曲唑酮盐酸盐

1、曲唑酮盐酸盐与牛血清白蛋白相互作用的研究S. Ashoka, J. Seetharamappa*, P.B. Kandagal, S.M.T. Shaikh摘要在本文中，曲唑酮盐酸盐（TZH）结合牛血清白蛋白（BSA）在模拟生理技术 条件下进行了研究（荧光光谱，光谱和圆二色）。观察到很强的荧光猝灭反应TZH- BSA和猝灭机理，表明为依据斯特恩-Volmer方程的动态猝灭。与BSA的结合常 数设计在 288, 302 和 309 之间计算公式为 KC1.567 0.003）104（2.31，70.002） 104和（5.447 0.004） 104M1，分别的热力学参数H和S得到为39.867

2、0.008 千焦每摩尔和217.89 7 0.011 J摩尔每K，明显，这表明与BSA之间的疏水作 用力的存在。光谱结果表明，如果对BSA的结合引起的构象变化BSA。基于在非 辐射能量转移的Forster理论，结合平均距离R之间的供体（BSA）和受体（TZH） 被发现是2.4纳米。常见离子的结合TZH BSA的影响也存在。2005 Elsevier B.V.保留所有权利。关键字：牛血清白蛋白曲唑酮盐酸盐 相互作用1简介牛血清白蛋白（BSA），在血浆蛋白其中一个主要的成分，是一个单链582 个氨基酸的球状与17胱氨酸EUES交联（硫醇）。它分为三列，结构极其明显， 和EVO路相关领域（I-III

3、）；每个域是由两个子域（A和B）组成。牛血清白蛋 白有两个色氨酸嵌入在两个不同的域，色氨酸-134和色氨酸-214。BSA的结构类 似于人类占76%的血清白蛋白HSAN 2 。人血清白蛋白是一种球状蛋白由58 氨基酸CO5的结构，类似的DOM中的酸树脂（I-III）每一个包含两个细分生物 感知（A和B）稳定的17二硫桥，它只有一个色氨酸-214位于沿链，在子域IIA。 比如其他血清白蛋白，牛血清白蛋白作为一系列的生理作用涉及结合，运输，传 递脂肪酸，卟琳，类固醇，这是与金属，药品和染料特异性结合点1 。众所 周知许多药物被绑定到血清蛋白质，特别是血清白蛋白。药物效能依敕他们的判 别能力。亲和力

4、也影响测试分解代谢药物的速率。所以，结合药物的研究提供了 对BSA信息的结构特点，成为一个化学是非常重要的研究领域，生命科学与临床 医学。光谱技术（UV / V荧光和循环）是有助于研究之间的交互作用药物，在血 浆蛋白和血清中研究白蛋白，因为他们的高敏感性，他们的优点超过常规的AP - 方法，采用了药物-蛋白结合按亲和力大小排列，平衡透析。曲唑酮主要被用于抗抑郁的代理功能，更有用的抑郁症患者用这种药，包括 精神分裂症或神经障碍的。最常见的副反应所遭到的有嗜睡，恶心/呕吐，头痛 和口十，皮疹，瘙痒，关节疼痛，肌肉7 。在高剂量时曲唑酮可能是增加在发 病或任何程度不良反应的一个原因。鉴于其生物的重要

5、性，我们认为这是第一次 报告关于BSA结合牛血清白蛋白的内部作用和机制。Fig一 I. StruGtiirc of trazodone hydrochloride.2实验2.1仪器日立荧光分光光度计模型F-2000带有150 W氙灯和5 nm狭缝的新的医学 荧光测试手段在应用。1厘米石英池用于测量，CD测量进行于j-715谱介于0.1 厘米到0.2纳米之间，在三扫描平均每个CD光谱200-250 nm的范围内。吸收 光谱被记录在装有150 W氙灯和5 nm的狭缝宽度的双束紫外可见50-bio-光谱 计中。1厘米石英池是用于测量应用。2.2试剂牛血清白蛋白（第五组分，约含99%蛋白；自由基和G

6、-蛋白酶）源于西 格玛化工公司，圣路易斯。曲唑酮盐酸盐从印度、孟买获得的样品。在pH值为 7.4,含0.15 M NaCl缓冲液、0.1 M磷酸制备TZH与BSA的方案。牛血清白 蛋白溶液基于65000分子量所制备。所有其他材料、分析试剂和双蒸馏水均被投入使 用。2.3 TZH -BSA 反应BSA （12毫米）的荧光光谱记录在曲唑酮盐酸盐（8-50毫米）仪表上，在 288,302和309 K条件下于300至500纳米的范围内对每一种情况下于296 nm 的激发态。牛血清白蛋白CD光谱在药物（比例1： 4, 1:10和1:16）存在与否 情况都有记录。2.4 一些常见离子的影响记录了各种常见离

7、子存在下TZH -BSA的荧光强度的研究，SO42-、F-，、 NO3-、CH3COO-，Mg2+,、Ca2+,、K+,、Cu2+和 V5+在 344 nm-296 nm 的激 发条件下。BSA和Co浓度被固定在12毫米而常见离子维持在5毫米条件下。3结果和讨论3.1荧光猝灭的研究对大分子，荧光测量可以提供一些组成蛋白质小分子的信息，如结合机理， 结合模型，结合控制，结合位点和分子间距。一种化合物的荧光强度可由多种分 子的相互作用，激发态反应，分子受热，能量转移，基态复合物的形成和碰撞而 减少。这样导致的强度下降叫做猝灭。BSA的荧光光谱记录了在不同含量的牛 血清白蛋白并且高于296 nm处的

