分析化学第9章吸光光度法

1、分析化学第9章 吸光光度法Spectrophoto metry返回基本内容和重点要求掌握物质对光的选择性吸收、吸光度和透光度、朗伯比耳定律及摩尔吸光系数等知识；了解比色分析和分光光度法的特点、基本原理、仪器构造和各部件的作用；学习显色反应和显色条件的选择；理解分光光度法定量分析中各种影响因素；了解紫外吸收光谱法的特点及应用。返回第9章 吸光光度法9.1 吸光光度法基本原理9.2 目视比色法及光度计的基本部件9.3 显色反应及显色条件的选择9.4 吸光度测量条件的选择9.5 吸光光度法的应用9.6 紫外吸收光谱法简介9.7 分子发光分析法简介返回9.1 吸光光度法基本原理一、方法依据及分类二、方

2、法特点三、光的基本性质四、物质对光的选择性吸收五、光的吸收基本定律朗伯比耳定律六、偏离比耳定律的原因返回一、方法依据及分类吸光（或分光）光度法：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法、可见及紫外光度法及红外光谱法等。比色分析法通过目视比较颜色的深浅来测定物质的浓度。吸光光度法使用光度计测定的方法。返回二、方法特点灵敏度高、选择性好准确度较高分析快速、仪器简单、操作简便应用广泛返回三、光的基本性质光的波动性和微粒性电磁波谱图单色光与复合光互补色光返回1. 光的波动性和微粒性返回2. 电磁波谱图波长/nm10-1 1 10 102 400 760 103 104 105 106

3、107 108光谱名称X射线紫外光可见光红外光微波跃迁类型内层电子中层、外层电子外层电子分子振动或转动分子转动分析方法X射线光谱法紫外光度法比色及可见光度法红外光谱法微波光谱法UltravioletVisible Spectrophotometry返回3. 单色光与复合光单色光：具有同一波长的光复合光：不同波长组成的光可见光的波长大约在400760nm之间，由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成，各种色光具有一定的波长范围。返回4. 互补色光如果把适当颜色的两种色光按一定强度比例混合，可以组成白光，这两种色光称为互补色光。返回四、物质对光的选择性吸收物质颜色和吸收颜色的关系双

4、原子分子能级示意图吸收光谱图分析依据返回1. 物质颜色和吸收颜色的关系白光KMnO4紫色返回表9-1 物质颜色和吸收颜色的关系物质颜色吸收光颜色波长范围/nm黄绿紫400450黄蓝450480橙绿蓝480490红蓝绿490500紫红绿500560紫黄绿560580蓝黄580600绿蓝橙600650蓝绿红650750返回152. 双原子分子能级示意图AV43210V43210BJ420返回16返回3. 吸收光谱图400 450 500 550 600 650 /nmA0.80.60.40.2最大吸收波长max返回4. 分析依据定性分析：最大吸收波长max定量分析：吸光度大小400 450 500

5、 550 600 650 /nmA0.80.40.60.212返回五、光的吸收基本定律朗伯比耳定律透光度（率）与吸光度朗伯比耳定律吸光系数、摩尔吸光系数吸光度的加合性返回1. 透光度（率）T与吸光度AI0IrIaIt透光率或透射比吸光度Transmittance and Absorptivity返回 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 T% 1.0 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.05 0 A透光度 T与吸光度A的关系返回2. 朗伯比耳定律Lambert-Beers LawA吸光度K比例常数，与吸光物质的性质、入射光波长、温度等有关b液

6、层厚度，cmc溶液的浓度，molL-1或g L-1返回3. 吸光系数、摩尔吸光系数吸光系数a：摩尔吸光系数（或）：关系： M acgL-1bcma=A/( b c)， Lg-1cm-1c mol L1bcm =A/(b c)，Lmol-1cm-1返回例 150mL比色管中，加入含有的Fe2+溶液，加入邻二氮菲显色剂，用水稀释至50mL，用2cm比色池，在分光光度计上测得吸光度，计算摩尔吸光系数？解：返回4. 吸光度的加合性多组分体系中返回六、偏离比耳定律的原因标准曲线（校正曲线）非单色光引起的偏离化学因素引起的偏离介质不均匀引起的偏离返回Standard curve，calibrated cu

