植物组织培养的培养基主要成份

1、植物组织培养培养基的主要成分1.无机营养物无机营养物 主要由大量元素和微量元素两部分组成大量元素主要包括氮、 磷、钾、钙、镁和硫六种氮源通常有硝态氮或铵态氮但在培养 基中用硝态氮的较多也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。磷和 硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。钾是培养基中主要的阳离子 在近代的培养基中其数量有逐渐提高的趋势。而钙、钠、镁的 需要则较少。培养基所需的钠和氯化物由钙盐、磷酸盐或微量 营养物提供。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钻和铁这 些元素有的对生命活动的某个过程十分有用有的对蛋白质或 酶的生物活性十分重要有的是参与某些生物过程的调节。培养 基中的铁离子大多以螯合铁的形式存在即FeSO4

2、与Na2EDTA螯合剂的混合。2.碳源培养的植物组织或细胞它 们的光合作用较弱。因此需要在培养基中附加一些碳水化合物 以供需要。培养基中的碳水化合物通常是蔗糖或D-葡萄糖用 量通常为2-4高者可达5亦可用市售的白糖所代替但一般应增 加用量而且最好用比较固定的厂家生产的产品以保证实验的 稳定性。3.有机营养成分包括人工合成或天然的有机附加物 包括维生素氨基酸及其它有机物质等。最常用的有酪朊水解物 水解乳蛋白、水解酪蛋白CH、酵母提取物、玉米胚乳、麦芽 浸出物、西红柿汁、椰子汁CM及各种氨基酸如甘氨酸氨基乙 酸等。维生素在培养基中加入维生素常有利于外植体的发育。 培养基中的维生素属于B族维生素其中

3、效果最佳的有硫氨素 维生素B1、盐酸吡哆醇维生素B6和维生素H生物素、泛酸 钙等、肌醇环己六醇、烟酸。在部分培养基中还添加维生素 BX氨酰苯甲酸、维生素C抗坏血酸、维生素E生育酚、维 生素B12氰钻胺酸、维生素BC叶酸、维生素B2核黄素和氯 化胆碱等维生素。这些可能对某些植物或植物的某些代谢过程 有重要作用如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与 由Ca介导的信号转导。4.生长调节物质常称为激素 常用的 生长调节物质大致包括以下三类1植物生长素类。主要作用 是诱导愈伤组织的产生促进细胞脱分化促进细胞的伸长促进 生根。如吲哚乙酸IAA、萘乙酸NAA、IBA吲哚丁酸、NOA 萘氧乙酸P-CPA对

4、氯苯氧乙酸、24-D24-二氯苯氧乙酸 245-T245-三氯苯氧乙酸和ABT生根粉等。生长素的使用浓度 通常为0.110mg/L。2细胞分裂素。如玉米素Zt6-4-羟基-3- 甲基-反式-2-丁烯氨基嘌吟、6-苄基嘌吟6-BA或BAP和激动 素Kt6-呋喃氨基嘌吟、2IP异戊烯氨基嘌吟和TDZthidiazuron 噻二唑苯基脲等。作用主要是第一促进细胞分裂和扩大与生长 素促进细胞伸长的作用不同可使茎增粗而抑制茎伸长第二诱 导芽的分化促进侧芽萌发生长第三抑制衰老减少叶绿素的分 解。延缓离体组织或器官的衰老过程有保鲜的效果。但是细胞 分裂素对根的生长一般起抑制作用。在组培中细胞分裂素的使 用浓

5、度通常为0.110mgL。细胞分裂素常常与生长素相互配合 用以调节细胞分裂细胞伸长细胞分化和器官形成。3赤霉素。 组织培养中使用的赤霉素只有一种即赤霉酸GA3。虽然已经 用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究但在培养基中很 少添加因为它的作用往往是负面的。乙烯等。5.琼脂或其他 支持物 除液体悬浮培养外就目前情况而言琼脂是一种极为理 想的支持物。一般浓度0.4-1质量越差的琼脂用量越大。琼脂 作为培养基的支持物使培养基呈固体状态以利于各种外植体 的培养。6.其他添加剂含天然提取物、抗生素等活性炭渗 透调节剂抗生素抗氧化剂等。活性炭加入培养基中的目的 主要是利用其吸附能力减少一些有害物质的影响例

