第五章体外培养基本技术

1、第五章体外培养基本技术一、培养操作基本要领和要（一）无菌操作 防止污染是决定培养成败的首要条件。（二）培养前准备 操作野消毒 洗手和着装 火焰消毒（三）培养操作：动作要准确敏捷，东西摆放在 正确位置，防止污染。 二、基本培养操作技术（一）取材： 含有维持液或BSS的无菌标本瓶 。 除去组织表面上的血块和血迹，尤其开 放性器官来源的组织。 超净工作台内进行操作。 1cm3组织块。 取材后立即培养，否则4保存，以不超 过6h 为宜。（二）组织的分离 原则： 获取单细胞 同时尽可能不损伤细胞 常用方法 机械法化学法 1离心分离法：适用于血液、羊水、胸腹水细 胞的培养。注意： 低速离心，通常50010

2、00 rpm/min， 510min. 悬液量大时，离心时间 适当延长。 淋巴细胞分层液适用于分离血中淋巴细胞。 利用各种血细胞比重不同，使各类细胞相 互分开。 微量全血法LC培养时，不必进行 LC分离。 根据组织种类和培养要求，采用相应的分离手段： 2切割分离法：用眼科剪剪切或手术刀切割。 组织块培养时，剪切成1mm3大小的组织块。 所取组织多为1cm3，注意用Hanks液漂洗。 3机械分散法： 挤压法：适用于软组织（如脑组织），用注 射器粉碎组织。 不锈钢纱网（1mm、100m、20m网眼）压取法：仅适用于处理软组织，对较硬组织和纤维组织效果不好，网眼越小对组织的损伤越大。 4. 消化分离

3、法： 在把组织剪切成较小体积的基础上，应用生化和化学手段进一步分散小块组织的方法最终使被处理的组织分散成细胞团或单个细胞制成细胞悬液进一步培养。 （1）胰蛋白酶消化法： 与胰酶不同（胰酶除蛋白酶外， 还 包括淀粉酶和脂肪酶）适用于消化细胞间质较少的软组织， 如胚胎组织、上皮组织、肝、肾等 组织； 对单层细胞的作用也较好，适用于细 胞传代。 对纤维性组织和较硬的癌组织的消化作用 较差。 Ca2+、Mg2+对胰蛋白酶的活性有一定的抑 制作用，故需用D-Hanks液配制。 血清可抑制胰蛋白酶的活性，因此细胞传 代时，用胰蛋白酶消化细胞后，不必用 Hanks 冲洗。 两种消化方法 温消化：37，30m

4、in 1h 冷消化：4 ，1220h胰蛋白酶消化细胞法如下： 剪切：在去除不需要的组织后，使用无钙镁的平衡盐溶液清洗组织块，重复清洗2到3次。用无菌的解剖刀和剪子把组织切成1-2mm3小块。把组织块置入容器内，加入比组织量多3050倍的 的胰蛋白酶（预温至37）。 消化： 37水浴或温箱中消化3060min，每隔5 10min摇动1次；或在4孵育12到20小时，使胰蛋白酶尽可能渗透进去消化完毕，移入离心管中，800转/分 离心6 8min，吸除上清液Hanks液漂洗2 3min，离心去上清，两次800转/分 离心5min，去上清，加入一定量营养液，通过无菌不锈钢丝网（100-200目）过滤，计

5、数和接种细胞，进行培养 （2）胶原酶（Collagenase）消化法： Collagenase是一种由细菌提取出的酶，适用消化纤维组织、癌组织和上皮组织。消化作用缓和，无需振荡。 使用浓度200u/ml或，可与胰蛋白酶混合应用 。 用无菌解剖刀和剪子把漂洗干净的组织切成1-5mm3小块，移入培养瓶中，加入一定量培养液，再加入胶原酶，终浓度为200u/ml37孵育4 48小时；如消化缓慢可延长到 3 5 天，无需摇动，可换液1次如见组织块变软，散于瓶底，振荡后即散成细胞团和单个细胞，取培养液低速离心5min，去上清；重悬于BSS中，再低速离心5min，去上清胶原酶消化过程如下：加入新培养液制成细

