枇杷花粉原位萌发及花粉管生长特性研究

1、 枇杷花粉原位萌发及花粉管生长特性研究四川农业大学林学园艺学院观赏园艺04级李应红指导教师邓群仙(副教授)摘要：以大五星为试材，研究花粉原位萌发及花粉管生长特性。结果表明，柱头保持可授性生理状态的持续时间较长(7d),与花粉原位萌发时间不一致，间隔期较长(3-4d);大五星自花授粉、自然授粉后花柱上部的花粉管与萌发花粉的比率显著高于中部，而异花授粉后表现不出这种差异。大五星异花授粉后花粉管正常生长的胚珠比率显著高于自花授粉；正常发育胚珠中花粉管正常生长的胚珠比率极显著高于轻度退化与瘪粒胚珠，花粉管生长正常的胚珠比率在落花与正常发育谢花胚珠间存在极显著差异。大五星枇杷表现出一定的自交不亲和性，受

2、精前障碍是枇杷果实出现不同程度退化种子及退化种子植株遗传多样性丰富的根本原因。关键词：枇杷；花粉原位萌发；花粉管生长StudyonCharacteristicsofinSituPollenGerminationandTubeGrowthofLoquatHorticultureDepartment,ForestryandHorticultureCollege，SichuanAgriculturalUniversityLiYing-hongDirectedbyDengQun-xian(AssociateProfessor)Abstract:Thecharacteristicsofpollenger

3、minationandpollentubegrowthwerestudiedbyusingDawuxingastestmaterials.Theresultsshowedthat:thestigmareceptivitylastedabout7d,andthepollengerminationwasvarianceamongstigmas,andtherewerelongintervalsamongdifferentstigmas(3-4d).Therateofpollentubesreachedupperstylestogerminatedpollenswassignificantlymor

4、ethanthosereachedmiddlestyleswhentheDawuxingwaspollinatedinnaturalconditionsaswellasself-pollination.Buttherewasnoobviousdifferenceincross-pollinationofDawuxing.Thepercentageofovulesinwhichpollentubegrowthwasnormalincross-pollinationofDawuxingwasobviouslyhigherthanthatinself-pollination.Thedifferenc

5、esofpollentubegrowthwereremarkableintheseovuleswhichwerenormalgrowth,low-gradedegenerationandabnormality,andalsobetweentheovulesoffallenflowersandnormalsearflowers.TheconclusionheldthatDawuxingwasself-incompatibilitytosomeextent,andpre-fertilizationbarrierwasthebasicreasonwhichresultedinseriousembry

6、oabortionandtheabundantgeneticdiversityofplantsfromdegenerateseeds.Keywords:Loquat;Pollengermination;Pollentubegrowth枇杷（EriobotryajaponicaLindl）每个果实均有5个心室，每心室各有2粒种子，但在果实发育过程中，由于各种原因致使多数种子发生不同地退化，最终发育成熟的种子多在34粒，且退化种子植株具有丰富的遗传多样性，这为枇杷选育工作提供了宝贵的材料。种子败育的胚胎学机制主要有雄性不育，雌性器官不孕，授粉受精不良与胚中途败育，不同植物胚败育的时间、原因及解剖学

7、特征各不相同2。近年来一些研究者应用荧光显微技术对果梅3、梨4,5、中国樱桃及甜樱桃6的花粉在活体柱头上的萌发及花粉管在花柱中的生长特性进行了大量研究，为研究这些果树的育性、胚败育及合理地利用育种材料提供了宝贵的胚胎学资料。但关于枇杷花粉原位萌发和花粉管生长的研究尚未见报道。因此，本研究以大五星为材料，对自然授粉、自花和异花授粉后花粉原位萌发及花粉管在花柱与胚珠中的生长情况进行观察，旨在为研究枇杷育性、胚败育及退化种子形成原因提供胚胎学依据。1材料与方法材料以四川农业大学园艺生物技术研究中心枇杷园内10年生枇杷为试材，品种为大五星，其连续3年的平均花粉活力为64.88%，每个果实中正常种子、轻