6、如防止酚 类物质污染而引起组织褐化死亡。这在兰花组织培养中效果更 明显。另外活性炭使培养基变黑有利于某些植物生根。但活性 炭对物质吸附无选择性既吸附有害物质也吸附有利物质因此 使用时应慎重考虑不能过量一般用量为15。活性炭对形态 发生和器官形成有良好的效应。在失去胚状体发生能力的胡萝 卜悬浮培养细胞中加入1 一 4活性炭可使胚状体的发生能力得 以恢复。7.水水是植物原生质体的组成成分也是一切代谢过 程的介质和溶媒。配制培养基母液时要用蒸馏水以保持母液及 培养基成分的精确性防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可 用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水以防成分的变化引起 不良效果。8.pH培养基的pH

7、因培养材料不同而异大多数植 物都要求在pH5.65.8的条件下进行组织培养。常用0.1mol/L 的Na0H和0.1mol/L的HCl来调节培养基的PH。但需注意两 点第一经高温高压灭菌后培养基的PH会下降0.20.8故调整 后的PH应高于目标pH0.5个单位第二pH的大小会影响琼脂 的凝固能力一般当pH大于6.0时培养基将会变硬低于5.0时 琼脂就不能很好地凝固。培养基种类根据培养基态相不同分 为固体培养基与液体培养基。固体培养基是指加凝固剂多为琼 脂的培养基其优点是外植体只是部分接触培养基因此会使培 养基中的效应物质产生一定的浓度梯度从而有利于外植体的 分化、生长。液体培养基是指不加凝固剂

8、的培养基。外植体在 液体培养基中能够与效应物质更好地接触因此生长速度比在 固体培养基中更快。根据培养物的培养过程培养基分为初代培 养基与继代培养基。初代培养基是指用来第一次接种外植体的 培养基。继代培养基是指用来接种继初代培养之后的培养物的 培养基。根据其作用不同培养基分为诱导培养基、增殖培养基 和生根培养基。根据其营养水平不同培养基分为基本培养基和 完全培养基。基本培养基就是通常称呼的培养基主要有MS、 White、B5、N6、改良 MS、Heller、Nitsh、Miller、SH 等。 完全培养基就是在基本培养基的基础上根据试验的不同需要 附加一些物质如植物生长调节物质和其他复杂有机附加

9、物等。 组织培养培养基配制选择合适的培养基是植物组织培养成功 的基础。选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑一是基本 培养基二是各种激素的浓度及相对比例。MS培养基适合于大 多数双子叶植物B5和N6培养基适合与许多单子叶植物特别 是N6培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效White培养基 适合于根的培养。根据配方要求用量筒或移液管从每种母 液中分别取出所需的用量放入同一烧杯中并用粗天平称取蔗 糖、琼脂放在一边备用。将中称好的琼脂加蒸馏水 300400毫升加热并不断搅拌直至煮沸溶解呈透明状再停止加 热。将中所取的各种物质包括蔗糖加入煮好的琼脂中再 加水至1000毫升搅拌均匀配成培养基。用1N的氢

10、氧化钠 或盐酸滴入中的培养基里每次只滴几滴滴后搅拌均匀并用 pH试纸测其pH值直到将培养基的pH值调到5.8。将配好 的培养基用漏斗分装到三角瓶或试管中并用棉塞塞紧瓶口瓶 壁写上号码。瓶中培养基的量约为容量的1/4或1/5。培养基 的成分比较复杂为避免配制时忙乱而将一些成分漏掉可以准 备一份配制培养基的成分单将培养基的全部成分和用量填写 清楚。配制时按表列内容顺序按项按量称取就不会出现差错。 组织培养培养基的灭菌与保存培养基配制完毕后应立即灭 菌。培养基通常应在高压蒸汽灭菌锅内在汽相120C条件下灭 菌20分钟。如果没有高压蒸汽灭菌锅也可采用间歇灭菌法进 行灭菌即将培养基煮沸10分钟24小时后

11、再煮沸20分钟如此 连续灭菌三次即可达到完全灭菌的目的。经过灭菌的培养基 应置于10C下保存特别是含有生长调节物质的培养基在45C 低温下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培养基要在配制 后的一周内使用完其它培养基最多也不应超过一个月。在多数 情况下应在消毒后两周内用完。组织培养中几种常用培养基 的配方 化合物 MS 1962 White 1943 N6 1974 B5 1968 Heller 1953 Nitsh 1972 Miller 1967 SH 1972 NH4NO3 1650 1000 KNO3 1900 80 2830 2527.5 1000 2500 NH42SO4 463 1