8、300-500纳米范围的数值。牛血清白蛋白引 起了 BSA内部荧光的浓度淬灭（图2）没有改变辐射量从而表明TZH和BSA 之间有相互作用。对于TZH，它的最大辐射波长为438 nm，荧光强度由于BSA 的存在而增加。这表明TZH与BSA的结合了牛血Fo/F = 1 + Asvy,清白蛋白的内部荧光性，因此TZH的的荧光性是增强的。TZH与BSA的相互作用通过吸收和CD技术大大加强了。荧光猝灭数据 通过斯特恩-Volmer方程分析。其中f和F是稳定状态下分别为有无猝灭的荧光强度，KSV是斯特恩-V olmer淬 火常数，Q是TZH的浓度淬灭。结果如图3所示。KSV和R2在不同的温度下的值如表1所

9、示。图的线性度可以揭示淬灭类型，静态的或动态的，淬火曲线的特 征是曲率向上11,12。100806040200300350400450500Wavelength (nm)波长|曲线(X)是TZH的荧光光谱线，牛血清白蛋白存在情况下TZH为(b-g)。BSA 的浓度为 12m M (a)。TZH 的浓度分别为 8 (b), 16 (c), 25 (d), 33 (e), 42 (f) 和50 m M(g).BSA在296 nm处受激发。单独的TZH浓度为8mM (X)，单独的 TZH荧光波长为296nm。线性Stern-Volmer谱线图，然而，不能确定淬火类型，而其他的信息是依 据这些计算得到

10、。鉴定动力与静态猝灭的方法之一是检查药物对BSA的温度效 应。这些结果表明TZH对BSA的荧光淬灭机制是一个动态猝灭过程，因为K wSV 是随着温度. | _；一 的增加而增加，荧光数据进一步被Stern-Volmer方程所验证。其中f是易于被淬灭的一部分荧光，如图4, F0/ (F0-F)与1 / Q对应，f 和KSV的值从相互作用的曲线斜率可得到，f的值被发现是1.02 + 0.01表明98.03 土 0.09%BSA的总荧光易于被淬灭的。13 3.2结合平衡分析BSA与TZH相互之间猝灭是自发的，并且效率为100%的。当小分子单独 的与一系列等量的大分子的位点结合，自由分子和结合分子之间

11、的常数通过方程 计算：log(F。 F)IF = log K + 打 log Q,式中K和n分别为结合常数和结合位点的数目。通过log(F0-F)/F)logQ 的图像得出 K 和 n 的值分别为(13.490.038)X105LM-1 和(1.060.011)。n 的值约等于1表明在BSA上存在一类BPR结合位点。在BSA上参与结合的色 氨酸残基可以是色氨酸135或者色氨酸214。或者这两种色氨酸在BSA上都存 在，色氨酸135更多的是暴露在亲水性环境中，而色氨酸214深藏在疏水环中。 所以，从n的值可以提出BPR最有可能与位于IIA子域的疏水端结合，也就是 说色氨酸214靠近结合位点或者在

12、其里面。Fig. 3- The Stern-Vo liner curves for the binding of TZH withBSA at 288 K 302 () and 309 ( ). Excitation wavelength Fig. 4. Modified Stern-Volmer plot for 比巳 binding of TZHwas 296nm. BSA = 2fiM.will】 BSA,Table 1Thermodynamic parameters of BSA-TZH systemr(K)K蚁 x IO-4RAG(kJ moF1)A护(kJ mol-1)履(Jmor

13、lK-1)2881.68 0.0010.9974-23.13 0.0033022.41+0.0020.9967-25.23+0.00139.S6 +0.008217.89 + 0.011309182 0.0040.9983-28.01 0.002logQ3.3 TZH与BSA之间的结合模式在288K, 302 K和309 K.分别作了结合研究，在这些温度下，BSA没有发 生任何结构变化，当小分子单独的与一系列等量的大分子的位点结合，自由分子 和结合分子之间的常数通过方程计算：log AT = AH/,303RT + AW/2.303R式中，H。，AG0，AS0分别是焓变、自由能变和熵变。log

14、K对1 / T的曲 线（图6），这些测的值见表1。Ross和Subramanyam，描述了发生在不同 类型蛋白质结合过程中的动力学参数的大小和单位，从水分子结构的角度来看， 正的熵变产生的原因是由于水分子有序的排列在药物周围，-的负值表明相 互作用过程是自发进行的。富 和上、的正值表明在TZH与BSA的结合中疏 水性相互作用发挥了 4.8作用。3.440.003230.003320.003411/TK10.0035TZH与BSA之间能量的传递BPR的紫外吸收光谱和BSA的荧光发射光谱的重叠如图7所示。根据福斯特非辐射能量转移理论，能量转移的速率取决于：(i)供体的相对方向和受体的偶 极性,(ii)供体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度,(iii)供体和受体之间 的距离。能量转移的影响不仅和受体与供体之间的距离有关还和临界能量转移的 距离Ro有关，这是Ao 感+产式中F和Fo分别是存在和不存在BPR时BSA的荧光强度；r是受体和供体之 间的距离；Ro是能量转移效率为50%时是的临界距离。汀的计算通过方程： = 8.8 x 10-式中k2为偶极空间取向分子,N为介质折