6、胞悬液，计数后，接种进行培养 Trypsin Collagenase 消化特性 适应于消化软组织 消化纤维多的组织使用浓度 消化时间 2h 112hpH 8作用强度 强烈 缓和细胞影响 时间过长有影响 无大影响血清抑活 有 无Ca2+和Mg2+ 有影响 无影响 (3) EDTA消化法：非酶性消化物，用无Ca2+、Mg2+液体配制成 0.02% 的工作液。 螯合组织生存环境中的Ca2+、Mg2+，促进细胞相互 分离。与胰蛋白酶按1：1或2：1比例混合使用，消化作用更好 EDTA消化细胞后，一定要用Hanks液冲洗干净，因培 养环境中残留的EDTA对细胞生长有不良影响。 作用比胰蛋白酶缓和，消化传

7、代细胞，不用来消化新鲜 组织 。（三）细胞计数法 以细胞数/毫升表示 1细胞活力检查：0.4%Trypan Blue（台盘蓝） 与细胞悬液按1：10比例混合，健康的活细 胞胞体完整，透明不着色，凡着色细胞均 为不健康细胞。 2细胞计数： 如偶见由两个以上细胞组成的细胞团，按单个细胞计算，若细胞团数10%，说明消化不充分，细胞数少于200个/10mm2或大于500个/10 mm2说明稀释不当。 3. 结果分析 细胞死亡后，细胞膜通透性增加，台盘蓝进入细胞，导致细胞蓝染。 台盘蓝染色法是一种粗略检测细胞存活的方法，不能准确反映细胞活力差异。 细胞活力（%）（总细胞数着色细胞数）总细胞数100%4.

8、 注意事项：含有台盘蓝的细胞悬液不宜放置时间过长，否则正常细胞可摄取染料，影响染色结果。(三) 细胞冻存1 原理：不附加任何条件下，直接冻存细胞 时，细胞内外环境的水会结成冰晶， 能导致细胞发生一系列变化，如机 械损伤、电解质升高，渗透压改变、 脱水和PH改变等 细胞死亡。 如向细胞培养液中加入保护剂甘油或DMSO，可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，能使细胞内 水分在冻结前渗出细胞外，避免细胞损伤。2. 材料 仪器设备：液氮罐、超低温冰箱（-7085） 冻存管：容量为12ml 消化液：0.25%胰蛋白酶或与0.02%EDTA混合 的消化液 冻存液: 培养液、FBS和DMSO或甘油 待冻存细胞3

9、注意： （1）细胞在-50最易受损 （2）为保存细胞最大存活率，一般都采用慢冻快融的方法，掌握好冻存速度。标准的冷冻速度为-1 -12 /分钟；当温度下降到-25 时，下降速度可增至-5 -10 /分钟；到-100 时可迅速冻入液氮中。 （3）冻存一年后，应再复苏培养1次，然后继续冻存。 （4）待冻存细胞应具有较高的活力，即处于对数生长期的细胞。 （5）常温下DMSO对细胞有毒副作用，因此冻存液需在4下放置4060min后使用。4 冻存程序： 选取对数生长期细胞（收集前24h换液1次）离心去上清，加细胞冻存液密封, 放入液氮，标明细胞名称、存放日期分装入2ml无菌螺口冷冻管，每管细胞悬液细胞计

10、数：常规法制成细胞悬液（107/ml） （四）细胞的复苏 自液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37 水浴离心管吹打、漂洗，5001000rpm离心5min吸出细胞悬液，补加10ml细胞培养液again 加适量培养液稀释（1：10或1：20），分装细胞培养瓶（细胞密度5105个/ml）37，次日换液【结果分析】 1. 细胞存活率 用台盘蓝染色法检测复苏细胞的活性，细胞存活率（%）未着色细胞总计数细胞100% 2. 复苏效果取决于复温速度。【注意事项】 1. 必须在12min内使冻存液完全融化，如果复温速度太慢，则会造成细胞损伤。 2. 注意防护复苏后细胞培养24h培养48h（四）细胞运送两种方法 1

11、. 液氮或干冰保存，由于二者蒸发较快，用小 液氮罐较麻烦，只适于空运。 2. 充液法 ： 80%90%细胞汇合时，换新培养液。 到本实验室后，留正常量培养液，37培 养，液体分批用。 二、常规细胞培养法 天然培养基培养法：取自动物体内天然 成分培养细胞。 人工合成培养基培养法：合成培养基成 分清楚，便于分析和人工调控。 合成培养基单细胞培养为近代主要的培养方法。 特点：组织和细胞刚刚离体，生物学性状尚未发生很大变化，具有二倍体遗传性状。在供体来源充分、生物条件稳定情况下（年龄、性别），在一定程度上能反映体内状态，适于做药敏试验。初代培养所有机能上的改变，主要是表型上的改变，不一定是体细胞突变。