7、rve，working curve（一）. 标准曲线（校正曲线） A0.500.400.300.200.100 2.0 4.0 6.0 8.0 10mg/mL返回A0.500.400.300.200.100 2.0 4.0 6.0 8.0 10mg/mL正偏离负偏离返回（二）偏离原因1. 非单色光引起的偏离目前各种分光光度计得到的入射光实际上都是具有某一较窄波段的复合光，物质对不同波长光的吸收程度的不同，因而导致对朗伯比耳定律的偏离。克服非单色光引起的偏离的措施：使用比较好的单色器；人射光波长选择在被测物质的最大吸收处；测定时应选择适当的浓度范围。返回2. 化学因素引起的偏离稀溶液能很好服从比

8、耳定律。溶液中吸光物质常因解离、络合、缔合或互变异构等化学变化而形成新化合物或改变其浓度，因而导致偏离朗伯比耳定律。在分析测定中，要控制溶液的条件，使被测组分以一种形式存在，以克服化学因素所引起的对朗伯比耳定律的偏离。返回9.2 目视比色法及光度计的基本部件一、目视比色法二、光度计的基本部件三、方法比较返回一、目视比色法（ Colorimetry ）方法依据用眼睛观察、比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法。12481632x返回优点仪器简单（或不需要）、操作简便，适宜于大批试样的分析。灵敏度高，因为是在复合光白光下进行测定，故某些显色反应不符合朗伯比耳定律时，仍可用该法进行测定。缺点准确度不高

9、，标准系列不能久存，需要在测定时临时配制。返回二、光度计的基本部件光源单色器吸收池检测系统返回1. 光源在可见光区，常用钨灯或碘钨灯作光源，它们辐射3202500nm波长的光；在近紫外区，常使用氢灯或氘灯，它们能辐射180375nm波长的光。 具有足够的光强度，并能稳定。光源单色器检测系统吸收池返回2. 单色器滤光片由有色玻璃片制成，只允许和它颜色相同的光通过，得到的是近似的单色光。棱镜用光学玻璃或石英制成，光通过棱镜发生折射而色散。光栅光通过光栅发生衍射和干涉现象而分光。光源单色器检测系统吸收池返回3. 吸收池也称比色皿，用于盛吸收溶液；由无色透明的光学玻璃或石英制成；液层厚度为、1、2、3

10、cm等的一套长方形比色皿。光源单色器检测系统吸收池返回4. 检测系统硒光电池或光电管或光电二极管阵列作检测器，检流计或毫伏表作读数装置。另可配置记录仪、数字显示器及计算机等。光源单色器检测系统吸收池返回 紫外-可见分光光度计双光束紫外可见分光光度计9.3 显色反应及显色条件的选择一、显色反应二、显色反应的选择三、显色条件的选择四、显色剂返回一、显色反应（ Color reaction ）待测物质本身有较深的颜色，直接测定。待测物质是无色或很浅的颜色，需要选适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定，此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂（color reagent）。显色反应的类型：主

11、要有氧化还原反应和络合反应（最常用）两大类。返回二、显色反应的选择灵敏度高，有色物质的应大于104；选择性好，干扰少，或干扰容易消除；有色化合物的组成恒定，化学性质稳定(至少保证在测量过程中溶液的吸光度基本恒定)；显色剂在测定波长处无明显吸收，即显色剂对光的吸收与络合物的吸收有明显区别，要求两者的吸收峰波长之差（称为对比度）大于60 nm。 返回三、显色条件的选择显色剂用量酸度显色温度显色时间干扰的消除溶剂返回1. 显色剂的用量M + R = MR（被测组分） （显色剂） （有色络合物）为使显色反应进行完全，需加入过量的显色剂。但有些显色反应，显色剂加入太多，反而会引起副反应，对测定不利。在实

