微生物快速检测技术与原理讲解课件

1、华粤企业集团有限公司 2成立于1991年，是目前中国最具规模的实验室仪器设备供应商之一。目前是全球70多个品牌在中国的总代理，分别涉及生物制药、微生物、分子生物、生物细胞、IVF及实验室耗材等领域。345常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等微生物检测的发展趋势快速化自动化标准化全程追溯市场销售环节要求快速出货，尤其是一些保质期较短的产品。减少物流的压力，尽可能减少库存，加快资金周转。节约人力资源成本对于运行HACCP质量保证体系的企业来说，

2、快速检测方法非常重要。可以快速检测原料及半成品的微生物状况，以采取相应的措施控制最终产品的微生物情况。快速检测产品不少，但真正使用的企业不多。原因一：成本的原因。绝大多数快速检测产品来自国外，成本相对偏高，而中国的人力成本相对便宜，对于检测量小的企业，不会考虑快速检测；而对于每天检测量大的企业又担心成本问题。原因二：技术的原因。虽然市面上有不少微生物快速检测产品，但或多或少都有一定的技术局限性。一方面与样品的加工工艺有关（譬如添加防腐剂等），另外一方面与检测产品的技术原理等有关。美国EPIC、Celsis、Millipore、PALL英国DWS Rabit奥地利Sylab Bactrac 法国

3、 Bact/Alert 3D、Tempo美国Soleris， Biolumix 法国AES Chemunex Bactiflow、D-count、RDI 日本DoxATP法：EPIC、CelsisMPN法：Tempo膜过滤染色法： Millipore、PALL电化学法：DWS Rabit 、SyLab Bactrac 4300、 Dox颜色变化：Soleris、Biolumix、Bact/Alert 3D流式细胞技术： AES Chemunex Bactiflow、D-count激光扫描技术： AES Chemunex RDIATP （三磷酸腺苷）来源于细菌、酵母 、霉菌、生物膜组织残留、人的

4、污染等用于食品、化妆品和药品企业对生产线和管道进行快速清洁程度检测。改良后用于食品、化妆品的商业无菌检测或终产品检验。EPICCelsis优点：通常用于进行商业无菌检测。可大大缩短库存时间，减少物流压力和成本。缺点：ATP方法需要消耗大量的较昂贵的试剂，对仪器的清洗保养要求特别高。另外，客户通常怀疑假阴性和假阳性的可能，特别是用ATP单个检测代替常规微生物和致病微生物检测，其风险是一定存在的。(如保温增菌时间不够，菌数未达到一定数量，取样量太小，由于培养基原因，目标菌未大量增菌等原因)美国默克Millipore Milliflex Quantum 美国Pall公司的Pallchek可过滤样品经

5、膜过滤后，将菌截留在特殊的滤膜上，滤膜放置在培养基表面增菌后取出，加入荧光试剂，荧光染料在微生物体内分解后积累，通过检测荧光信号来到达计数的功能优点：缩短培养时间，提高灵敏度，适合于菌数较低的可过滤产品使用。缺点：仪器较昂贵，运行成本比较贵。基于MPN(最大近似值)原理，实现自动计数Tempo 将一定浓度的样品稀释液加入定量的专用培养基后，通过充填方式将样品液充填至48孔测试卡后，经适当的培养（细菌总数测定要求37培养40h），根据各孔道内细菌的生长状况，由读卡站进行荧光检测，自动读取结果并换算出样品中的目标菌数值。优点： 自动动化程度高一些。缺点：主要用于检测菌落总数 耗材成本昂贵英国DWS

6、公司的Rabit奥地利Sylab公司的Bactrac4300日本的DOXBactrac4300DWS RabitDetection Time (DT)电导率单位对数期稳定期界限值IDT与样品中的菌数的对数呈线性关系 校准曲线表示菌数对数与IDT的关系校准时，同时做电化学法和标准方法，将菌数与IDT填入表格中，自动生成标准曲线，并自动计算相关系数及离散度。Log cfuA (DT) + b优点：检测成本低，检测时间明显缩短。 可用于微生物生长曲线测定，微生物抑菌研究，防腐剂和消毒剂研究等领域。缺点：仪器较昂贵，定量检测时需要校正曲线。目前只能检测细菌总数、大肠菌群和大肠杆菌方法的准确性和检测精度

