生物工程下游技术-97页PPT课件

1、一、生物分离工程概念 是指从发酵液、酶反应液和动植物细胞培养液中分离纯化生物产品的过程。 它描述的是生物产品分离、纯化过程的原理、方法和设备。它处于整个生物产品生产的后端，所以也称生物工程下游技术。二、生物分离工程研究的内容1、主要目标产品的类型2、生物分离工程技术的探讨3、设备的研究4、生物分离操作过程的设计与优 化三、生物分离的一般流程1.发酵液的预处理 主要操作单元是过滤和离心2.产物的提取 主要操作单元是沉淀、萃取、吸附和超滤3.产物的精制 主要操作单元是色谱技术4.成品的加工处理 主要操作单元是浓缩、结晶和干燥4、生物分离工程的选择准则 生产成本要降低 工艺步骤要少 操作程序要合理

2、适应产品的技术规格 生产要有规模 产品具有稳定性 环保和安全要求 生产方式第二章 发酵液的预处理为何要对发酵液进行预处理？一、发酵液的基本特性发酵产物浓度较低，大多为1-10%，悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似。可压缩性液相粘度大，大多为非牛顿型流体；悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动-这些特性使得发酵液的过滤与分离相当困难。二、预处理的目的和要求预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。 相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。尽可能使产物转入便于后

3、处理的一相中（多数是液相）三、预处理的方法凝聚和絮凝加热法 加水稀释法调节悬浮液的PH值加入助滤剂法加吸附剂和加盐法高价无机离子的去处 可溶性杂蛋白的去除色素及其他杂质的去除 通过对发酵液进行适当的预 处理，即可改善其流体性能，降低滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。如：硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等。降低液体粘度凝聚和絮凝凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成 mm 大小块状凝聚体的过程。絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子

4、交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。二 预处理-加热加热使蛋白质变性凝固 变性蛋白质的溶解度小。如柠檬酸发酵液加热至80以上，可使蛋白质变性凝固，过滤速度加快。加热处理只适用于对热较稳定的液体。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。三 预处理-调节pHpH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。细胞(碎片)及某些胶体物质在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。大幅度改变pH还能使蛋白质变性凝固。通过调整pH值改变膜过滤中易吸附分子的电荷性

5、质，可减少膜堵塞和污染；影响离子型絮凝剂的电离度。四 加入助滤剂一种不可压缩的多孔微粒，在发酵液中加入固体助滤剂，则菌体 可吸附于助滤剂微粒上，助滤剂就作为胶体粒子的载体，均匀地分布于滤饼层中，降低了滤饼的可压缩性，减小了过滤阻力。目前生物工业中常用的助滤剂是硅藻土，其次是珍珠岩粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纤维素、白土等。五. 加吸附剂和加盐法加入某些不影响目标产物的反应剂，可消除发酵液中的一些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速度。 1）加入吸附剂与某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀,生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，又能使蛋白质凝固，过滤性能上升，沉淀本身可作为助滤剂.如在新生

6、霉素发酵液中加入CaCl2和Na3PO4，生成Ca3(PO4)2沉淀。2）发酵液中含有不溶性多糖物质时，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍高价无机离子的去除方法Ca2+ 草酸、草酸钠，形成草酸钙沉淀（注意回收草酸） ；Mg2+三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；Fe2+ 黄血盐，普鲁士兰沉淀杂蛋白的去除方法(1) 沉淀法：蛋白质是两性物质，在酸性溶液中，能与一些阴离子（三氯乙酸盐、水扬酸盐）形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子（Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe

7、3+等）形成沉淀。(2) 变性法：使蛋白质变性的方法很多，如：加热，调节PH，有机溶剂，表面活性剂等。其中最常用的是加热法。(3) 吸附法：加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。过 滤1.过滤操作是借助于过滤介质，在一定的压力差P作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。过滤介质: 过滤采用的多孔物质； 滤浆: 所处理的悬浮液； 滤液: 通过多孔通道的液体； 滤饼或滤渣 :被截留的固体物质。3）错 流 过 滤又称切向流过滤（Cross-Flow Filtration）即液体的流向和滤膜相切。第三章细胞破碎微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如

