SOD酶活力测定实验

1、摘要：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（SephadexG-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力以及总蛋白不断减小，比活力不断上升，最终得到的结果为总纯化倍数为0.68，活性得率为5.24%。一、前言：超氧化物歧化酶简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶。分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。在微生物中主存于需氧菌。SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（

2、O.）,生成HO和O.HO由过222222氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2,从而减少自由基对有机体的毒害。它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶,其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质，证明它无毒，无抗原性，能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。SOD作

3、为治因而受到医药界的关注。目前中国国内已进入临床试验阶段。本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。二、实验材料与方法：一材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.二试剂:葡聚糖（sephadexG-100）,NaCl（AP）,磷酸氢二钠（AP）,磷酸二氢钠（AP）,三羟甲基氨基甲烷（Tris）,盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）,PEG6000，考马斯亮蓝G250,磷酸，乙醇（95%），牛血清蛋白BSA,连苯三酚（焦性没食子酸），ED

4、TA（钠盐），超氧化物歧化酶（sigma公司）。三仪器:离心机，紫外分光光度计，柱层析装置，玻璃层析柱，匀浆机，各型号烧杯、试管、量筒，带毛塞试管，漏斗，移液枪，移液管，玻璃棒，电子天平等。四实验方法和步骤：称25g绿豆，洗涤，蒸馏水浸泡过夜，加入250mlpH70.05mol/Lpb液，匀浆机匀浆，两层纱布过滤，离心（3000rpm）得清液，取少量清液作为样1进行SOD活性测量，计算材料中SOD总活性单位及比活性单位（units/mgPr）。所得清液测量总体积，缓慢加入硫酸铵至35%饱和度，浓度为19.4g/100ml,4C冰箱静置分层。离心（3000rpm）取清液，取少量为样，测量SOD活

5、性、蛋白质含量测量，计算SOD总活性单位及活性单位。步骤3中的清液缓慢加入硫酸铵至65%饱和度（过程充分搅拌），5C至分层，离心（3000rpm）取沉淀，取样，计算SOD总活性单位及活性单位。准备透析袋：透析袋事先预处理，Na2CO310g/L,EDTA1mmol/L煮沸30分钟，蒸馏水洗涤，并浸泡于5C中备用。所得清液测量其部体积，缓慢加入硫酸铵至65%饱和度（18.4g/100ml）（过程充分搅拌），5C静置至分层澄清，离心除去清液，得沉淀。沉淀溶于水并定容到一定体积，装入透析袋，于蒸溜水中透析过夜。透析后溶液用滤纸过滤得清液。重新装入透析袋中用PEG6000包埋进行浓缩。装柱：先向柱内加

6、满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，排出里面的气泡，特别是要排除床底支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的15%。调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除。但稀释度太高则一次装柱的高度不够。将一根直径稍小的玻璃棒插入层析柱底部，沿玻璃棒将胶浆徐徐注人柱内，一边灌胶，一边提起玻棒。注意避免产生气泡。柱要一次装完。柱装好后，停10min，然后打开出液口，排出过量洗脱剂。柱内胶面上部保留23cm洗脱剂。再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。流过至少2倍住体积的洗脱剂之后，流速开始稳定下来（层析柱平衡过程,1ml/min,1.5h）。调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，

7、得到理想流速（1ml/min）加样：上述浓缩液过滤后得清液加样，要尽量快速、均匀。一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1%5%（质量分数）左右.（这里用5%）。加样应加于柱中心，避免沿柱壁加入。洗脱：恒压重力洗脱。这里采用1ml/min,一般每一收集部份不大于2ml,本实验因为仪器的数量问题，每份收集4ml,收集液总体积为柱床总体积的1.2倍即完成收集。体积20ml层析过程：样品：浓缩液T离心T过滤T葡聚糖凝胶层析分离纯化SOD实验结果表4.葡聚糖G100凝胶层析洗脱曲线（以A280吸收作为蛋白质含量的相对值）试管号(1)(2(3(4)(5)吸光值（nm）0.5710.7830.9390.

8、6560.481试管号(6)(7)(8)(9)吸光值（nm）0.3010.2270.1550.077试管号(10)(11)(12)(13)吸光值（nm）0.0850.0520.0370.046图2.葡聚糖SephadexG100凝胶层析分蛋白质洗脱曲线经连苯三酚粗测，3号管颜色最浅，而根据蛋白质洗脱曲线看出3号管位于蛋白质含量峰上，所以选取3号管作为目的试管收集SOD，测量其准确SOD活力和蛋白含量，计算SOD比活力。连苯三酚自氧化速率:连苯三酚=10ul;A=0.064表6.连苯三酚测样品5S0D活性（A325）试管号连苯三酚/ul样品ul/AA(1)10100.035(2)10100.03

9、7(3)10100.041(4)10100.033(5)10100.037(6)10100.029(7)10100.032(8)10100.035(9)10100.040(10)10100.028(11)10100.041(12)10100.034(13)10100.036计算得：比活力Kd.064-0.041）/0.064x2=0.72提取液的总活力0.72x（5一0.01）=360总蛋白量（5一0.01）x0.04738=23.69SOD的比活力360十23.69=15.20得率的计算：得率二本次总活力/上次总活力X100%SOD总得率二最后样品活力/样1活力X100%360/6868X1

10、00%=5.24%纯化倍数的计算:纯化倍数=比活2/比活11.0621.01=1.050.9121.06=0.861.0620.91=1.160.7221.06=0.68步骤总活力（U）总蛋白（mg）比活力（U/mgpro）纯化倍数样16868670.7510.24样26943586.2911.841.05样31820159.4411.410.86样435327.7512.731.16试管336023.6915.200.68+系列1图3.各纯化步骤中SOD总酶活变化趋势+系列1图4.各纯化步骤中SOD总蛋白含量变化趋势总结：试验首次接触到SOD的分离纯化技术，让我熟悉并且理解到了酶纯化的过程。

11、虽然实验中有几次操作出现了问题导致记录了错误的数据，而且因为当时操作的时候对实验并不熟悉，所以并不知道所测结果误差比较大，导致在最后处理数据的时候才发现数据误差不在可接受范围内。而且实验过程中的仪器也不是很准确，经常发生失误。所以实验数据不是很理想。尽管如此，但本次实验的目的在于熟悉掌握酶的分离纯化技术，了解一般酶分离纯化的步骤。经过这次实验，也深刻体会到酶分离纯化的步骤，希望能在接下来的实验里面得以应用。本次实验历史三周，材料中酶蛋白的活性在最后实验中已经是一种几乎没有活力的状态，从曲线图可以看出前两周的酶活力以及蛋白还保持在一个比较好的状态，而第三周开始呈现出极大的衰弱的趋势，导致实验后期的数据没有明显的意义，希望以后实验可以安排在一周或者两周里面完成，可以让数据更加有分析性，整个实验也更有意