12、初代培养细胞是研究基因表达的理想系统。是建立各种细胞系（株）的必经阶段。异质性，初代培养的组织由多种细胞混合形成，在分析细胞生物特性时有一定困难。 （一）原代培养法：又称初代培养，是从供体获取组织 后的首次培养。1. 消化培养法 主要用品： 人或动物的新鲜组织 0.25%胰蛋白酶 Hanks液 含10%20%牛血清的培养液 眼科剪刀、眼科镊 吸管、培养皿、瓶和不锈钢筛网、计数板等。初代细胞培养主要方法：流程：（注意无菌操作）15cm3新鲜组织用Hanks液漂洗23次眼科剪将组织剪成约1mm3的小块加30 50倍原组织块的0.25%胰蛋白酶液温消化37，14h 或 冷消化4 ， 624h 不锈钢

13、网滤过除去大块组织所得细胞悬液5001000rpm低速离心，5min 弃上清，加适量营养液（含血清），吹打均匀制成细胞悬液 计数（5105个/ml），细胞密度过大时，补加营养液调整 37培养，注意PH值（7.2 ） 冷消化 例：乳鼠肾细胞原代培养 （1）准备工作： 培养用品消毒后，放在超净工作台内 紫外线消毒，做好各项准备工作. 点燃酒精灯，用品按布局放置，安装 吸管等 采用颈椎脱臼法，将一只新生乳鼠处死 将小鼠放入盛有70%酒精的烧杯中数秒 置超净工作台内（二）取材： 打开消毒器械包 用镊子掀起乳鼠腹部皮肤,用解剖剪剪开腹腔,充分暴露腹腔。 用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧,充分暴露位于腹腔

14、背壁脊柱。 取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中 用吸管吸取PBS加入培养皿中，清洗肾脏3次，尽量去掉血污。 将肾组织用解剖剪剪成几块，再用PBS漂洗，洗净血液为止。（3）胰蛋白酶消化： 将洗净的组织块移入消毒小瓶中，用眼科剪剪切至0.5 mm 大小的组织块。 加入1020倍体积的0.25%胰蛋白酶，放入37水浴中消化3060分钟，注意应每隔1015分钟振摇1次。 当组织块变得疏松，颜色略白时，取出置于超净工作台内用吸管反复吹打组织块，使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态。 加入12ml培养液终止消化，净置片刻，让未消化完的组织块自然下沉，将上部的组织悬液移入无菌离心管中。（4）离心及计数 以8

15、001000r/min低速离心810min，超净工作台内开盖，取上清加入适量培养液，细胞计数后分装。 在细胞瓶（板）上标明细胞名称，代数，日期。 倒置显微镜下观察细胞分散情况后置37培养箱中培养。（5）细胞观察 培养细胞每天观察，检查：A.污染与否? B.细胞生长状态 如见培养液变为黄色且又混浊，为污染；如培养液为桔红色，表明细胞状况良好。在无污染时，4h内有细胞贴壁，圆形悬浮状的细胞延展成多角型。 培养34天，细胞生长繁殖，可见细胞岛形成。细胞透明，颗粒少，界限清。 由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时应换液。胰蛋白酶消化培养法特点：能把组织块分

16、散成细胞团或单个细胞，便于细胞从培养液中摄取营养和排出代谢产物，细胞能较快长成单层。尤其适用于培养大量组织，细胞产量高。用于经常性小量培养工作稍显繁琐，易污染。2组织块培养法 不用消化液 尽可能剪碎 两种技术： 翻转干涸法（37温箱中） 薄层营养液培养法2h（不超过4h)小块相互距离以为宜37加入培养液少许 小结 动物细胞的培养步骤： 切取拟培养的动物器官或大组织块 洗去血污 剔除多余成分切成约1mm3大小的组织块 将所有组织剪碎用于组织培养 蛋白酶溶液消化 机械方法吹打组织块 离心、培养液悬浮 计数、调节细胞密度 用于分离细胞培养（二）传代培养法： 细胞达到80%以上汇合或刚汇合时是理想的

