实验四PCR产物的T载体克隆和转化

1、医用分子生物学实验(shyn)技术青海大学医学(yxu)硕士研究生课程共四十页重组(zhn z)DNA技术操作步骤共四十页基本原理目的基因的获取DNA导入受体细胞外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达 共四十页主要步骤： 制备目的基因和选择相关载体 目的基因和有关载体进行(jnxng)连接 重组的DNA导入受体细胞 DNA重组体的筛选和鉴定 DNA重组体的扩增、表达和其他研究共四十页 以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程共四十页 （三）PCR扩增特定(tdng)基因 （四）人工合成(rn n h chn)一、目的基因的获得分 （一）从基因组文库中获得 （

2、二）从cDNA文库中获得共四十页组织(zzh)或细胞染色体DNA基因(jyn)片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合从基因组DNA文库获取目的基因共四十页限制酶切位点限制酶消化 除去中间片段cos LR coscos L左臂R cos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库用随机切割的真核生物(shngw)染色体DNA片段构建基因文库 共四十

3、页mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取(huq)目的基因 逆转录酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶碱水解 T T T T共四十页化学合成法获取目的(md)基因由已知氨基酸序列(xli)推测可能的DNA序列(xli)。共四十页几种常用(chn yn)克隆载体的比较注：+表示(biosh)可用；-表示(biosh)不可用比较内容 质 粒 噬菌体 黏性质粒 M13噬菌体克隆容量 10 kb 22 kb 4050 kb 1 kb基因组DNA文库 - + + -cDNA文库 + + - -亚克隆

4、+ - - +序列分析 + + - +E.coli表达 + + - -二、载体的选择与准备选共四十页三、DNA分子(fnz)的体外连接接（一）黏性末端(m dun)（二）人工接头的使用（三）加入同聚体尾（四）平端连接共四十页（一）黏性末端(m dun)共四十页（二）人工(rngng)接头共四十页（三）加入(jir)同聚体尾待克隆(k ln)DNA片段重组质粒混合、退火空白质粒共四十页（四）平端连接(linji)共四十页5335载体(zit)DNA5335目的(md)基因限制酶或机械剪切限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 353 A(A)nA A(A)nA -核

5、酸外切酶-核酸外切酶末端转移酶+ dATP末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶15C重组体535共四十页四、外源DNA导入宿主(szh)细胞转受体菌条件：安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷(quxin)处于感受态(competent) 导入方式：转化 (transformation)转染 (transfection)感染 (infection)共四十页 外源基因(jyn)导入宿主细胞后，筛选含有目的基因(jyn)的阳性克隆并加以扩增。 所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。五、目的(md)基因的筛选和鉴定筛共四十页1.

6、借助载体上的遗传标志进行筛选 (1) 利用(lyng)抗生素抗性标志筛选(2) 利用基因的插入失活/插入表达 特性筛选(3) 利用标志补救筛选(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选2. 序列特异性筛选(shixun) (1) RE酶切法 (2) PCR法 (3) 核酸杂交法(4) DNA测序法 共四十页（一） 遗传学方法(fngf) 1. 插入(ch r)灭活法共四十页插入失活筛选带有重组载体(zit)的克隆 共四十页共四十页2. 蓝-白筛选(shixun)（互补） 许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有-半乳糖苷酶基因(jyn)（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码

7、序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成有活性的-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。共四十页互补(h b)筛选（蓝-白筛选） 共四十页共四十页PCR产物(chnw)的T载体克隆和转化 共四十页实验目的： 学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。实验要求(yoqi)： 掌握利用T载体克隆PCR产物的方法；复习连接实验流程。技术应用： 目的基

8、因片段与T载体DNA连接，达到克隆基因的目的。共四十页材料：目的基因(jyn)片段（回收的PCR产物）药品：pEMG T-Vector (Promega公司)共四十页质粒（plasmid） 是存在(cnzi)于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子。大小约为 数千碱基对。常 有1 3个抗药 性基因，以利于 筛选。共四十页质粒载体(zit)克隆的质粒载体(zit) 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。共四十页共四十页实验(shyn)原理普通Taq酶会在3末端加一个A，这样所有PCR产物都会在双链DNA的3端均有一个单链状态(

9、zhungti)的A；T-载体是线状DNA片段，在DNA双链的3端均有一个单链状态的T；二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，从而达到克隆的目的。共四十页载体结构的三大要素(yo s)： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位共四十页pGEM-T 载体(zit)的结构共四十页pGEM-T Easy 载体(zit)的结构共四十页实验(shyn)步骤（1）目的片段的制备(zhbi)-胶回收法回收PCR产物：共四十页(2)连接实验： 在0.2ml PCR管加入以下试剂： 目的片段(pin dun)（100ng/ul） 3l pGEM-T Easy（50ng/ul） 1l T

10、4 DNA Ligase 1l 2Rapid Ligation Buffer 5l Total 10 L 备注：混合均匀，瞬时离心。 4连接16小时，-20储存或直接用于转化。共四十页说 明1.回收(hushu)DNA片段可以用沉淀法，但是只适用于PCR扩增产物为单一片段，而且需要检测PCR扩增结果后进行；2.此种连接方法是根据普通Taq酶会在3末端加一个A的原理发明的；注意不同的酶的性能不同，保真性强的Taq酶会自动切除末端的A，所以，这种酶的扩增产物需要补加A后再连接。3.T-载体的阳性克隆筛选同样可以使用“蓝白斑”法，方便，快捷。共四十页内容摘要医用分子生物学。一、目的基因的获得分。存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。二、载体的选择与准备选。三、DNA分子的体外连接接。四、外源DNA导入宿主细胞转。限制酶和重组酶缺陷(quxin)。外源基因导入宿主细胞后，筛选含有目的基因的阳