西北农林科技大学动物科技学院

1、PAGE PAGE - 2 -西北农林科技大学动物科技学院 2015届（本科）毕业生论文开题报告题目： Mark4对3T3-L1脂肪细胞线粒体功能的影响学 院： 动物科技学院 专 业 班 级： 动科112班 学 生 姓 名： 刘 雷 指 导 教 师： 孙 超 论文通过开题论证日期： 2015年 1月16日开题论证教师签名： 目 录1选题的目的意义32选题的依据33国内外研究概况34研究内容65研究方法及技术路线66预期结果77研究的创新点78所需的主要仪器设备和试剂及工作条件 - 79论文工作进展安排810经费预算811研究工作中面临的技术难点和拟采取的解决办法812参考文献8PAGE PAG

2、E 3PAGE PAGE - 10 -1.选题的目的意义线粒体是广泛存在于真核细胞中的半自主细胞器，有“细胞动力工厂”之称，它不仅是脂肪酸氧化、氧化磷酸化和ATP合成的主要场所，也是很多代谢活动如糖代谢、脂类代谢、细胞信号转导和凋亡的重要调控者。线粒体功能与脂类代谢、细胞凋亡、氧化应激、胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病等代谢综合症等相关过程的发生有着密切联系。Mark4是微管亲和性调控激酶4，是细胞微管关联蛋白（MAPs）的丝/苏氨酸激酶家族（MARKs）中的成员，MARKs家族通过磷酸化作用使得微管关联蛋白从微管上解离，进而参与微管的动力学作用、细胞分裂、细胞周期调控、细胞极性决定和细胞形态改变等机

3、体内的多项生理调节功能，近年来，MARKs促进细胞凋亡、参与糖代谢、微管束形成、参与能量稳态调节、神经系统发育等功能被逐渐发现。 本试验研究Mark4对3T3-L1脂肪细胞线粒体功能的影响，并预测Mark4可能通过对线粒体的影响进而影响脂肪细胞其他生理功能，为深入研究肥胖和糖尿病等疾病治疗奠定理论基础。2.选题的依据 Mark4，即Par-1d/MarkL1，是MAP/微管亲和力调控激酶超家族（MARKs） Par-1c/Mark1，Par-1b/Mark2/Emk，Par-1a/Mark3/C-TAK1和Par-1d/Mark4/KarkL1成员之一。在早期研究中，MARKs家族功能主要集中

4、在细胞微管网络稳定性调控以及细胞极性调控方面。现今研究发现MARK4除了在细胞极性及微管稳定性方面有调控作用外，还能促进细胞凋亡、参与糖代谢、维管束形成、参与能量稳态调节、神经系统发育等。在动物细胞中，线粒体是脂肪酸氧化、氧化磷酸化和ATP合成的主要场所1，也是很多代谢活动如糖代谢，脂代谢，细胞信号转导和凋亡的重要调控者2。线粒体功能紊乱可引起一系列疾病，例如糖尿病、肥胖、癌症、衰老、心血管疾病、神经性退化疾病等。本实验室已有研究表明，Mark4可能负向调控机体能量代谢，并且同时负调控胰岛素敏感性，但是其具体机理还不清楚；此外，在这一过程中，线粒体这一在新陈代谢中起重要作用的细胞器是否参与其中

5、，也未见研究。3.国内外研究概况3.1 Mar4研究概况3.1.1 Mark4的结构与调控MARKs家族在结构上有较高的相似性，按其功能可以分为三部分：N端的催化区域、C端的结构序列和一个可以结合泛素的区域3。其中的Mark4基因可编码S型和L型两个可变剪切体：其中Mark4S长达3,609bp，包括一个2,069 bp的18个外显子的开放阅读框，可编码688个氨基酸；而Mark4L的cDNA 有3,529对碱基，但是缺乏第16个外显子，只可以编码752个氨基酸。 Mark4的两个亚型中，Mark4L 由752个氨基酸残基构成，可以分为三个功能区：蛋白激酶结构域(59314)，泛素结合区(32