17、传代阶段。 1. 用品： 80%以上汇合单层细胞 0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA Hanks液 细胞培养液 培养瓶 吸管 2流程：弃去细胞培养瓶中旧营养液加适量消化液胞质回缩，细胞间隙增大时终止消化 弃去消化液，加Hanks液轻洗单层细胞 用吸管吸取营养液轻轻吹打瓶壁细胞，使之脱落制成单细胞悬液 分装细胞培养瓶，37，CO2培养箱培养 3注意： 掌握好传代时机，80-90%左右汇合最好（过早细胞数量少；过晚细胞健康状态不佳） 消化时间适度（过短细胞不易从瓶壁脱落；过长细胞脱落流失受影响） 消化液浓度要适宜 不同细胞对消化液的反应不同三、特殊培养法 1二倍体细胞培养法：是指培养的细胞始终

18、维持二倍体生物学性状的培养方法。 正常细胞的原代培养即为二倍体细胞，但长期旺盛地增殖生长，并保持二倍体性状并非易事。 种细胞（stock）冻存细胞（stock-2）使用细胞冻存细胞（stock-1）使用细胞使用细胞冻存细胞（stock-2）冻存使用冻存使用冻存使用冻存使用 低温冻存：措施： 采用妥善的培养方法：严格控制PH，最好在5%CO2培养箱中培养。换液时间间隔不能太长，部分换液。掌握好传代时机，传代期不能过长，细胞不能过于密集，应及时传代。高质量血清和培养基，尽量维持不变。每次传代均一分为二（细胞数量、营养液量、培养瓶空间和面积不变）进行培养。传代后细胞如不用于实验，立即低温冻存。2加支

19、持物培养法：预先向培养容器内加入各种可使细胞贴附的支持物，进行培养的方法。（1）玻璃片：便于进行各种固定、染色处理 和观察。盖玻片做支持物的处理：自来水浸泡24h 96% 酒精3060 min 蒸馏水浸泡30 60min 干净软布擦干净 装入培养皿 高压灭菌备用（2）聚四氟乙烯：适于做电镜技术，可以进行 包埋和切片。 特点： （1）可在任何时间取出支持物，做各种观察和实验。 （2）需将支持物处理干净，不残留任何对细胞有害成分，避免不利因素影响细胞贴附和生长。3单细胞分离培养（又称细胞克隆） 即把单个细胞从群体内分离出来单独培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。 细胞经克隆后，形成纯系

20、，称细胞株。要点和原理 细胞群体单细胞培养新的细胞群体纯系 基本原则：保证分离出的细胞确为一个而不是两个或更多。 理论上各种培养细胞都可进行克隆培养，但原代培养细胞和有限细胞系（二倍体细胞）较困难，而无限细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞则较容易。细胞对营养液的同化作用，具有促克隆细胞生长作用。不同细胞同化营养液的能力不同。对培养环境适应性强和具有较强独立生存能力的细胞均易做细胞克隆。克隆细胞时，要把细胞制备成单细胞悬液，再接种到底物上进行培养，让细胞单独生长。适应性大和活力好的细胞能增殖形成细胞小群（Colony)克隆。原理： 无限细胞系，不低于10%； 原代细胞、有限细胞系，5%。 Coloni

21、ng Efficiency克隆形成率（Coloning Efficiency）： 细胞群中单个细胞形成克隆的百分数称克隆形成率，也称接种率（Seeding Efficiency)。用于表示细胞生活力和独立生长能力。克隆形成率与细胞的密度成正比 培养基：自制适应性培养基是一种不含 细胞而已被细胞生活过或同化过的培养基。 选取同源指数生长期细胞（半汇合）换培养液1次继续培养2448h后，吸取所有培养液3000-4000rpm，离心10min 提高克隆形成率的措施上清用微孔滤膜过滤（避免形成假克隆），低温冻存备用用时取1份适应性培养基+2份新配制培养基混合使用血清：胎牛血清小牛血清马血清，灭活处理56，. 应先做克隆形成率实验，选最佳者使用。激素：含110u/ml的胰岛素培养液能促进很多 细胞克隆的形成。CO2：CO2对绝大多数细胞克隆形成率都有提高，多用5%，成纤维细胞和胶质细胞2%.饲细胞（Feeder cells）：也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底