12、34 NaNO3 600 KCl 65 750 65 CaCl2.2H2O 440 166 150 75 166 200 CaNO32.4H2O 300 347 MgSO4.7H2O 370 720 185 246.5 250 185 35 400 Na2SO4 200 KH2 PO4 170 400 68 300 K2H PO4 300 FeSO4.7H2O 27.8 27.8 27.85 15 Na2.EDTA 37.3 37.3 37.75 20 Na-Fe-EDTA 28 FeCl3.6H2O FeSO4 3 2.5 MnSO4.4H2O7 4.4 10 0.01 25 4.4 ZnS

13、O4.7H2O 8.6 3 1.5 2 1 10 1.5 Zn 螯 合物 0.03 10 NiCl2.6H2O 1.0 CoCl2.6H2O 0.025 CuSO4.5H2O 0.025 AlCl3 MoO3 Na2MoO4.2H2O 0.25 TiO2 1.0 KI 0.83 0.75 0.8 0.75 0.01 10 1.6 5.0 H3BO3 6.2 1.5 1.6 3 1 NaH2 PO4. H2O 16.5 150 125 烟酸 0.5 0.5 0.5 1 5.0 盐酸吡哆素 VB6 0.5 0.1 0.5 1 1.0 5.0 盐酸硫胺素 VB1 0.1 0.1 1 10 0.5 肌

14、醇 100 100 100 100甘氨酸2 3 2培养基配方B5培养基Gamborg等 1968 1 无机物 NaH2PO4H2O 150 mg/LKNO3 3000 mg/LNH42SO4 134mgLMgSO47H2O 500 mg/LNa2 一 EDTAmg/LFeSO47H2O 27.8 mg/LMnSO4-H2O 10 mg/LZnSO47H2O 2mg/LH3BO3 3mg/L Na2MoO2H2O 0.25 m g/LCuSO45H2O 0.025 mg/LCoCl2-6H20 0.025 mg/LKI 10 mg/Lo 2有机物 维生素B1 10mg/L维生素B6 1 mg/L

15、甘氨酸 2.0 mg/L 叶酸 0.5 mg/L 肌醇 100.0mgL 蔗糖 50 gLpH 5.5。B5 培养基是1968年由Gamborg等设计的。它的主要特点是含有 较低的铵盐较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。铵盐可能对不少培养 物的生长有抑制作用但它适合于有些植物如双子叶植物特别 是木本植物的生长。HB培养基Holley Baker1963 1无机盐以 1/2 浓度的 Knop 液为基础 CaNO32.4H2O 1000mg/LKNO3 125 mg/LMgSO47H2O 125mg/LKH2PO4 125 mg/LBerthelots 液 0.5ml/L。Berthelots 液成分组成:

16、MnSO44H2O 20g/LKI 0.5g/LNiCl26H20 0.05 g/LCoCl26H20 0.05g/LZnSO47H20 0.10 g/LCuSO45H2O 0.05g/LBeSO44H2O 0.10 g/LH3BO3 0.05g/L浓硫酸1ml。2有机物 维生素B1理学1 mg/L腺嘌吟 8 mg/LNAA 2 mg/L蔗糖40gL。H培养基1无机盐KNO3 950 mg/LNH4N03 720mgLMgSO47H2O 185 mg/LCaCl22H2O 166 mg/LKH2PO4 68 mg/LNa2 一 EDTAmg/LFeSO47H2O 27.8 mg/LMnSO4-

17、4H2O 25 mg/LZnSO47H2O 10mg/LH3BO3 10mg/L Na2MoO2H2O 0.25 m g/LCuSO45H2O 0.025 mg/L2 有机物 维生素 B1 0.5mg/L 维生素 B6 0.5 mg/L 甘氨酸 2.0 mg/L 叶酸 0.5 mg/L 肌醇100.0mgL烟酸0.5 mg/L生物素0.05 mg/L蔗糖20 gLpH 5.5。Kassanis 培养基 1957 1 无机盐 CaNO32.4H2O 500mg/LKNO3 125 mg/LMgSO47H2O 125mg/LKH2PO4 125 mg/LBerthelots液10滴。2有机物 酪蛋