8、大多数小分子代谢物、细茵产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。但有些目的产物存在于细胞内部、如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等，称为胞内产物。许多基因工程产品都是胞内产物。分离提取胞内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤。细胞破碎（cell rupture）技术是指利用不同的方法破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。第一节 细胞壁的组成与结构通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。第二节 常用破碎方法破碎方式机械法非机械法固体剪切液体剪切作用作用珠

9、磨法高压匀浆干燥处理溶胞作用酶溶法化学法物理法超声破碎压榨（一）机械法机械破碎法又可分为：高压匀浆破碎法（homogenization）高速珠研磨破碎法（bead grinding）超声波破碎法（ultrasonication（二）非机械破碎法非机械方法很多1 酶解2 化学法溶胞3 物理法渗透压冲击冻结和融化干燥法其中酶法和化学法溶胞应用最广第四章 沉 淀 法一 概述1.沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。2.沉淀法的目的：通过沉淀达到浓缩的目的；沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步 纯化 ；将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步

10、处理。沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。4.沉淀法操作步骤 ：首先加入沉淀剂，沉淀剂的陈化，促进粒子生长；离心或过滤，收集沉淀物。加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。二、蛋白质沉淀的方法根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1）盐析法；（2）等电点沉淀法；（3）有机溶剂沉淀法；（4）非离子型聚合物沉淀法；（5）聚电解质沉淀法；（6）复合盐沉淀法等 （7）亲和沉淀法（8） 选择性沉淀法。1、盐析1.概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。盐析是可逆的，而变

11、性是不可逆的盐析法机理（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， （2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，（3）中和电荷，减少静电斥力，2、等电点沉淀法在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀的操作称为等电点沉淀有机溶剂沉淀法概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。 第五章萃取技术一、萃取概述萃取：萃取是利用物质在两种不互溶溶剂中溶解度或分配比的不同来达到分离。提取或纯化目的的一种操作。 当含有

12、生化物质的溶液与互不相溶的第二相接触时，生化物质倾向于在两相之间进行分配，当条件选择得恰当时，所需提取的生化物质就会有选择性地发生转移，集中到一相中，而原来溶液中所混有的其它杂质（如中间代谢产物、杂蛋白等）分配在另一相中，这样就能达到某种程度的提纯和浓缩。1.萃取过程溶剂萃取概述常用萃取方法有机溶剂萃取超临界萃取反胶束萃取液膜萃取微波辅助萃助双水相萃取二、 萃取过程的理论基础液液萃取是以分配定律为基础1.分配定律：一定T、P下，溶质在两个互不相溶的溶剂中分配，平衡时，溶质在两相中浓度之比为常数。A-分配常数在常温常压下为常数；应用前提条件（1） 稀溶液（2） 溶质对溶剂互溶没有影响（3） 必须

13、是同一分子类型，不发生缔合或离解三、弱电解质在有机溶剂-水相的分配平衡分配达平衡时，溶质在两相的总浓度之比 对于弱酸性电解质对于弱碱性电解质=K0 /(1 10 pH pK )=K0 /(1 10 pK pH )K0只与T、P有关； K与T、P和pH有关K可通过实验求出，而K0不能，可由公式求出。4. 有机溶剂萃取的影响因素1影响萃取操作的因素：pH、温度、盐析2有机溶剂的选择3带溶剂4乳化与去乳化6带溶剂 带溶剂是指易溶于溶剂中并能够和溶质形成复合物且此复合物在一定条件下又容易分解的物质，也称为化学萃取剂。7乳 化乳化：水或有机溶剂以微小液滴分散在有机相或水相中的现象。 乳化带来的问题：有机