6、2369)和激酶相关结构域(703752) 。其中激酶相关结构域和之前的649703位氨基酸残基共同发挥作用，影响激酶的折叠和功能。此外，第6573 位的氨基酸残基是ATP结合域，而Lys88 是ATP结合位点。Asp181 是Mark4的活性位点，其侧链的Thr214可以通过被磷酸化而激活。3.1.2 MARKs的功能MARKs家族通过磷酸化作用使得微管关联蛋白从微管上解离，进而参与微管的动力学作用、细胞分裂、细胞周期调控，细胞极性决定和细胞形态改变等机体内的多项生理调节功能。在早期的研究中，MARKs家族的功能主要集中在细胞微管网络稳定性的调控以及细胞极性的调控方面。具体体现为MARKs可

7、以磷酸化修饰Tau蛋白，从而使Tau蛋白与神经细胞的微管分离4。Thies等人研究中指出Tau蛋白是微管关联蛋白，它的解离能够引起神经细胞的轴突变性，微管网络的不稳定5。其中，Mark2的过表达在Chen等人的研究中被发现与神经细胞中轴突的形成有关，此外，Mark2还被发现能够参与细胞极性的决定6。除了细胞极性以及微管稳定性方面的调控作用，MARKs家族越来越多的功能被逐渐发现。例如促进细胞凋亡、参与糖代谢、维管束的形成、参与能量稳态的调节、神经系统发育等等。有研究表明Mark2不但参与学习和记忆的调控，而且作用于生殖和免疫系统的平衡7-8，并且在葡萄糖代谢和能量代谢方面也有着重要的作用。例如

8、在Hurov J等人9发现Mark2-/-敲除鼠在高脂日粮的诱导下，胰岛素敏感性和机体的代谢率都有所增强，而脂肪沉积和体增重有所减少，敲除鼠的白色脂肪组织（WAT)和褐色脂肪组织(BAT)中，葡萄糖的吸收较之对照组，被明显促进了。此外，对另一家族成员Mark3的研究发现这一成员在机体能量平衡的调节中也有着重要的作用。在Mark3-/-敲除鼠中，饲喂正常日粮时，敲除鼠的能量消耗增加，体脂的沉积减少，胰岛素敏感性也降低；饲喂高脂日粮时，敲除鼠体增重减少，葡萄糖吸收增强，胰岛素敏感性也增加，而且无肥胖体征或肝脏脂肪变性出现10。然而同为Par-1家族激酶成员的Mark4，其生理功能的研究，较之家族的

9、其他成员较少，其具体功能目前仍不清楚。3.1.3 Mark4研究近况有报道称，Mark4S 亚型在脑中大量表达，这预示着该很可能参与神经元的分化，而Mark4L 亚型在肝癌细胞和神经胶质瘤细胞中表达上调，这预示着该亚型，可能会参与细胞周期调控 3。此外，在Sun等人11研究中，Mark4敲缺小鼠可通过上调棕色脂肪活性，表现出食欲过胜、活动量增多、代谢率增加的效应，从而有效抵制高脂日粮引起的肥胖。该研究进一步指出，Mark4缺乏可减轻胰岛素抵抗相关的饮食诱导肥胖，而该作用是通过增加并激活胰岛素刺激的AKT 磷酸化来实现；Mark4缺失可通过上调并活化AMPK 相关激酶来维持体内葡萄糖代谢的稳态。

10、据已有研究表明，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)能够底物磷酸化作用于4,5二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，从而生成3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，而PIP3能够通过PKB/Akt等下游的诸多细胞信号通路，调控细胞增殖、能量平衡、糖代谢、脂类代谢等生理反应12-13。此外，PI3K/Akt还能够抑制细胞的线粒体凋亡通路：首先通过磷酸化促凋亡蛋白Bad而使之发生降解，从而增加抗凋亡蛋白Bcl2和Bcl-xl的活性，最终抑制凋亡14。综上所述， PI3K/Akt信号通路很可能在Mark4促进脂沉积的过程中起着重要的作用，并且涉及线粒体功能的改变。另外，PI3K/Akt信号通路可通过磷酸化从而降解I