12、际工作中根据实验结果来确定显色剂的用量。返回cA0cA0cA0123返回2. 酸度M+HR=MR + H+影响显色剂的平衡浓度和颜色影响被测金属离子的存在状态影响络合物的组成 制作pH与吸光度关系曲线确定pH范围。 pHA0返回3. 显色温度显色反应大多在室温下进行；有些显色反应需加热至一定温度完成；有些有色物质温度偏高时易分解。制作温度与吸光度关系曲线确定显色温度范围。返回4. 显色时间有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快达到稳定状态，并在较长时间内保持不变；有些显色反应虽能迅速完成，但有色络合物的颜色很快开始褪色；有些显色反应进行缓慢，溶液颜色需经一段时间后才稳定；制作吸光度-时间曲线确定适

13、宜时间。返回5. 干扰的消除干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测量条件下也有吸收，造成正干扰；干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，使显色反应不完全，也会造成干扰；干扰物质在测量条件下从溶液中析出，使溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度。返回干扰的消除加入络合掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂，使干扰离子形成无色络合物或无色离子；选择适当的显色条件以避免干扰；选择适当的光度测量条件；分离干扰离子。 返回6. 溶剂有机溶剂降低有色化合物的解离度，提高显色反应的灵敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮颜色加深；还可能提高显色反应的速率，影响有色络合物的溶解度和组成等。返回四、显色剂无机显色剂有机显色剂多

14、元络合物返回1. 无机显色剂无机显色剂不多，因为生成的络合物不稳定，灵敏度和选择性也不高，目前应用不多。如用KSCN显色测铁、钼、钨和铌；用钼酸铵显色测硅、磷和钒等。返回2. 有机显色剂有机显色剂分子中含有生色团和助色团。生色团（chromophoric group）：含不饱和键的基团，如偶氮基、对醌基和羰基等。这些基团中的电子被激发时需能量较小，可吸收波长400nm以上的可见光而显色。助色团（auxochromic group）：含孤对电子的基团，如氨基、羟基和卤代基等。助色团与生色团的不饱和键作用，使颜色加深。 返回常用有机显色剂常用2类：偶氮类，如：偶氮胂(铀试剂)强酸性溶液中测Th()

15、、Zr()、U()等；在弱酸性溶液中测稀土金属离子。三苯甲烷类，如：铬天青S：测定Al3+等许多金属离子； 由如：结晶紫：测定Tl3+。 返回3. 多元络合物三元络合物离子缔合物金属离子络合剂表面活性剂体系杂多酸返回多元络合物由三种或三种以上的组分所形成的络合物。目前应用较多的是由一种金属离子与两种配位体所组成的三元络合物。三元络合物在吸光光度分析中应用较普遍。返回三元配合物特性（1）比较稳定，可提高分析测定的准确度和重现性。 如：Ti-EDTA-H2O2稳定性比Ti-EDTA和Ti-H2O2二元配合物的稳定性分别增强1000倍和100倍。返回（2）具有更高的灵敏度和更大的对比度。 如： V(

16、V)、H2O2 的二元配合物，测钒灵敏度低，而V(V)，H2O2和吡啶偶氮间苯二酚(PAR)形成1:1:1的有色络合物，用于钒的测定，其灵敏度高，最大吸收波长红移。 返回（3）具有更高的选择性。 如： 铌和鉭都可以与邻苯三酚生成二元配合物，但在草酸中，只有鉭-邻苯三酚-草酸的黄色三元配合物形成。返回（4）可以改善显色条件。 如：有CTMAC（氯化十六烷基三甲基胺）存在时,Al3+与络天青S形成三元络合物比没有CTMAC时形成二元络合物的pH范围宽。等.。返回9.4 吸光度测量条件的选择一、入射光波长的选择二、参比溶液的选择三、吸光度读数范围的选择返回一、入射光波长的选择“最大吸收原则”（max