14、相和水相分相困难，出现夹带，收率低，纯度低。物理法：离心、加热，吸附，稀释化学法：加电解质、其他表面活性剂* 转型法加入一种乳化剂，条件： 形成的乳浊液类型与原来的相反，使原乳浊液转型 在转型的过程中，乳浊液破坏，控制条件不允许形成相反的乳浊液，* 顶替法加入一种乳化剂，将原先的乳化剂从界面顶替出来： 形成的乳浊液类型与原来的一致 它本身的表面活性 原来的表面活性 不能形成坚固的保护膜。3）乳浊液的破坏措施近20年来研究溶剂萃取技术与其他技术相结合从而产生了一系列新的分离技术，如：超临界萃取（Supercritical Fluid Extraction）反胶束萃取（Reversed Micel

15、le Extraction）液膜萃取（Liquid Membrane Extraction）微波辅助萃助（microwave-assisted extraction)双水相萃取（aqueous two-phase system) 溶剂萃取法新技术液膜：通常是由溶剂、表面活性剂和添加剂制成的。溶剂构成膜基体；表面活性剂起乳化作用，可以促进液膜传质速度并提高其选择性；添加剂用于控制膜的稳定性和渗透性。液膜萃取：通常将含有被分离组分的料液作连续相，称为外相；接受被分离组分的流体，称内相；处于两者之间的成膜的流体称为膜相，三者组成液膜分离体系。液膜把两个组成不同而又互溶的内、外相溶液隔开，并通过渗透现

16、象起到分离作用。一、 液 膜 萃 取二、双水相萃取一、双水相系统（一）双水相系统的形成某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定的浓度后可形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，形成双水相系统。2. 双水相形成当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，即一种分子周围将聚集同种分子而排斥异种分子，则在达到平衡时，就形成分别富含不同聚合物的两相。聚合物与盐类溶液也能形成两相，这是由于无机盐的盐析作用造成的。常见的双水相体系包括双聚合物体系：聚乙二醇/葡聚糖，（PEG/Dextran） 聚丙二醇/聚乙二醇， 甲基纤维素/葡聚糖体系单聚合物体系：聚乙二醇/硫酸钾体系（PEG/KPi） 聚乙二醇/磷酸铵体系

17、 聚乙二醇/硫酸钠体系四、 超临界流体萃取概念：利用超临界流体的特殊性质，使其在超临界状态下，与待分离的物料(液体或固体)接触，萃取出目的产物，然后通过降压或升温的方法，使萃取物得到分离。所谓超临界流体(SCF)即处于临界温度、临界压力以上的流体。 在临界温度、压力以上，无论压力多高，流体都不能液化但流体的密度随压力增高而增加。特点：密度接近液体 萃取能力强 粘度接近气体 传质性能好一、定义（一）临界点（二）超临界流体 在临界点以上的物质处于既非液体也非气体的超临界状态，称为超临界流体。反胶束萃取技术（Reversed micellar extraction）是近年来发展起来的一种新型萃取分离

18、技术，主要适合于蛋白质的提取和分离。是利用表面活性剂在有机溶剂中自发形成一种纳米级的反胶束相来萃取水溶液中的大分子蛋白质。五.反胶束法料液有机相胶团：将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束的浓度时，表面活性剂会在水中形成聚集在一起的聚集体，在通常情况下，这种聚集是水溶液中的胶团叫正常胶团或胶束。反胶团：将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，当其浓度超过临界胶束的浓度时，表面活性剂会在水中形成聚集在一起的聚集体，称为反胶团六.液固萃取是利用溶剂分离固体混合物中的组分，又称溶剂浸取。是利用固体物质在液体溶剂中的溶解度不同来达到分离的目的。液固萃取的过程：1.润湿：材料与浸取溶剂混合时，溶剂先附着