11、B，然后活化NF-B，进而促进细胞的存活。3.2 线粒体功能相关机理的研究在动物细胞中，线粒体是脂肪酸氧化、氧化磷酸化和ATP合成的主要场所1，也是很多代谢活动的重要调控者，例如糖代谢，脂代谢，细胞信号转导和凋亡2。线粒体功能紊乱可以引起一系列的人类疾病，例如糖尿病，肥胖，癌症， 衰老， 心血管疾病，神经性退化疾病等15。PGC-1 这类共转录共激活因子是线粒体生物合成的主要诱导物16。许多研究表明，脂肪化的肝脏中，线粒体的超微结构出现异常，比如线粒体肿胀，线粒体嵴扭曲17-18。有研究表明，胆固醇合成的增加，可以抑制线粒体功能的发挥，并降低了线粒体合成蛋白质的能力，这一现象揭示了细胞脂质代谢

12、的改变可以影响线粒体功能这一规律19。另有研究发现，吡格列酮可通过激活肌肉中的AMPK信号通路，从而增加血浆中脂联素的含量，并且增加有关线粒体功能和脂肪氧化中关键基因的表达20。据研究报道，在3T3-L1细胞的分化过程中，线粒体的异常蓄积可能与脂肪酸的氧化和葡糖糖的转运有关21。而Kim等人在3T3-L1前体脂肪细胞研究中，添加了诱导剂以及线粒体呼吸链的抑制剂鱼藤酮，在相关处理之后，发现脂肪细胞的分化表现异常，主要是甘油三酯形成被显著降低了。因此推测线粒体与脂代谢密切相关22。最近研究表明，脂肪细胞分化过程中线粒体生物合成增加23，但在肥胖db/db小鼠的脂肪细胞的线粒体的数量减少24-25。

13、这些数据表明，线粒体的发生是脂肪细胞分化以及代谢活动所必需的，脂肪细胞肥大过程伴随着线粒体数量的减少。mtTFA是一种重要的核编码线粒体基因，调控线粒体基质蛋白和线粒体DNA的表达26。EH Koh25研究发现腺病毒介导的NRF-1基因3T3L1 脂肪细胞中过表达增加了mtTFA 表达和 mtDNA 含量，并且伴随着脂联素分泌的增加近年来，肥胖发生时的线粒体功能紊乱一直是研究热点。有研究报道了在啮齿动物骨骼肌中AMPK 的活化既可以增加线粒体的生物合成也可以增加线粒体的活性。而在AMPK-2 的敲缺鼠中，PGC-1表达量减少，和活化AMPK可增加线粒体生物合成这一结果一致27。在肥胖动物模型中

14、，脂联素激活的 AMPK 可以增加肌肉和肝脏中的脂肪的氧化，并且增加胰岛素的敏感性28。有研究揭示，活化的AMPK 促进乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-coenzyme A carboxylase，ACC) 的磷酸化作用，减少丙二酰辅酶A的表达， 增加 CPT-1 的活性和线粒体中脂肪酸的氧化29-30。总的来说，这些数据皆揭示了AMPK的激动剂可以同时增加线粒体的数目和线粒体的氧化能力。AMPK/ACC2信号通路也可以为为本试验提供理论上的机理解释。 综上所述，线粒体功能与脂代谢、细胞凋亡、氧化应激、胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病等代谢综合症等相关过程的发。生有着密切的联系，并且其中可能涉及JNK

15、s、AMPK-ACC、Akt等多条信号通路的参与。但是Mark4是否影响线粒体功能，又是否通过线粒体功能影响其他相关生理功能的实现，还有待研究。4.研究内容（1）Mark4对3T3-L1脂肪细胞中线粒体的形态学影响；（2）Mark4对线粒体膜电位变化的影响；（3）细胞色素C免疫荧光检测；（4）线粒体功能关键基因的表达水平变化。5.研究方法及技术路线(1) 研究方法: 培养3T3-L1脂肪细胞，转染Mark4超表达载体和干扰载体，利用荧光显微镜观察观查细胞中线粒体形态，采用流式细胞仪检测细胞中线粒体膜电位变化，通过免疫荧光染色技术测定细胞色素C的荧光变化，采用定量PCR技术和蛋白杂交等检查线粒体