17、imum absorption）不仅灵敏度高，且能减少或消除由非单色光引起的对朗伯-比耳定律的偏离。“吸收最大、干扰最小” 在最大吸收波长处有其他吸光物质干扰测定时选择。返回A/nm012A/nm012返回二、参比溶液的选择参比溶液的作用：调节仪器零点，消除由吸收池壁及溶剂、试剂等对入射光的反射和吸收造成透射光强度的减弱，使光强度的减弱仅与溶液中待测物质的浓度有关。使用参比溶液校正： A=(I0/I) (I参比/I试液) 返回选择参比溶液的原则：纯溶剂作参比液：仅待测物与显色剂的反应产物有吸收。不加试样溶液的试剂空白作参比液：显色剂或其它试剂略有吸收。不加显色剂的被测试液作参比液：显色剂为无吸

18、收，被测试液中存在其他有色离子；若同时显色剂略有吸收，可在试液中加适当掩蔽剂掩蔽被测组分后再加显色剂作参比液。返回当A=0.434(或透射比T=36.8%)时，测量的相对误差最小。待测溶液的透射比T在15%65%之间，或使吸光度A在之间，才能保证测量的相对误差较小。0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 T108642108642|Et|%0.368返回上一页下一页退出三、吸光度读数范围的选择为使测量结果得到较高的准确度，一般应控制标准溶液和被测试液的吸光度在适宜范围内。可通过控制溶液的浓度（如改变试样的取样量或改变显色体系的体积）或选择不同厚度的吸收池来达到目的。 返回 1.2810-4

19、-1KMnO4溶液在波长525nm处用1cm吸收池测得透光度为，试问（）计算KMnO4溶液的摩尔吸光系数为多少？（）在相对误差最小时的吸光度测定，则KMnO4溶液的浓度为多少？例题（）A=（1/T）A=bc， =A/ bc=0.3011（1.2810-4） =2.35103 （-1cm-1） （）在相对误差最小时测定，其C=A/b=0.4341（2.35103） = 1.8510-4-19.5 吸光光度法的应用一、单组分分析1吸光系数法 2对照法3标准曲线法续前标准曲线法示例 芦丁含量测定0.710mg/25mL续前二、多组分分析三种情况（如两组分）： 1吸收光谱不重叠（互不干扰）在各自max

20、下不重叠分别按单组分分析续前2吸收光谱部分重叠 1测A1b组分不干扰可按单组分定量测Ca；2测A2a组分干扰不能按单组分定量测Ca 续前3吸收光谱完全重叠混合样品测定 解线性方程组法步骤：三、酸碱离解常数的测定（对光有吸收） AHL和AL-分别为有机弱酸HL在强酸和强碱性时的吸光度，它们此时分别全部以HL或L-形式存在。因此HL H+ + L-即 A= HL + L H+cKa+H+ AHL= HLc AL= LcpKa=pH+ lg A - AL-AHL- Alg A - AL-AHL- A对pH作图即可求得pKa A=HLHL+ LL-Ka+H+ Kac 四、配合物组成及稳定常数的测定 摩

21、尔比法 制备一系列含钌3.010-5 mol/L (固定不变)和不同浓度（小于12.010-5 mol/L）的PDT溶液，按实验条件，485nm测定吸光度,作图。PDT:Ru=2:1M + nL MLn稳定常数的测定自学。 五、双波长分光光度法 原理： A = Al1-Al2 = （l1- l2）b c 波长对的选择： 如 等吸光度点法应用：多组分混合物的测定；浑浊样品的测定（消除背景吸收的干扰）；研究反应动力学。 选l1为参比波长, l2为测量波长得 Al1= xl1bcx + yl1bcy Al2= xl2bcx+ yl2bcy A=Al2-Al1= ( x2bcx+ yl2bcy)-(

22、xl1bcx+ yl1bcy)在等吸光度的位置(G, F), yl2 yl1，则上式成为 A=( xl2- xl1）bcx A与cx成正比, 可用于测定例,苯酚(x)与2,4,6-三氯苯酚(y)混合物中苯酚(x)的双波长分光光度法测定。 9-6 紫外吸收光谱法简介 (Ultraviolet Spectrophotometry, UV ) 紫外吸收光谱法的基础是物质对紫外线选择性吸收，与可见分光光度法一样，也是基于分子中价电子在能级之间的跃迁所产生的吸收。 相同：产生机理（基于分子中价电子能级跃迁）；定量分析的原理相同（朗伯-比尔定律）；仪器组成部件相同。 差异：仪器上 光源（氘灯）、光学材料（

