胰岛细胞特异性敲除基因appl1小鼠模型的制备

1、尊敬的上海医学编辑老师：您好！首先非常感谢您及评审专家对我们文章的审修，目前已按照修改意见进行了修改，以下是对修改意见的具体答复，希望回答专家的问题，谢谢。.“胰岛细胞特异性敲除 APPL1基因”和“ B细胞APPL1特异性敲除APPL1 基因”这两种表达方法应该统一；在文章中已做修改。.从图3可以看出，B细胞APPL1敲除小鼠脂肪组织APPL1的表达显著高于野 生型，原因何在？正如文章所提及,我们收集 APPL1flox/flox和B -APPL1KO两组小鼠多例样本, western结果并未发现APPL1蛋白水平表达的脂肪组织中有统计学差异，为了消除之前结果容易给人的误解，我们另外选择两组

2、实验数据来作为结果图。.该研究目的是建立B细胞APPL1基因敲除小鼠模型，因此在表型分析方面应 多关注B细胞功能，至少要提供血胰岛素水平方面的数据，而不是仅仅提供血 糖数据。这个意见提得很好，事实上我们研究组已经研究了APPL1flox/flox和B-APPL1 KO小鼠的空腹血胰岛素水平差异，这部分内容我在文章的方法和结果中 也已作了修改和补充。4.如可以请引用上海医学杂志和中国实用内科杂志的参考文献各一条 在文章中我已做补充。此致敬礼李晓雯2015.1. 30胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型的制备李晓雯1李羚1林紫薇1孙赞1陈辰2王琛1*贾伟平1【摘要】目的制备转接蛋白APPL1胰

3、岛细胞特异性敲除小鼠模型。方法采 用基因剔除打靶技术，囊胚显微注射法制备嵌合小鼠，利用 Cre-loxp系统繁育 APPL1胰岛特异性敲除小鼠。Western blot检测APPL1蛋白表达水平。结果 成 功制备胰岛细胞特异性敲除基因 APPL1小鼠模型，与APPL1flox/flox小鼠相比， 胰岛细胞特异性敲除基因 APPL1并不影响小鼠体重，空腹血糖以及空腹胰岛素 水平，western blot从蛋白水平印证敲除小鼠胰岛中的 APPL1蛋白无表达。结论 胰岛细胞特异性敲除基因 APPL1小鼠模型制备成功，为探讨APPL1在胰岛中的 功能提供研究工具。【关键词】APPL1;胰岛；条件性敲除

4、Establishment of APPL1 conditional knock out model in mice islet LI Xiaowen 1, LI Ling 1, LIN Zeiwei 1, SUN Yun1, CHEN Chen2, WANG Chen 1*, JIA Weiping 1. 1Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth Peoples Hospital, Sha nghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Sha

5、nghai 200233, China 2Shanghai Research Center for Model Organisms, Shanghai 201210, ChinaCorresponding author: WANG Chen, HYPERLINK mailto: Abstract Objective To discuss the method of APPL1 knock out mouse model in islet.Methods Mouse embryonic stem (ES) cells were targeted knockout of APPL1 by the

6、homologous recombination vector, and screened .The APPL1-knockout embryonic stem cells weremicroinjected into blastula of C57BL/6J mice.F1 hybrid mice were bred to obtain mouseaggregation chimeras. The conditional KO mice were generated by cross-breeding APPL1 floxed mice with mice expressing Cre in

7、 islets. Western blot was conducted to measure proteinflox/floxCompared with APPL1expression. Results Mice with conditional APPL1 knockout (KO) in islets were generated.mice, APPL1 conditional knockout in islets does not affect themice weight, fasting plasma glucose and fasting insulin levels, no AP

8、PL1 protein expression was found in APPL1 KO mice islets with western blot. Conclusions The conditionalAPPL1-knockout mouse model is successfully established, it lays a foundation for study APPL1 function in mouse islets.Key words 】 APPL1; islet; conditional knockout2型糖尿病是一种复杂的慢性代谢性疾病，对公共健康造成严重威胁，是由