18、白1 mg/L半胱氨酸 10 mg/L腺嘌吟5 mg/L烟酸1 mg/L维生素B6 1 mg/L泛酸钙 10 mg/L肌醇0.1 mg/L维生素H生物素0.01 mg/L蔗糖20 gL。KC 培养基 Knudson C1964 1 无机盐 KH2PO4 250 mg/LCaNO32.4H2O 1000mg/LNH42SO4 500mg/LMgSO47H2O 250 mg/LFeSO47H2O 25 mg/LMnSO4.4H2O 7.5 mg/L2 有机物 蔗糖 20gL pH 5.05.2。 LS 培养基 RM-64Linsmair SKoog19641 无机盐 NH4N03 l 650mgL

19、KNO3 1900 mg/LCaCl2- 2H2O 440 mg/LMgSO47H2O 370 mg/LKH2PO4 170 mg/LNa2-EDTA 37.3 mg/LFeSO4- 7H2O 27.8 mg/LH3BO3 6.2 mg/L MnSO44H2O 22.3 mg/LZnSO47H2O 8.6 mg/LKI 0.83 mg/LNa2MoO2H2O 0.25 mg/LCuSO4.5H2O 0.025 mg/LCoCl2.6H2O 0.025 mg/L。2 有机 物 维生素 Bl 0.4 mg/L 肌醇 10.0mgL 蔗糖 30gLpH 5.6。FeSO47H2O 5.57gNa2-

20、EDTA 7.45g先溶于1升蒸馏水里然后 按每升培养基含5mg的比例加入培养基中。Miller培养基 1963 1 无机物 NH4N03 l 000mgLKNO3 1000 mg/LCaN0324H2O 347mg/L KH2PO4 300 mg/LKCl 65 mg/LMgSO47H2O 35 mg/LNa 一 Fe 一 EDTA 32 mg/LMnSO44H2O 4.4 mg/LZnSO47H2O 1.5mg/LH3BO3 1.6 mg/L KI 0.8 mg/LCaCl22H2O 150 mg/L。2 有机物 维生素 Bl 0.1 mg/L 维生素 B6 0.1mg/L 叶酸 0.5

21、mg/L 甘氨酸 2.0 mg/L 蔗糖30gLpH 6.0。M11er培养基与MS培养基比较无机元素 用量减少1312微量元素种类减少无肌醇。MS培养基RM62Murashige Skoog 1962 1 无机盐类同 LS 培养基。2 有 机物。它的特点是无机盐的浓度高具有高含量的氮、钾尤其硝 酸盐的用量很大同时还含有一定数量的铵盐这使得它营养丰 富不需要添加更多的有机附加物就能满足植物组织对矿质营 养的要求有加速愈伤组织和培养物生长的作用当培养物久不 转移时仍可维持其生存。故这是目前应用最广泛的一种培养 基。MTmurashge and Tucker 培养基 1 大量元素 NH4N03 1

22、650mgLKNO3 1900 mg/LCaCl22H2O 440 mg/LMgSO47H2O 370 mg/LKH2PO4 170 mg/LNa2 一 EDTA 37.3 mg/LFeSO47H2O 27.8 mg/LH3BO3 6.2 mg/L MnSO44H2Omg/LKI 0.83 mg/LNa2MoO2H2O 0.25 m g/LCuSO45H2O 0.025 mg/LCoC12-6H20 0.025 mg/L。2 有机物 维生素Bl 0.4 mg/L维生素B6 10.0mg/L烟酸5 mg/L甘氨酸 2.0 mg/L肌醇100.0mgL蔗糖50gL。N6培养基北京植物所 黑龙江农业

23、科学院1974 1无机物 KNO3 2800 mg/LNH42SO4 463mgLKH2PO4 400 mg/LMgSO47H2O 185 mg/LCaC122H2O 165 mg/LNa2-EDTA 37.3 mg/LFeSO4- 7H2O 27.8 mg/LMnSO4H2O 4.4 mg/LZnSO47H2O 1.5mg/LH3BO3 1.6mg/L KI 0.8mg/L2 有机物 维生素 B1 1mg/L 维生素 B6 0.5 mg/L叶酸1 mg/L蔗糖20 gLpH 5.8。1974年由我国的朱至清 等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是KNO3 和NH42SO4含量高不含铝

24、。目前在国内已广泛应用于小麦、 水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养。Nielsen1960 培养基 1 无机盐 KNO3 200 mgLCaN0324H2O 800mgL MgSO47H2O 200mg/LKH2PO4 200 mg/LZnSO47H2O 0.2mg/LNiCl26H2O 0.3 mg/LMnCl2H2O 1.8mg/LCuSO45H2O 0.08mg/LH2MoO4- H2O 0.02 mg/LH3BO3 2.8mg/L2有机物 维生素B1 1mg/L烟酸5 mg/L维生素B6 1 mg/L 蔗糖 30 gL。Nitsch Nitsch 1969 培养基 1 无机盐 K