7、值得考虑需要专用的电极盒，试剂相对也比较贵美国的Soleris、Biolumix法国的BacT/Alert 3DBiolumix微生物生长导致培养基pH值发生变化，由光学检测器检测底部琼脂层的颜色变化，记录达到突变点的时间。培养基内含有颜色指示剂与阻抗法类似，可以实现快速检测。缺点：需要购买原厂的预装培养基，应用范围受限制，成本高昂。与阻抗法类似，可以实现快速检测。缺点：需要购买原厂的预装培养基，应用范围受限制，成本高昂。BacT/Alert 3D 主要应用在医院临床的血培养；以及药品和食品等无菌产品的检测基于微生物生成产生CO2的原理。CO2积累越多，底部的CO2传感器颜色由蓝绿色变浅，由L

8、ED发射一束光至底部，探头检测反射光的强度。光强度与微生物数量有一定关系。优点：用于临床血培养缺点：耗材太贵，而且含有对环境有害AsCO2丹麦Foss BactoScan FC法国AES chemunex Bactiflow 、D-count可用于非过滤产品流式计数 : 线性流体 单细胞分析 灵敏的检测头对微生物进行核酸染色，用流式细胞技术进行计数FOSS BactoScan FC 优点：速度快(50-150样品/小时)缺点：死活细胞一起检测，消耗成本较高，仪器比较难保养，灵敏度不够高适合牛奶企业检测原奶中细菌总数Chemunex公司将流式细胞技术与活细胞荧光探针标记及激光扫描技术相结合，推出

9、最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的D-count 和ScanRDI微生物快速检测仪。其最大的特点是只检测活细胞数，速度比较快。EnzymeViability substrateFree fluorochromeMicro-organismDetectorDetectorLaserFlow Cell细胞标记 细胞计数 直接单细胞标记 细胞无增菌要求直接对活细胞和酵母、霉菌进行标记D-countChemScan RDI2. 标记3. 激光扫描1. 过滤 1. 过滤2. 标记3. 激光扫描样品过滤预标记60 min滤膜转移ChemScanRDI 仪器分析标记30 min优点：速度非常

10、快，尤其是激光扫描技术缺点：耗材太贵、维护保养比较复杂 流式细胞技术需要复杂的前处理 激光扫描技术只适合于可过滤样品流式细胞技术和激光扫描技术的优缺点显色培养基法：技术成熟，产品很多。免疫学方法：产品最多，特异性和敏感性都很高，但有假阳性存在，阳性结果需要确认。通常的原理有ELISA、荧光酶免、免疫磁分离等方法。市场上的产品多。分子生物学方法：以基因探针检测法和PCR法为主。基因芯片：研究热点。 显色及荧光底物技术显色及荧光底物: 由化学及合成技术获得 特殊酶天然裂解相似结构的分子 酶裂解时释放发色及荧光混合物专一性酶活性，目视观察底物结构共价键 (糖苷的, 肽聚, 磷酸二氢聚 )由酶进行专一

11、性识别糖类脂类蛋白胨色 原底 物 结 构共价键结合专一酶糖类脂类蛋白胨色原非裂解底物:不显色 糖类脂类蛋白胨色源 游离或二聚物可显色ALOA 原理:Beta-glucosidase activityBlue colonies-葡萄糖苷酶活性，蓝色Phospholipase activityOpaque halo 磷酸酶活性，混浊晕Listeria spp.Listeria monocytogenes免疫磁分离法+定量PCRMatrix公司的免疫纯化系统ELISA方法3M Tecra 公司的免疫捕获快速检测(略)GLISA-胶体金免疫层析致病菌快速检测条(略)荧光酶免Vidas系列产品(略)Pa

12、thatrixAuto免疫纯化15分钟定量PCR快速确认1hr基因探针法及PCR方法在国外已经有相当成熟的表现。有普通PCR，荧光PCR，实时荧光PCR（定量PCR）等多种方法。基因探针法一般也需要增菌，然后加探针试剂杂交，然后在荧光显微镜或荧光检测器下获得结果。PCR方法一般不需增菌太长时间，通过PCR方法对待测微生物的特征片断进行扩增，然后通过凝胶电泳或荧光PCR技术判断结果。试剂盒开发相对比较容易，只要找出特征的基因片断，合成出引物即可。目前客户比较关注的致病菌，包括沙门氏、李斯特氏、大肠杆菌O157、副溶血弧菌、霍乱弧菌、志贺氏菌等均有PCR试剂盒供应。BAXGene-trakGen-probeVe