9、 胰岛素抵抗和B细胞受损/死亡造成胰岛素分泌缺乏共同作用而引起的一种进展 性疾病1。近年研究表明，脂肪细胞因子对糖尿病的发病起着重要作用，其中脂 联素（Adiponectin）因其可增加胰岛素敏感性、降低胰岛素抵抗、增加胰岛B细胞 葡萄糖刺激的胰岛素分泌2, 3,在2型糖尿病的发生和发展中可能起重要作用，因而引起了极大的关注并成为研究热点。脂联素通过脂联素受体发挥作用，2006年4报道 APPL1 （Adaptor protein containing PH domain, PTB domain and Leucine zipper motif 1）可与脂联素受体 1 （Adiponectin

10、 receptor-1, adipoR1）结合，介导 脂联素信号传导，该发现为药物干预提供了一个潜在靶点 。遗传研究结果显示， APPL1基因单核甘酸多态性位点rs4640525ffirs3806622的变异与中国人2型糖尿 病患者肥胖发病风险有关6 o为了从生物整体水平上来探讨脂联素-APPL1传导系 统在胰岛素抵抗发生和发展中的作用以及 APPL1对胰岛傕田胞功能的影响，本研 究利用Cre-LoxP系统介导技术及RIP-Cre转基因小鼠在胰岛细胞中特异性表达 特点，建立胰岛细胞特异性APPL1基因敲除小鼠。材料与方法实验动物所有实验小鼠饲养于上海市第六人民医院实验动物中心SPF级动物室，小

11、鼠自由进食消毒颗粒饲料（上海斯莱克公司），及饮用消毒水，室温控制于231C, 湿度56%, 12 h间隔照明，定期紫外线消毒与通风。实验和操作程序经所在单 位的动物实验伦理委员会审核通过（实验动物合格证号：SYXK （沪）2008-0052）。 对照组和APPL1基因敲除纯合子小鼠于8-12周龄测定体重，空腹血糖采用ACCU-CHEK血糖仪（美国罗氏公司）检测，空腹胰岛素水平用ELISA药盒测定（瑞典Mercodia公司）。分离上述小鼠的胰岛，脂肪组织于-80C冻存备用。APPL1flox/+小鼠建立及鉴定APPL1flox/+小鼠模型在上海南方模式生物研究中心SYXK（沪）2008-0035

12、制备，具体为基因剔除打靶载体构建、胚胎干细胞（ Embryonic stem cells, ES）基因打靶、囊胚显微注射法制备嵌合小鼠、嵌合小鼠与野生型C57BL/6J雌性小鼠繁殖后代灰色小鼠（APPL1flox/+）。APPL1基因含有22个外显子，本研究LoxP 插入位点在第5外显子两端。RIP-Cre转基因小鼠购自南京大学模式动物研究所 许可证编号：SYXK（苏）2010-0003。小鼠鉴定小鼠尾DNA提取 剪取4周龄小鼠尾端于1.5 ml EP管，经蛋白酶K （美国 Merck公司）和裂解液裂解过夜后，次日震荡后离心，留上清加入无水乙醇后析 出DNA,留沉淀,室温晾干后取适量ddH2O

13、溶解，室温放置1h待完全溶解后4c 保存待用。PCRT增及电泳 PCR管中先后加入PCR预混液（上海天根公司）、DNA , 引物以及ddH2O,混匀后上机。在梯度PCR仪（美国ABI公司）设定相应PCR条 件进行扩增。取适量PCR产物，加入PCR上样缓冲液，混匀后加入电泳槽的样 品孔内。接通电源，恒压250V。根据指示剂泳动的位置判断是否终止电泳。Cre小鼠的鉴定方法同既往研究所述7。APPL1flox/flox小鼠的鉴定上游引物序歹U为：5-TTTAAAAGTTTTAGTCTGGGCATGG-3下游引物为：5-CTCCCATAGCATTTCAATCTGTAAT-3 。APPL1flox/fl