25、NO3 950 mgLNH4N03 720mgLKH2PO4 68 mg/LCaCl22H2O 166 mg/LMgSO47H2O 185mg/LFeSO4-7H2O 27.8mg/LNa2-EDTA 37.3 mg/LMnSO44H2O 25mg/LH3BO3 10 mg/LZnSO47H2O 10mg/LCuSO45H2O0.025mg/LNa2MoO4- 2H2O 0.25 mg/L2 有机物 维生素 H 生物 素 0.05 mg/L 肌醇 100 mg/L 维生素 B1 0.5mg/L 烟酸 5 mg/L 维生素B6 0.5 mg/L甘氨酸2.0 mg/L叶酸5 mg/L蔗糖20 gL

26、。 SH培养基Schenk和Hidebrondt SH培养基是1972年由Schenk 和Hidebrondt设计的。它的主要特点与B5相似不用NH42SO4 改用NH4PO4是矿质盐浓度较高的培养基。在不少单子叶和 双子叶植物上使用效果很好。White培养基White19631无机 盐类 CaNO324H2O 287mg/LKNO3 80mg/LKCl 65 mg/LNaH2PO4H2O 19.1 mg/LMgSO47H2O 738mg/LNa2SO4- 10H2O 453 mg/LMnSO44H2O 6.6 mg/LH3BO3 1.5 mg/LZnSO4.7H2O 2.7 mg/LKI 0

27、.75 mg/L2 有机物 甘氨酸 3.0 mg/L 烟酸 0.5 mg/L 维生素 B6 0.1 mg/L 维生素 B1 0.1 mg/L柠檬酸2.0 mg/L蔗糖20g/LpH 5.7。又称WH培养基是 1943年White设计的1963年做了改良。其特点是无机盐浓度 较低。它的使用也很广泛无论是生根培养还是胚胎培养或一般 组织培养都有很好的效果。White培养基改良White1963 1无 机盐 KNO3 80 mg/LCaN032-4H2O 300mgLMgSO47H2O 720 mg/LNa2SO4 200 mg/LKCl 65 mg/L Na H2PO4- 5H2O 16.5 mg

28、/LFeSO43 2.5 mg/LMnSO44H2O 7 mg/LZnSO47H2O 3mg/LH3BO3 1.5mg/L CuSO45H2O 0.001 mg/LMoO3 3 mg/Lo 2有机物 维生素B1 0.1mg/L维生素B6 0.1 mg/L甘氨 酸 3.0 mg/L 肌醇 100.0mgL 烟酸 0.3 mg/L 蔗糖 20 gLpH 5.0。 花肥培养基 Kano1963Kyoto so1ution 花肥 3g/LKH2PO4 250 mg/LCaNO32.4H2O 1000mg/LMgSO4- 7H2O 250 mg/LNH42SO4 2mg/L蔗糖20gL pH 5.0。木

29、本植物用培养基 WPMWoody Plant medium 1 无机盐 NH4N03 400mgLCaNO32.4H2O 556mg/LK2SO4 990 mg/LCaCl2- 2H2O 96 mg/L KH2PO4 170 mg/LNa2MoO4- 2H2O 0.25 mg/LMgSO47H2O 370 mg/LMnSO4H2O22.4mg/LZnSO4-7H2O 8.6mg/LCuSO4- 5H2O 0.25mg/LFeSO47H2O 27.8 mg/LNa2-EDTA 37.3 mg/L o 2 有机 物 肌醇100 mg/L维生素B1 1.0mg/L烟酸0.5 mg/L维生素B6 0.

30、5 mg/L 甘氨酸 2.0 mg/L 蔗糖 20 gL 琼脂 6gLpH 5.2。MS培养基的配制1、MS大量元素母液的配制一般将大量元 素分别配制成10倍的母液使用时再分别稀释10倍。依次分别 称取 NH4NO3 16.5gKNO3 19.0g KH2PO4 1.70gMgSO47H2O 3.7gCaCl22H2O 4.4g共配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中存 放于冰箱中。2、MS微量元素母液的配制一般将微量元素 配制成100倍母液。依次称取KI 0.083gNa2MoO42H2O 0.025gH3BO3 0.62gCuSO45H2O 0.0025gMnSO4H2O 1.69gCoCl26H2O 0.0025gZnSO