19、于材料表面，然后进入毛细管和细胞间隙。2.溶解：溶解可溶性成分。3.扩散：细胞中的可溶性成分溶于溶剂之后，通过毛细管和细胞间隙扩散出细胞并进入主体的过程4.置换：液固萃取的类型：酸浸取、碱浸取、水浸取、盐浸取、有机溶剂浸取。一、膜分离技术1.概念：利用具有选择透过性的天然或合成薄膜为分离介质，在膜两侧的推动力作用下，原料液液体或气体混合物中的某个或某些组分选择性的透过膜，是混合物达到分离、分级、提纯、富集和浓缩的过程。二、膜的分类1.按孔径大小：微滤膜、超滤膜、反渗透膜、 纳滤膜2.按膜结构：对称性膜、不对称膜、复合膜3.按材料分：合成有机聚合物膜、无机材料膜多孔膜与致密膜：前者微滤膜、超滤膜

20、、纳滤膜，后者反渗透膜、渗透蒸发三、常见膜分离方法1.按分离粒子大小分类：透析（Dialysis，DS）微滤（Microfiltration，MF）超滤（Ultrafiltration，UF）纳滤（Nanofiltration，NF）反渗透（Reverse osmosis，RO）电渗析（Electrodialysis，ED）渗透气化（Pervaporation，PV）第二节各种膜分离技术及分离机理微滤、超滤、纳滤、反渗透相同点：以膜两侧压力差为推动力；按体积大小而分离；膜的制造方法、结构和操作方式都类似。1 透 析由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓差的作用下，高分子溶液中的小分子溶质（如无机盐）透

21、过膜向水透渗透，这就是透析。2. 微 滤以多孔薄膜为过滤介质，压力差为推动力，利用筛分原理使不溶性粒子（0.1-10um）得以分离的操作。操作压力0.05-0.5MPa。3. 超 滤是以压力为推动力，利用超滤膜不同孔径对液体中溶质进行分离的物理筛分过程。其截断分子量一 般为6000到 50万，孔径为几十nm，操作压0.2-0.6MPa。3.反渗透利用反渗透膜选择性的只能通过溶剂（通常是水）而截留离子物质性质，以膜两侧静压差为推动力，克服渗透压，使溶剂通过反渗透膜实现对液体混合物进行分离的过程。反渗透的传质模型反渗透中溶剂和溶质是如何透过膜的，在膜中的迁移方式如何？ 溶解扩散模型优先吸附模型溶解

22、扩散模型适用于均匀的膜，能适合无机盐的反渗透过程，对有机物优先吸附毛细孔流动模型比较优越。溶解扩散模型 （无孔学说）认为膜是均匀的，无孔，水和溶质分两步通过膜：第一步：首先吸附溶解到膜材质表面上；第二步：在膜中扩散传递(推动力为化学位梯度)，扩散是控制步骤优先吸附-毛细孔流动模型（有孔学说）优先被吸附的组分在膜面上形成一层吸附层，吸附力弱的组分在膜上浓度急骤下降，在外压作用下，优先被吸附的组分通过膜毛细孔而透过膜。 与膜表面化学性质和孔结构等多种因素有关。由Sourirajan于1963年建立。他认为用于水溶液中脱盐的反渗透膜是多孔的并有一定亲水性，而对着一层纯水层，其厚度可为几个水分子的大小

23、。在压盐类有一定排斥性质。在膜面上始终存在力下，就可连续地使纯水层流经毛细孔。如果毛细孔直径恰等于2倍纯水层的厚度，则可使纯水的透过速度最大，而又不致令盐从毛细孔中漏出，即同时达到最大程度的脱盐。纳滤纳滤技术是反渗透膜过程为适应工业软化水的需求及降低成本的经济性不断发展的新膜品种，以适应在较低操作压力下运行，进而实现降低成本演变发展而来的。第三节膜分离过程膜两侧溶液传递理论许多研究者试图将通量表达成系统操作参数和物理特征的函数：对于纯溶剂或浓差极化前通量可用Hagen方程表示浓差极化-凝胶层模型（concentration Polarization-gel layer model）阻力模型（r

