固相膜免疫测定课件

1、第十二第三临床医学院临床检验教研室王飞 副主任医师,副教授第十一章固相膜免疫分析技术第一节 免疫金标记技术 一、胶体金与免疫金的制备 二、胶体金免疫技术的方法学种类与原理第二节其他膜载体免疫分析技术 一、斑点酶免疫吸附试验 二、免疫印迹试验思考题小结 随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。第一节免疫金标记技术免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 是以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。一

2、、胶体金与免疫金的制备（一）胶体金的特性 胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（gold solution），是金盐被还原成金原子后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核及包围在外的双离子层构成。由于静电作用，金颗粒之间相互排斥而悬浮成为一种稳定的胶体溶液，故称胶体金。胶体金的特性1.胶体性质 胶体金颗粒大小多在1100nm，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。 胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周水化层，从而打破胶体的稳定状态，使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒，而从液体中沉淀下来。某些蛋白质等大分子

3、物质有保护胶体金、加强其稳定性的作用。 2.呈色性和光吸收性 胶体金颗粒大小不同，呈色不同，光吸收性也不同。 微小颗粒胶体呈红色，但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最小的胶体金（25nm）是橙黄色的，中等大小的胶体金（1020nm）是酒红色的，较大颗粒的胶体金（3080nm）则是紫红色的。根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色可粗略估计金颗粒的大小。 胶体金粒径1%柠檬酸钠加入量胶体金特性（nm) （ml)*呈色lmax(nm)162.00 橙色51824.51.50 橙红色522411.00 红色52571.50.70 紫色535*还原100 ml0.01%HAuCl4 所需量3.稳定性 胶体

4、金具有很高的动力学稳定性，在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢，可放置数年不发生凝聚。 影响稳定的因素主要有胶粒间的相互吸引力胶粒及其溶剂化层的带电情况胶体界面的溶剂膜4.聚沉现象胶体聚结使颗粒变大，超出胶体范围而从介质中沉淀出来，这种现象为聚沉。影响溶胶聚沉的因素主要有电解质温度溶胶浓度。 1.基本原理 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。 （二）胶体金的制备2.技术要点 柠檬酸三钠还原法 取0.01氯金酸水溶液100ml 加热至沸，搅动下准确加入柠檬酸三钠水溶液 2ml，金黄色的氯金酸水溶液在分钟

5、内变为灰色、黑色、紫红色，继续煮沸分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积， 3.注意事项。、 试剂、水质和环境：氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平称盘。其水溶液在可稳定数月不变。实验用水一般用双蒸馏水。实验室中的尘粒要尽量减少，否则实验的结果将缺乏重复性。、玻璃容器的清洁：玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗、硅化。硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于二氯二甲硅烷的氯仿溶液中分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。专用的清洁器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面，弃去后以双蒸馏水淋洗，可代替硅化处理。4.鉴定和保存 主要检查指标有颗粒

6、大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。 在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描max来估计金颗粒的粒径。贮存 室温可稳定3个月左右，4稳定半年，避免低温冻存。胶 体 金（Colloidal Gold）1560 nm优 质劣 质胶体金结合物（Conjugate）1.基本原理 氯金酸与抗原或抗体等大分子物质的结合物。 实质是抗体蛋白等大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。 （三）免疫金的制备2.技术要点（1）胶体金溶液PH的调整 一般认为是

7、由于pH值等于或稍偏碱于蛋白质等电点时，蛋白质分子较易吸附于金颗粒的表面，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态， （2）待标蛋白质最适标记量的确定：将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取一定量加到 定量胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，然后分别加入NaCl溶液，混匀后静置数小时，对照管及加入蛋白量不足管，颜色由蓝变红，蛋白量足量及过量的管保持红色不变。保持红色而蛋白量最低的一管作为稳定胶体金必须的最适标记量。能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10即为标记全部胶体金溶液所需的蛋白总量。（3）标记过程确定胶体金与蛋白质的

8、最适用量比例。在电磁搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中（pH已调至PI超过0.5pH），加入蛋白质时应逐滴加入，1mg的蛋白质大约5min加完。在磁性搅拌下加入5%的牛血清白蛋白（BSA）或加入1%聚乙二醇（PEg 20000）。（4）金标记物的纯化3.注意事项4.胶体金的保存二、胶体金免疫技术的方法学种类与原理斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)斑点金免疫层析试验（ dot immunochromatography assay, DICA）一、斑点金免疫渗滤试验DIGFA双抗体夹心法测抗原ABDIGFA结果判断二、斑点金免疫层析

9、试验DICA 试剂条样品垫结合物垫NC膜吸水垫DICA双抗体夹心法测抗原DICA竞争法测抗原DICA间接法测抗体DICA 结果观察 阳性阴性无效DIGFA与DICA的比较DIFADICA试剂形式渗滤装置及附加试剂试剂条试剂保存48 6个月室温一年操作步骤351观察时间3 min320 min阳性反应颜色浓度操作结束颜色不变颜色逐渐加深IFA 穿流（FLOW THROUGH）ICA 横流（LATERAL FLOW）GIFA技术的发展（间接法测抗体）阳性阴性固相膜固相抗原待测抗体金标记抗人IgG抗体人IgG固相抗人IgG抗体快速检测（渗滤法）原理图第二节其他膜载体免疫分析技术一、斑点酶免疫吸附试验

10、 Dot-ELISA二、免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 原理:是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的技术。技术要点：1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2.电转移3.酶免疫定位原理思考题1. 叙述固相膜免疫测定概念。2膜的种类与特性是什么？3膜载体免疫测定的种类有哪些？4斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)的原理是什么？5免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA）的原理是什么？6斑点ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 原理是什么？7酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 原理是什么？8免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 原理是什么？9免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 注意事项是什么？10放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 原理是什