量标准和用途不同，对产品的纯度、比活、贮存条件等要求不同三、分离纯化的基本过程 细胞破碎 固液分离 浓缩与初步纯化 高度纯化（得到纯品） 成品加工基本过程 发酵液 细胞分离 胞内产物 胞外产物 细胞破碎 固液分离包含体 细胞碎片分离变性复性 浓缩 初步纯化 高度纯化

42、制剂 成品 四、分离纯化技术分离纯化技术应满足的要求：技术条件要温和 选择性好 收率要高 各种技术能直接衔接 整个分离纯化过程要快（一）细胞破碎1.细胞收集：常用离心分离法，也可用膜过滤法2.细胞破碎 高速匀浆法：高速剪切及高压挤压 超声破碎法：超声波的声能作功 机械破碎法 高速珠磨法：类似球磨机原理 高压挤压法：先冷却至-25-30，再用500MPa以 破碎方法 上的高压冲击，挤出高压阀孔而压破 酶溶法 非机械破碎法 化学渗透法 热处理法 渗透压冲击法（二）固液分离 高速离心 离心沉淀法 超速离心 微滤：分离细胞、细胞碎片、包含体、蛋白质沉淀等固体颗粒 膜 过 滤 超滤：用于浓缩蛋白质、多糖

43、、核酸等大分子物质 反渗透：脱去抗生素、氨基酸等小分子中的水分 双水相分配法：水溶性高聚物-无机盐组成双水相系统（如PEG-无机盐） 将混合物与双水相混合，离心分相，则PEG、目的物和杂蛋 白富集在上相，而细胞碎片、核酸、多糖等分布于下相（三）目的产物的分离纯化常用的分离纯化方法是色谱法，其优点有： 分离机制多种多样，可供选择 设备简单，便于自动化控制 分离过程中无发热等有害效应保证目的产物的活性 蛋白质纯化方法的设计是根据产物与杂质的理化性质以及生物学特性的差异而定的，特别是表面性质的差异，如表面电荷、对配基的结合活性、分子大小等色谱方法1.离子交换层析2.反相色谱：利用pro分子中非极性基

44、团（氨基酸R侧链）与非极性固定相之间的 作用力大小、pro分子中极性基团（ -COOH、-NH2、-OH等）与流动 相之间的作用力大小的差异进行分离3.疏水色谱：利用pro分子表面的疏水区域与固定相的疏水基团之间的相互作用， 用不同浓度的无机盐溶液洗脱（浓 稀）4.亲和层析5.凝胶过滤层析 五、分离纯化方法的选择（一）根据产物表达形式选择1.分泌表达产物由于发酵液体积大，浓度低，纯化前需用沉淀、超滤等方法进行浓缩2.E.Coli胞内可溶性表达产物，破菌后上清液首选亲和层析分离，也可用离子交换层析 3.包含体：用离心分离或过滤法与其他可溶性杂质分离 分离出的包含体以促溶剂（尿素、SDS等）溶解，

45、在适当条件下复性 （注：此法得到的pro 产品活性不可靠，复性时易错误折叠）（二）根据分离单元之间的衔接选择 各分离单元之间应该做到自然衔接，不能为了衔接，额外补加脱盐、浓缩、稀释等步骤。这就要求工艺设计时必须熟悉各分离纯化方法的具体操作原理及适用条件。如亲和层析由于选择性强，且分离介质昂贵，故一般不放在第一步，而应放在较后面经预处理后的关键步骤中（三）根据分离纯化工艺的要求选择 分离纯化工艺应遵循的原则 1.具有良好的稳定性和重复性 2.尽可能减少工艺步骤 3.组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺与设备也 能相互适应；从而减少步骤间对物料的处理和条件调整 4.尽可能少用试剂 5

46、.分离纯化工艺时间尽可能短，以免影响产品的生物活性 6.工艺和技术必须高效、高回收率、设备条件低、易操作、能耗低 7.工艺安全性好，保证产品安全、无菌、无热源、无污染第九节 基因工程药物的质量控制 用活细胞作为表达体系，所获得的蛋白质产品往往相对分子量较大，并有复杂的结构，许多药物是参与一些生理功能精密调节所必需的蛋白质，所以任何药物在性质或剂量上的偏差，都可能造成严重的后果，从原料开始每一步都要进行严格的控制 基因工程药物的特点一、原料的质量控制 原料的质量控制是为了保证编码pro的DNA序列的正确性，以及产品质量的安全性和一致性 了解下列特征：目的基因的来源、克隆的经过、并用限制性内切酶酶

47、切图谱和核苷酸序列等予以确证、应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组分（复制子、启动子）的来源与功能、构建中所用位点的酶切图谱、抗生素抗性标志物、提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性，需阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，如是否整合到染色体上及在其中的拷贝数，并证明宿主细胞与载体结合后遗传稳定性，提供插入基因与表达载体俩侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞表达的方法与水平等 二、培养过程的质量控制 储存中，要求种子克隆纯而稳定培养中，工程菌所含的质粒稳定，始终无突变在重复生产发酵中，表达稳定；始终能排除外源微生

48、物的污染 生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。原始种子批需确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存以预计使用期，保存与复苏的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定在高允许传代数；培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；依宿主细胞-载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品 三、纯化工艺过程的质量控制 要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯分子批间保持一致性；外源蛋白质、D