16、功能相关基因的表达水平。(2) 技术路线:Mark4超表达与干扰质粒载体转染培养3T3-L1前体脂肪细胞线粒体关键基因与mtDNA数量变化线粒体相关通路水平检测线粒体膜膜电位变化Cytc-C的表达水平变化线粒体数量、嵴变化关键标志指标检测机理验证形态学分析Mark4影响3T3-L1前体脂肪细胞线粒体功能6.预期结果（1）阐明Mark4对线粒体功能的影响；（2）探讨Mark4可能通过对线粒体的作用。7.研究的创新点本试验首次通过基因功能研究方法即超表达和干扰Mark4基因转染前体脂肪细胞系3T3-L1细胞，阐明Mark4对3T3-L1细胞中线粒体的形态学影响、线粒体发育的影响，并从信号通路对相关

17、调控机理进行了探讨。8.所需的主要仪器设备和试剂及工作条件(1) 仪器设备:PCR扩增仪(Veriti 96 Well Thermal Cycle)、电子天平、常温高速离心机、低温冷冻离心机、移液器、高压灭菌锅、凝胶成像仪、超净工作台等。(2) 试剂：Trizol（TaKaRa公司）；质粒抽提试剂盒（Omega公司）；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit、Taq DNA聚合酶（Fermentas公司）；DNA Marker（天根公司）；TurboFect in vivo Transfection Reagent（Fermentas公司）；DME

18、M(高糖)干粉（Gibco公司）；HEPES、胰蛋白酶（Merck公司）；胎牛血清FBS（四季青公司）；引物（上海生工公司）；苹果酸脱氢酶1(MDH) 和细胞色素C (Cytc) 一抗（Bioword公司），二抗（武汉博士德公司）；MyHC一抗MF-20（美国DSHB公司），二抗羊抗鼠IGg2b（英骏公司）等。9.论文工作进展安排工作进展安排表时间Time工作进展安排Work arrangement2014.11-2014.12收集资料，撰写开题报告，学习相关实验技术2014.12-2015.02筛选Mark4干扰质粒载体，检测超表达及干扰效率2015.02-2015.04Mark4对线粒体功

19、能相关指标的影响2015.04-2014.05整理试验数据，分析总结试验结果2015.06撰写本科学位论文，答辩10.经费预算经费预算表用途金额（元）胎牛血清500DMEM(高糖)干粉 200HEPES、胰蛋白酶100实时定量检测试剂500质粒提取试剂盒100测序费用100RNA提取试剂盒100反转录试剂盒300抗体400JC-1染液、DAPI染料100其它试剂400文印费200合计300011研究工作中面临的技术难点和拟采取的解决办法（1）学习动物生化中脂类代谢及其调控的基础理论知识；(研读生物化学与细胞生物学等专业书籍，夯实基础知识；阅读大量文献，熟悉研究进展)（2）掌握分子生物学中PCR

20、和Western Blot等技术。（向老师、高年级同学请教，上网查询）12参考文献1 Kadenbach B, Ramzan R, Vogt S. High efficiency versus maximal performancethe cause of oxidative stress in eukaryotes: a hypothesisJ. Mitochondrion, 2013, 13(1): 1-6.2 Diaz F, Moraes C T. Mitochondrial biogenesis and turnoverJ. Cell calcium, 2008, 44(1): 24-

21、35.3 Naz F, Anjum F, Islam A, et al. Microtubule Affinity-Regulating Kinase 4: Structure, Function, and RegulationJ. Cell biochemistry and biophysics, 2013, 67(2): 485-499.4 Stoothoff W H, Johnson G V W. Tau phosphorylation: physiological and pathological consequencesJ. Biochimica et Biophysica Acta

22、 (BBA)-Molecular Basis of Disease, 2005, 1739(2): 280-297.5 Thies E, Mandelkow E M. Missorting of tau in neurons causes degeneration of synapses that ca3T3-L1 be rescued by the kinase MARK2/Par-1J. The Journal of neuroscience, 2007, 27(11): 2896-2907.6 Chen Y M, Wang Q J, Hu H S, et al. Microtubule