14、ox 小鼠与 RIP-Cre 转基因 PCR结果示Cre阳性，且APPL1为杂合子的小鼠留用，记为APPL1+/-/RIP-Cre+。 然后用其与APPL1flox/flox小鼠交配获得的子代经提取尾部 DNA, PCR筛选出胰 岛细胞特异性敲除APPL1纯合子小鼠，记为B-APPL1KO鼠。Western blot 检测胰岛细胞和脂肪组织用裂解液提取蛋白定量，取一定量蛋白质在10%SDS凝胶上电泳分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，转膜后 5%脱脂牛奶 封闭1h网，分别用APPL1抗体（1： 1000稀释）和B-actin抗体（1： 1000）孵 育过夜。显影采用Termo Pierce ECL

15、发光试剂盒，曝光利用LAS4000化学发光 成像分析系统进行。3-actin和APPL1抗体均购自Cell signaling Technology公司。统计学处理采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料用均数 土标准误（x 土 sx）,2组间比较采用独立样本t检验。以P0.05为差异有统计学意义2结果APPL1flox/flox小鼠的繁殖及鉴定APPL1flox/+小鼠之间交配成功保种并获得 APPL1纯合子（APPL1flox/flox）小 鼠，其基因组示意图及鉴定策略见图 1。鉴于APPL1flox/flox小鼠的基因型2条染 色体都带有两端含2个LoxP序列，因此，PCR仅

16、扩增得到1条879bp左右的条 带（图2）。APPL1flox/+小鼠则扩增出685bp和879bp两条带。对照小鼠PCR仅 扩增出一条685bp的条带（图2）。胰岛细胞中敲除APPL1基因小鼠的繁殖及鉴定APPL1flox/flox小鼠与RIP-Cre小鼠交配可以获得APPL1基因敲除的杂合子小 鼠，其与 APPL1flox/flox 小鼠交配，下代繁育出 APPL1flox/flox、APPL1flox/+、APPL1 基因敲除的杂合子小鼠以及 APPL1基因敲除的纯合子小鼠（B-APPL1K。）。为 增加B-APPL1KO的产出，之后用B-APPL1KO小鼠和APPL1flox/flox

17、小鼠回交，即 获得 1:1 的 B -APPL1KO 和 APPL1flox/flox。胰岛细胞中敲除APPL1基因小鼠的表型分析分别取APPL1flox/flox和B -APPL1 KO小鼠的胰岛，用 Western-blot方法分析， 图3可见APPL1flox/flox小鼠有APPL1表达，而B-APPL1KO小鼠无表达。而对于 脂肪组织来说无论是 APPL1flox/flox还是B-APPL1KO来源均有APPL1蛋白的表 达。为了精确的观察APPL1基因条件性敲除对小鼠基本表型的影响，我们分别 取8,10,12周龄小鼠对其进行体重测量，发现与APPL1flox/flox组小鼠相比，A

18、PPL1 敲除小鼠体重略低，但其差异并无明显统计学意义。止匕外，8和10周龄小鼠空腹血糖以及10周空腹胰岛素，两组间也无明显差异（图4）。讨论本研究将含APPL1打靶载体的质粒显微注射到胚胎干细胞中，随后转到小鼠体内形成嵌合体，并利用RIP-Cre系统介导的位点特异性重组技术经繁殖保种最 终获得在胰岛细胞特异性敲除APPL1的小鼠模型，经western blot检测从蛋白水平 鉴定该模型成功建立。条件性基因敲除技术是在特定的发育时期或特定的组织和器官中使某个基 因失活，从而用于研究感兴趣基因在某时间段或某特定组织和器官中的生理病理 功能。广义上的全身敲除某基因的基因打靶技术尽管克服了经受精卵原