8、度退化种子及完全退化种子的粒数分别为2.47、0.34、7.19，选择发育良好的结果枝及花序进行试验。其异花授粉品种为龙泉1号其花粉活力为72.83%。采集大蕾期花蕾，剥出花药，置于25C恒温箱培养，散粉后收集花粉置于-20C冰柜中备用。自然条件下授粉后花粉原位萌发、花粉管生长情况观察在盛花期晴天上午，以开花当天（第1d）为标志，在开花当天挂牌270朵花，分别在第1d-7d，每天中午取30朵花的花柱作花粉原位萌发检测；在第9d（经预备实验证实在此之后有花粉管的胚珠比率趋于稳定）取30朵花的花柱及胚珠作花粉原位萌发与花粉管生长情况观察，在第25d（此时花药完全变褐，萼片开始收拢，同一朵花中的胚珠

9、可肉眼区分出大小）取落花（手碰即落）与同阶段正常发育花各30朵，观察胚珠中花粉管生长情况。每次所取材料用冰壶带回实验室后，以每朵花为单位用刀片从花柱基部切取花柱，用解剖针从胎座处挑取胚珠放入同一小瓶中，FAA固定液（38%甲醛:冰醋酸:70%无水乙醇=5:5:90）处理、备用。大五星自花、异花授粉后花粉原位萌发及花粉管生长观察在大蕾期挂牌70朵花，自花、异花授粉各30朵，去雄后用硫酸纸套袋隔离，10朵作观察对照。在对照花开花后第3d上午11：00左右进行自花（大五星x大五星）和异花授粉（大五星x龙泉1号），授粉后用硫酸纸套袋隔离，授粉后第5d取样，并按1.2中的方法处理，备用。花粉原位萌发和花

10、粉管生长观测方法参照杜玉虎等7的方法，并作部分修改，取出备用花柱、胚珠，水洗几次后，1mol/LNaOH溶液软化（25C,72h），水洗3次后用0.1%苯胺蓝染色液（0.1%K3PO4配制）染色48h。在OLYMPUS-DP70荧光显微镜下压片观察花粉萌发和花粉管生长情况。用新复极差方法统计分析实验所得数据。2结果与分析不同花发育阶段柱头花粉原位萌发比较在开花当天，可在极少数花柱的柱头上可以观察到萌发的花粉，随着花的发育，柱头上有原位萌发花粉的花柱比率逐渐升高，到开花后的第5天，可以观察到约90%花柱的柱头上有萌发的花粉，且从这之后柱头上有花粉萌发的花柱比率趋于稳定。开花后的天数Thedaya

11、fterflowersopened（d）图1不同花发育阶段有萌发花粉的花柱比率比较Fig.1Comparisonofrateofstylewithgerminationpollenofdifferentfloralstages同时试验表明大五星在自然条件下授粉后花粉萌发时期主要集中在开花后的第2-4天，其柱头具可授性的持续时间较长（约7d）,花粉萌发时间不一致，多数间隔3-4d（图1）。大五星自花、异花授粉后花粉原位萌发及花粉管大五星异花授粉后花粉在柱头上水合萌发效果优于自花授粉，并且异花授粉后花柱上部、中部、基部的花粉管量与萌发花粉的比率都显著高于自花授粉。自花授粉后花柱上部的花粉管量与萌发

12、花粉的比率都极显著高于花柱中部以及基部，但异花授粉后花柱上有花粉管的胚珠花粉管生长正常的胚珠EmbryowithpollentubeEmbryowithnormallygrewpollentubeOOOOOOO208642自花授粉Self-pollinationofDawuxing花柱的不同部位Thedifferentpartofstyle妬/或夜率比oooO2086%率比A4420部、中部及基部间的花粉管量差异不显著（图2-A）。不同花粉管发育状况的胚珠Ovuleswhosepollentubeswereindifferentdevelopmentalconditions图2大五星自花、异花

13、授粉后花粉原位萌发及花粉管生长比较注.A.花柱不同部位的花粉管量与萌发花粉数的比率；B.有花粉管的胚珠、花粉管生长正常的胚珠与观察总胚珠数的比率。（图3相同）Fig.2Comparisonofpollengerminationandpollentubegrowthbetweenself-andcross-pollinationofDawuxingNote:A.Theratioofpollentubeinthedifferentpartofstylestogerminatedpollen;B.Theratioofembryowithpollentubesornormalgrewpollentub