23、affinity-regulating kinase 2 functions downstream of the PAR-3/PAR-6/atypical PKC complex in regulating hippocampal neuronal polarityJ. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006, 103(22): 8534-8539.7 Hurov J, Piwnica-Worms H. The Par-1/MARK Family of Protein KinasesJ. Cell Cycle, 2007, 6

24、(16): 1966-1969.8 Segu L, Pascaud A, Costet P, et al. Impairment of spatial learning and memory in ELKL Motif Kinase1 (EMK1/MARK2) knockout miceJ. Neurobiology of aging, 2008, 29(2): 231-240.9 Hurov J B, Huang M, White L S, et al. Loss of the Par-1b/MARK2 polarity kinase leads to increased metabolic

25、 rate, decreased adiposity, and insulin hypersensitivity in vivoJ. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007, 104(13): 5680-5685.10 Lennerz J K, Hurov J B, White L S, et al. Loss of Par-1a/MARK3/C-TAK1 kinase leads to reduced adiposity, resistance to hepatic steatosis, and defective gluc

26、oneogenesisJ. Molecular and cellular biology, 2010, 30(21): 5043-5056.11 Sun C, Tian L, Nie J, et al. Inactivation of MARK4, an AMP-activated protein kinase (AMPK)-related kinase, leads to insulin hypersensitivity and resistance to diet-induced obesityJ. Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(45

27、): 38305-38315.12 Saltiel A R, Kahn C R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolismJ. Nature, 2001, 414(6865): 799-806.13 Raught B, Gingras A C, Sonenberg N. The target of rapamycin (TOR) proteinsJ. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2001, 98(13): 7037-7044.1

28、4 Pastorino J G, Tafani M, Farber J L. Tumor necrosis factor induces phosphorylation and translocation of BAD through a phosphatidylinositide-3-OH kinase-dependent pathwayJ. Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(27): 19411-19416.15 Wallace D C. Mitochondria and cancer: Warburg addressedC/Cold S

29、pring Harbor symposia on quantitative biology. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2005, 70: 363-374.16Austin S, St-Pierre J. PGC1 and mitochondrial metabolismemerging concepts and relevance in ageing and neurodegenerative disordersJ. Journal of cell science, 2012, 125(21): 4963-4971.17Bruguera M,

30、Bertran A, Bombi J A, et al. Giant mitochondria in hepatocytes: a diagnostic hint for alcoholic liver diseaseJ. Gastroenterology, 1977, 73(6): 1383-1387.18Yang S Q, Zhu H, Li Y, et al. Mitochondrial adaptations to obesity-related oxidant stressJ. Archives of biochemistry and biophysics, 2000, 378(2)

31、: 259-268. 19 肖静， 张英， 于炜婷，等.微囊化 HepG2 细胞脂代谢与线粒体功能和蛋白的合成J. 中国组织工程研究，2010，14(38): 7082-7086.20 Coletta D K, Sriwijitkamol A, Wajcberg E, et al. Pioglitazone stimulates AMP-activated protein kinase signalling and increases the expression of genes involved in adiponectin signalling, mitochondrial functi

32、on and fat oxidation in human skeletal muscle in vivo: a randomised trialJ. Diabetologia, 2009, 52(4): 723-732.21 Shi X, Burkart A, Nicoloro S M, et al. Paradoxical effect of mitochondrial respiratory chain impairment on insulin signaling and glucose transport in adipose cellsJ. Journal of Biologica

33、l Chemistry, 2008, 283(45): 30658-30667.22 Kim T, Wayne Leitner J, Adochio R, et al. Knockdown of JNK rescues 3T3-L1 adipocytes from insulin resistance induced by mitochondrial dysfunctionJ. Biochemical and biophysical research communications, 2009, 378(4): 772-776. 23 Wilson-Fritch L, Burkart A, Be

34、ll G, et al. Mitochondrial biogenesis and remodeling during adipogenesis and in response to the insulin sensitizer rosiglitazoneJ. Molecular and cellular biology, 2003, 23(3): 1085-1094.24 Choo H J, Kim J H, Kwon O B, et al. Mitochondria are impaired in the adipocytes of type 2 diabetic miceJ. Diabetologia, 2006, 49(4):