24、esistance model） 管状收缩效应(Tubular Pinch effect)的影响浓差极化-凝胶层模型这种膜面浓度高于主体浓度的现象称为浓差极化。改善浓差极化对策： 提高膜面剪切力，减少边界层厚度措施： 错流； 进料流速； 湍流程度提高，设备改进： a. 小型设备装搅拌； b. 装湍流促进器； c. 对料液施加脉冲，以不恒定的线速度进料; 温度不要太低。膜污染膜污染是指处理物料中的微粒，胶体或溶质大分子在膜表面或膜孔内吸附，沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化现象。膜污染的表现一是膜通量下降；二是通过膜的压力和膜两侧的压差逐渐增大；三是膜对生物分子的截

25、留性能改变。第八章 色谱分离法（二）色谱分离方法概念 色谱分离法是一种基于被分离物质的物理、化学和生物特性的不同，使它们在某种基质中移动速度的不同而进行分离分析的方法。一组相关分离方法的总称，它的机理是多种多样的，色谱分离的基本特点(1)分离效率高： (2)应用范围广： (3)选择性强：(4)高灵敏度的在线检测： (5)快速分离：(6)过程自动化操作：（三）色谱分离分类1.根据固定相形式分类柱色谱、纸色谱、薄层色谱2.根据两相所处的状态分类气液色谱、液固色谱、气固色谱、气液色谱3.根据分离的原理的不同吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等。1.装柱2.平衡3.上样4.洗脱(

26、六)色谱系统的操作方法5.流速及控制6.分部收集二、吸附色谱法（一）原理： 吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。 色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。 （二）薄层色谱 是吸附剂被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂层。干燥后在涂层的一端点样，竖直放入一个盛有少量展开剂的的有盖容器中。展开剂接触到吸附剂涂层，借毛细作用向上移动。与柱色谱过程相同，经过在吸附剂和展开剂之间的多次吸附-溶解作用，将混合物中各组分

27、分离成孤立的样点，实现混合物的分离。 1.基本原理：在一定条件下，吸附剂与被分离物质产生作用，这种作用主要是物理和化学作用两种，物理作用来自硅胶表面与溶剂分子之间的范德华力；化学作用来自硅胶表面的硅羟基与待分离物质之间的氢键作用。（三）吸附柱色谱法1.基本原理：是基于不溶性高分子化合物的作为介质的一种分离方法，通过化合物中的活性离子将溶液中带相反电荷的物质吸附在离子交换剂上，然后用适当的洗脱溶剂将吸附物质再从离子交换剂上洗脱下来，从而达到目的产物的分离、浓缩和纯化。三、离子交换色谱3.离子交换树脂的预处理、转型、再生、保存（1）离子交换树脂的预处理和转型a用清水冲洗至清澈无混浊、无杂质为止，b

28、用HCl和NaOH在交换柱中依次交替浸泡2-4h，在酸碱之间用大量清水淋洗，每次用量为树脂体积的2-4倍，完成预处理过程。 最后一步用酸处理使之变为氢型树脂的操作也称转型。对于强酸性树脂应用状态为Na型。阴离子交换树脂处理：如Cl型，按酸-碱-酸顺序处理；OH型按碱-酸-碱顺序处理。（2）再生：就是让使用过的树脂重新获得使用性能的过程。再生时，首先要用大量的水冲洗使用后的树脂，除去树脂表面和空隙间的各种杂质，然后用转型的方法处理。（3）保存 阳离子交换树脂为Na型，阴离子交换树脂为Cl型，应防止铁锈、油污、强氧化剂，有机物污染，应保持5-40.三、分配色谱的原理：是利用被分离物质中各成分在两种不相溶的液体只用的分布情况不同而使混合物得到分离。把其中一种溶剂设法固定，用另一种溶剂来冲洗，这种分离不经过吸附程序，仅由溶剂的提取来完成。第九章 蒸发浓缩、结晶和干燥一、蒸发浓缩是利用加热的方法使溶液中的一部分