14、estototalembryos.（ThesameofFig.3）有花粉管的胚珠比率在自花、异花授粉间差异不显著，但异花授粉后花粉管生长正常的胚珠比率显著高于自花授粉（图2-B）。综合上述结果表明大五星枇杷表现出一定的自交不亲和性，花柱中部与珠孔处为自交不亲和的关键部位。大五星自然授粉后花粉原位萌发及花粉管生长比较自然授粉后大五星单个柱头表面花粉水合萌发的效果较好，且到达花柱上部的花粉管量与萌发花粉的比率显著高于到达花柱中部与基部。花粉管在花柱中生长受到了显著的抑制作用，只有约萌发花粉30%的花粉管能够生长至花柱基部（图3-A；图版，79）。率比ooooooooo00765432111率比有花

15、粉管的胚珠Embryowithpollentube花粉管生长正常的胚珠Embryowithnormallygrewpollentube花柱的不同部位Thedifferentpartsofstyle不同花粉管发育状况的胚珠Ovuleswhosepollentubeswereindifferent图3大五星自然授粉后花粉原位萌发及花粉管生长比较Fig.3ComparisonofpollengerminationandpollentubegrowthofpollinationInnaturalconditionsofDawuxing.在近85%的胚珠中发现有花粉管，但有花粉管的胚珠比率极显著高于花粉

16、管生长正常的胚珠比率，70%以上胚珠中的花粉管生长表现出弯曲或沿珠被生长的现象，出现受精前障碍（图3-B）。2.4不同发育状况胚珠中花粉管生长比较不同发育状况的胚珠间的花粉管生长情况差异显著，表现为有花粉管的正常发育胚珠、轻度退化胚珠比率极显著高于瘪粒胚珠；正常发育胚珠中花粉管正常生长的胚珠比率极显著高于轻度退化胚珠，且所检测的瘪粒胚珠中未发现有花粉管生长正常的情况（图版1319）。落花胚珠与正常发育谢花的胚珠相比较，胚珠中有花粉管的比率几乎无差异，但花粉管生长正常的胚珠比率则表现为正常发育谢花的胚珠极显著多于落花胚珠。这表明花粉管生长至胚珠后，只有部分胚珠中的花粉管能穿过珠孔完成受精作用，而

17、余下的胚珠由于产生受精前障碍而未完成受精作用，使这些胚珠后继发育表现为轻度退化或瘪粒（图4）。ooooooO42O00642TTN-PL-PA-PF-PS-PN-NPL-NPA-NPF-NPS-NP不同发育状况胚珠中花粉管Thesituationofembryodevelopmentandpollentubegrowth图4不同发育状况胚珠中花粉管生长比较注：P-表示胚珠中有花粉管；NP-表示胚珠中的花粉管正常生长；N表示正常发育胚珠；L表示轻度退化胚珠；A表示瘪粒胚珠；F表示落花胚珠；S表示正常发育的谢花胚珠。Fig.4Comparisonofpollentubegrowthindiffer

18、entbuddingstageembryo.Note:Pstandsembryoswithpollentube;NPstandsembryoswithnormalgrewpollentube;Nstandsnormalgrowthembryos;Lstandslow-gradedegenerationembryos;Astandsabnormalityembryos;Fstandsfallenflowersembryos;Sstandsnormalgrowthsearflowersembryos.3讨论3.1花粉原位萌发时间对花粉管生长的影响枇杷花柱头具可授性的持续时间为7d左右，与授粉（花粉

19、原位萌发）时间不一致，多数间隔3-4d，而枇杷从授粉到花粉管生长至花柱基部只需48h。推测这可能是同一朵花不同花柱或不同胚珠中的核糖核酸酶（S-RNases）、受体激酶等酶类及G蛋白、Ca2+等分布存在差异，继而使不同花柱或胚珠中花粉管生长迥异8。3.2枇杷花粉原位萌发及花柱中花粉管生长与育性大五星异花授粉后花粉在柱头上水合萌发的效果优于自花授粉（图版，4，1），异花授粉后花柱上部、中部、基部的花粉管量与萌发花粉的比率，以及花粉管生长正常的胚珠比率都显著高于自花授粉，且花柱上部与中部的花粉管数量与萌发花粉的比率差异不显著（图版，5，6），而自花授粉后花柱上部的花粉管数量与萌发花粉的比率显著高于