19、核显微注 射技术引起的，诸如外源基因随机整突变，往往引起严重的发育缺陷或胎儿死亡， 不利于在发育后期阶段基因功能的分析9。以Cre-LoxP系统与基因打靶技术相结 合的条件性基因打靶克服了上述的局限10-12。当然,与传统的完全性基因敲除技 术相比，条件性基因敲除技术也有其缺点： 建立模型所需的步骤更为复杂，花费 的时间更长。目前，条件性敲除小鼠模型已经越来越广泛的应用于糖尿病分子机制研究领 域13-15,但APPL1的胰岛特异性敲除模型未见报道。APPL1是近年发现的一种细胞内转接蛋白，其由 709个氨基酸组成，人 APPL1基因定位在染色体 3P14.3-21.1,全长45.6 kb,包含

20、22个外显子及21个内含子，在人体骨骼肌、卵 巢、胰腺、心脏中APPL1蛋白表达最为丰富16。APPL1具有多个功能结构域， 包含竣基端的磷酸酪氨酸结合 (PTB phosphotyrosine binding)结构、PH (Pleckstrin homology)结构域和氨基端的 BAR (Binamphiphysin-Rvs)结构域，其通过自身 功能结构域与近14种蛋白相互作用，包括膜受体和信号分子，参与细胞生存、 增殖和凋亡等各种信号转导通路17。目前，对APPL1在细胞内的作用尚未完全 知晓。RIP (rat insulin promoter)是大鼠B细胞特异的胰岛素启动子18,19,

21、通过它可 以实现Cre特异性的在胰岛细胞中表达，进而在Cre重组酶的作用下20切除两个 LoxP位点之间的APPL1第5外显子，达到在胰岛细胞中特异性敲除 APPL1的 目的。研究发现，APPL1在多种组织中发挥重要作用：在骨骼肌中过表达APPL1可以显著提高AMPK及p38MAPK的磷酸化水平，从而促进骨骼肌的葡萄糖摄取、 脂肪酸氧化，调节糖脂代谢4;敲除脂肪细胞中APPL1可以抑制Akt磷酸化、降 低葡萄糖摄取和GLUT4的功能21。在肝脏中，APPLl表达上调可增强胰岛素介导 的Akt激活并且通过抑制糖异生作用可提高肝脏对胰岛素的敏感性220止匕外，我们的研究发现，APPL1在大鼠，小鼠

22、和人的胰腺及胰岛细胞中也大量表达。观察APPL1全身敲除小鼠显示，葡萄糖耐量和葡萄糖刺激的胰岛素分泌较对照小鼠明 显降低，在胰岛细胞过表达APPL1可降低高葡萄糖和炎症因子导致的细胞凋亡， 并增加葡萄糖刺激的胰岛素释放。表明APPL1对高糖和炎症因子诱导的胰岛B细 胞损伤具有保护作用，可降低B细胞凋亡并改善胰岛细胞功能。提示APPL1在2 型糖尿病发病中可能起重要作用23,240上述研究结果基于APPL1全身敲除小鼠水平或是胰岛B细胞系水平，如前所 述，APPL1在多种组织中参与调控代谢和胰岛素敏感性，所以利用全身敲除的动物模型来探明APPL1对胰岛细胞的影响及分子机制并不能排除胰岛细胞外的组

23、 织对实验结果叠加的影响，为此，建立胰岛细胞特异性APPL1敲除模型显得尤为 重要。总之，本研究利用特异性重组技术，在 RIP-Cre系统首次建立胰岛细胞特异性 APPL1敲除的小鼠模型，该模型的建立为后续研究APPL1在胰岛细胞中的作用提 供了良好的模型，为临床2型糖尿病的治疗开发了新的研究工具。参考文献ZIMMET P, ALBERTI K G, SHAW J. Global and societal implications of the diabetes epidemic. J.Nature,2001; 414(782-7).OKAMOTO M, OHARA-IMAIZUMI M, K

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