23、石英）、检测器（对紫外光响应灵敏）。 应用上，紫外光谱在有机物结构分析上有较好的应用。 紫外吸收光谱法与可见分光光度法对比COHnpsH 按分子轨道理论，在有机物分子中有几种不同性质的价电子： 电子、电子、n电子，当分子吸收一定的能量后，这些价电子将跃迁到较高的能级（激发态），这种特定的跃迁反映了分子内部的结构信息。一、有机化合物电子跃迁的类型 分子轨道理论认为其跃迁为：【基态】成键轨道（非键轨道）【激发态】反键轨道。 主要有4种跃迁，所需能量大小顺序为： n n sp *s *npE 当外层价电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态跃迁。 1. * 跃迁： 饱和烃（甲烷，乙烷） 能量很高，

24、150nm（真空紫外区） 2. n * 跃迁： 含杂原子饱和基团（OH，NH2） 能量较大，150250nm（真空紫外区）3.*跃迁： 不饱和基团（CC，C O ） 能量较小，200nm （近紫外区） 体系共轭，E更小，更大4.n*跃迁： 含杂原子不饱和基团 （C N ，C O ） 能量最小， 200400nm（近紫外区）二、紫外吸收光谱的重要吸收带 R吸收带：由n*跃迁产生的吸收带称为R带(德文Radikal)；分子中同时存在杂原子和双键可产生n* 跃迁。比如 CO，NN，NO，C=S。 R带的特征：能量最小，270700 nm； max 104（位于远紫外，200nm），而E2带max10

25、3（位于近紫外端，200nm）。如：苯的E带。 B吸收带的特征：以苯为例，位于230270 nm；宽峰，禁阻跃迁，弱吸收带（max200）。包含多重峰或称精细结构。极性溶剂的影响 极性溶剂使精细结构消失三、影响紫外吸收光谱的因素 物质的紫外吸收光谱受溶剂性质、溶液pH、空间效应等许多因素的影响。 溶剂的影响:改变光谱形状（如前例）；使吸收波长改变。比如，极性大溶剂使*红移，使n* 蓝移。 pH的影响：如苯胺在乙醇中max=230nm，而在稀酸中max=203nm，与苯的E2相似。可用来鉴别碱性基团（胺基）的存在。 空间效应的影响：空间阻碍会影响到较大共轭体系的生成，使max较短，小。 1、定量

26、分析 紫外吸光光度法的定量测定原理及步骤与可见区吸光光度法相同。 其应用很广泛，仅以药物分析来说，利用紫外吸收光谱进行定量分析的例子很多，例如一些国家已将数百种药物的紫外吸收光谱的最大吸收波长和吸收系数载入药典。 紫外吸光光度法可方便地用于直接测定混合物中某些组分的含量，如鱼肝油中的维生素A等。四、紫外吸收光谱法的应用 用经验规则（如Woodward规则等）计算max，与实测值比较判断。 比较吸收光谱的一致性。 在相同的条件下，比较未知物与已知标准物的紫外光谱图。 若谱图一致，表明它们含有相同的生色团，但不一定是同一化合物。进一步可比较吸收系数。2、有机物定性分析对比吸收光谱的一致性 三种甾体

27、激素的紫外吸收光谱(10g/ml甲醇溶液）醋酸泼尼松醋酸氢化可的松醋酸可的松对比吸收系数：安宫黄体酮(M=386.53)炔诺酮(M=298.43)max=2401nmmax=2401nm3344如果待测物和标准物的吸收波长相同、吸收系数也相同，则可认为两者是同一物质。3、同分异构体和顺反异构的确定maxEtOHmax 10500 29000 顺式： 短， 小 反式： 长， 大位阻效应互变异构现象 max 247nm 310nm共轭 4、纯度检查 如果一化合物在紫外区没有吸收峰，而其中的杂质有较强的吸收峰，可方便地检出该化合物中的痕量杂质。 如果一化合物，在可见区或紫外区有较强的吸收带，有时可用摩尔吸收系数来检