49、NA与热源质都在规定的限度以下 在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质 四、目标产品的质量控制 1.产品的鉴别肽图分析：用酶法和化学方法降解目的蛋白，对生成的肽段进行分离分析，检测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法。灵敏、高效。高效液相色谱和毛细管电泳氨基酸成分分析：小于50个氨基酸分析结果较可靠部分氨基酸序列分析：氨基端15个氨基酸重组蛋白质的浓度测定和相对分子量测定：浓度，凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林-酚法和紫外光谱法。分子量，凝胶过滤法（完整）和SDS法（亚基）蛋白质二硫键分析：维持蛋白质一级结构的重要共价键 目的pro

50、含量测定： SDS、等电点聚焦、HPLC、CE等 菌体蛋白 蛋白质类杂质 降解蛋白 聚合蛋白 杂质限量分析 微生物微生物学检测法 非蛋白质类杂质 热源质家兔法 内毒素鲎试验 DNA核酸杂交法2.纯度分析3.生物活性测定 体内生物活性：根据目的产物的生物学特性建立适合的生物学模型，进行测定体外生物活性：用细胞计数法等 4.稳定性考察 稳定性考察是评价药品安全性的重要指标，也是确定药品储藏条件和使用期限的主要依据。对温度、氧化、光照、离子浓度和机械剪切等环境因素都很敏感 5.产品一致性的保证 由于基因工程制药的生产周期长，工艺复杂，影响因素多，必须对每一步都进行严格的控制和质量检定 五、产品的保存

51、 目的产物受多种因素的影响而失活，保存时要防止变性、降解、保护活性中心 低温保存：对热敏感。 在稳定pH条件下保存：防止变性。 液态保存 高浓度保存：高浓度时比较稳定。 加保护剂保存：糖类、脂肪类、蛋白质类、多元醇、有机溶剂等； 有些需加盐，加2-巯基乙醇在真空或惰性气体中保存 固体保存 固体蛋白质比液体稳定，在室温或冰箱中保存比较稳定，长期保存 最好制成干粉或结晶 第十节 基因工程药物制造实例 干扰素（interferon IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据其结构可分为、等4个类型。干扰素又依其结构分为1b、2a

52、、2b等亚型，其区别在于个别氨基酸的差异上，早期干扰素是用病毒诱导人白血球产生的，产量低、价格昂贵，不能满足需要，现在可利用基因工程技术并在大肠杆菌中发酵、表达来进行生产 背 景一、基因工程菌的组建 将生产干扰素的白细胞的mRNA分级分离，然后将不同部分的mRNA注入蟾 蜍的卵母细胞，并测定合成干扰素的抗病毒活性用活性最强的这部分mRNA合成cDNA将其克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒pBR322中，转化大 肠杆菌的几千个重组子克隆，每个克隆都用粗提的干扰素的mRNA去进行 杂交，把得到的杂交阳性克隆中的重组质粒DNA放到一个无细胞蛋白合 成体系中进行翻译，对每一个翻译体系的产物进行

53、抗病毒的干扰素活性 检测，经过多轮筛选获得了产生干扰素的cDNA将干扰素cDNA克隆入大肠杆菌表达载体中，转化大肠杆菌进行高效表达 二、基因工程干扰素的制备 启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提 半成品制备 半成品检定 成品包装 成品检定 冻干 分装 人干扰素2b基因工程菌为SW-IFN-2b/E.coli DH5, PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因，种子培养基 含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠。分别接种人干扰素2b基因工程菌到4个装有250毫升种子培养基的1000毫升摇瓶中，30培养10小时，作为发酵罐种子 用15升发酵罐进行发酵，发酵培养基的装量为10升，发酵培养基由1%蛋

54、白胨、0.5%酵母提取物、0.01%氯化铵、0.05%氯化钠、0.6%磷酸氢二钠、0.001%氯化钙、0.3%磷酸二氢钾0.01%硫酸镁、0.4%葡萄糖、50毫克每毫升氨苄青霉素、少量防泡剂组成，pH6.8。转速500转每分，通气量为1：1溶氧为50%。30发酵8小时，然后在42诱导2-3小时完成发酵。同时每隔不同时间取2毫升发酵液，10000转每分离心除去上清夜，称量菌体重量 1.发酵2.产物的提取和纯化 发酵完毕后，冷却，进行4000rpm离心，离心30min，得湿菌体1000克左右。取100克湿菌体重新悬浮于500ml 20mmol/L PBS（pH 7.0），于冰浴条件下进行超声波破碎

55、，然后4000rpm，离心30min，取沉淀部分，用100ml含8mol/L 尿素、 20mmol/L PBS（pH 7.0） 、0.5mmol/L二巯基苏糖醇的溶液，室温搅拌抽提2h，然后用15000rpm离心，30min，取上清夜，用20mmol/L PBS（pH 7.0）稀释至尿素浓度为0.5mmol/L，加二巯基苏糖醇至0.1mmol/L，4搅拌，15h，15000rpm，离心30min除去不溶物。 上清夜经截流量为10000相对分子量的中空纤维超滤器浓缩，将浓缩的人干扰素2b溶液经过Sephadex G50 分离，层析柱2cm*100cm，先用20mmol/L PBS（pH 7.0）平衡，上柱后用同一缓冲液洗脱分离，收集人干扰素2b部分，经SDS检查 将Sephadex G50柱分离的人干扰素2b组分，再经DE-52柱（2厘米*50厘米）纯化人干扰素2b组分，上柱后用含0.05、0.1、0