20、花柱中部（图2），一些花粉管在花柱上部或中部停止生长（图版，2）。自然授粉后花柱上部的花粉管量与萌发花粉的比率显著高于花柱中部及基部，花粉管在花柱中的生长都受到了显著的抑制作用，表现出一定的自交不亲和性（图3-A、B；图版，13,79）。这可能是受到了花柱内S基因产物的抑制，如较高浓度的S糖蛋白9，或花柱中缺少油脂、磷脂等促进花粉管生长类物质10。因此进一步对花柱与胚珠进行对比生化试验分析，对深入认识枇杷育性及胚败育有重要意义。胚珠中花粉管生长与育性及退化种子植株遗传多样性在开花后第9d,有花粉管的胚珠比率都约为80%,但花粉管生长正常的胚珠比率都不足30%，且花粉管正常生长的胚珠比率与该品种

21、果实发育成熟种子的比率相一致。在开花第25d,花粉管正常生长的正常发育胚珠的比率显著高于轻度退化与瘪粒胚珠，花粉管沿珠被生长的轻度退化胚珠比率接近60%（图版，16，17），这可能是珠孔处为自交不亲和的关键部位或珠被中适宜的高Ca2+浓度导致花粉管生长方向改变ii，i2,使花粉管未能穿过珠孔完成受精作用。结合3.2认为,大五星枇杷在花柱与珠孔处表现出一定的自交不亲和性，这点西班牙学者曾有报道13,不同的是他们发现枇杷花粉管虽能进入子房，但受精受阻；而本研究发现花粉管可以生长至胚珠并沿珠被生长,但不能穿过珠孔完成受精作用。正常发育果实中营养物质与激素类物质的正常供给，使未完成受精（图版，1619

22、），的胚得以继续发育，经无融合生殖过程发育为退化种子，这些退化种子植株出现非整倍体、多倍体以及多胚苗，从而表现出丰富的遗传多样性14。因此开展退化胚发育过程研究以及对比生化试验分析，对枇杷育种有重要意义。4结论枇杷花粉原位萌发间隔期较长，导致不同花柱与胚珠中的生理活性物质存在差异，为花粉管在不同花柱与胚珠中生长迥异提供了物质差异基础。大五星枇杷表现出一定的自交不亲和性，花柱与珠孔处为其自交不亲和的关键部位，自交不亲和及受精前障碍是枇杷果实出现不同程度退化种子及退化种子植株遗传多样性丰富的根本原因。图版说明：13.大五星自花授粉后柱头上花粉原位萌发、花柱中部及花柱基部花粉管生长情况（x40,xl

23、00,xl00）；46.大五星异花授粉后柱头上花粉原位萌发、花柱中部及花柱基部花粉管生长情况（x40,x100,x100）；79.大五星自然授粉后柱头上花粉原位萌发、花柱中部及花柱基部花粉管生长情况（xlOO）；1012正常发育、轻度退化及瘪粒胚珠（开花后第25天）（x40）；1315正常发育胚珠中的花粉管生长情况（X100）；16,17轻度退化胚珠中花粉管生长情况Cx100,x40）；18,19.瘪粒胚珠中花粉管生长情况（x100,x40）.Explanationofplates:13.ThedevelopmentofPollengerminationonstigmaandPollentub

24、egrowthinmiddlepartandbottompartofstyleofDawuxingself-pollination（x40,x100,x100）;46.ThedevelopmentofPollengerminationonstigmaandPollentubegrowthinmiddlepartandbottompartofstyleofDawuxingcross-pollination（x40,x100,x100）;79.ThedevelopmentofPollengerminationonstigmaandPollentubegrowthinmiddlepartandbot

25、tompartofstyleofDawuxingpollinationinnaturalconditions（x100）;1012.Normalgrowth,low-gradedegenerationandabnormalityembryos（25dafterflorescence）（x40）;1315.ThedevelopmentofPollentubegrowthinNormalgrowthembryos（x100）;16,17.ThedevelopmentofPollentubegrowthinlow-gradedegenerationembryos（x100,x40）;18,19.Th

26、edevelopmentofPollentubegrowthinabnormalityembryos.（x100,x40）参考文献References:DENGQX,DONGYN,WANGYQet.al.StudyonEmbryoAbortionandSeedDegenerationofLoquatJ.SouthChinaFruits,2007,36（6）:46-48.（inChinese）邓群仙，董燕妮，王永清等.枇杷种子的退化及胚败育研究J中国南方果树，2007,36（6）:46-48.LiangCL,LiuMJ,ZhaoJ.ResearchProgressionPlantSeedsAbo

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