血液学检验实验指导

1、血液病检验技术实验指导实验一、活化凝血时间测定【实验原理】同试管法CT测定。试验中加入白陶土 -脑磷脂的悬液以充分激活因子刈和XI,并为凝血反应提供丰富的催化表面，故称为活化凝血时间（ACT）;还可以避免因接触激活阶段的不同结果带来的影响，从而提高了本试验的敏感性和重复性。【 试剂 】脑磷脂的制备脑磷脂是将兔脑粉中的组织凝血活酶除去参与外源凝血途径的蛋白部分后所得的磷脂，故又称部分凝血活酶。取干燥兔脑粉 1.2g 加 25ml 丙酮，放置 2h 后过滤，将此兔脑粉加氯仿25ml ，连续震荡2h ，以滤纸过滤，滤液蒸发后为淡黄色蜡状物，刮入玻璃研钵中，加12ml 生理盐水研磨成均匀乳剂，以每安瓶

2、 0.25ml 分装。 4%白掏土悬液白陶土 2g 加入 50ml 生理盐水中，室温保存，用前摇动。 4%白陶土- 脑磷脂悬液将脑磷脂用巴比妥缓冲液作 1： 50 稀释后，再加等量4%白陶土悬液混合而成。4C可保存3天，用时充分混合。巴比妥缓冲液 巴比妥钠 11.75g 、 NaCl14.67g 、 0.1mol/L 的 HCl430ml ，加蒸馏水 至2000m1。此缓冲液pH应为7.3,否则影响试验稳定性。【 操作方法 】1在含4%白陶土- 脑磷脂悬液0.2m1 的试管中注入受检全血0.5 ，轻轻混匀。2.其余操作同试管法CT测定。【参考值】1.70 0.76 （1.142.05）min

3、。【 临床意义 】1.同试管法CT测定，但较其敏感，重复性也较好，可检出因子皿： C小于45%勺亚临床型血友病。2是监测体外循环肝素用量的良好指标之一。实验二、血浆游离血红蛋白测定 （邻一甲联苯胺法）实验原理 】 邻一甲联苯胺在酸性溶液中和过氧化氢与血红蛋白共同作用生成氧化型联苯胺，产生绿色-蓝色-紫色，其颜色的深浅与血浆游离血红蛋白的含量呈正相关。试剂 】 2g/L 邻一甲联苯胺溶液称取邻一甲联苯胺0.2g ，溶于冰醋酸60m1 ，加蒸馏水至100m1, 置于棕色瓶内于冰箱保存，色变暗应重配。 1%过氧化氢溶液用 30%过氧化氢原液新鲜配制。 10%冰醋酸溶液。取10m1 冰醋酸，加蒸馏水至

4、100m1。4血红蛋白应用标准液将血红蛋白贮存液用生理盐水稀释成10mg/100m1 备用。5抗凝试管取 0.2m1 100U/m1 肝素于试管内，在80以下烘干，每管可抗凝2m1 全血。【 操作方法 】将抗凝全血分离血浆。取试管3 支，分别标明测定、标准和空白，分别加入血浆、应用标准液，再向各管中分别加入邻一甲联苯胺溶液及1%过氧化氢溶液各1.0ml ，充分混匀，放置10min。.于上述3支试管内分别加入 10%K醋酸溶液10ml混匀，用435nm波长比色，以空白 调“ 0”，读各管吸光度。计算：测定管吸光度 游离 Hb( mg/L) = X 100标准管吸光度【 质量控制 】一切容器均应避

5、免血红蛋白污染，标本勿溶血，否则可引起假阳性。过氧化氢溶液浓度要准，新鲜配制。联苯胺醋酸的含水量不能低于 15%和超过 30%，否则均可引起吸光度降低。标准液的加入量一定要准。参考区间】1科m时才能从镜下见到。急性血管内溶血时， 虽可有血红蛋白血症和血红蛋白尿，但还不能形成足够大的含铁血黄素颗粒，需在数日后才阳性，并可持续数周。实验五、红细胞渗透脆性试验【实验原理】 红细胞在低渗盐水中，水分透过细胞膜内渗，使之膨胀破坏而溶血。本 试验是测定红细胞对不同浓度低渗盐水的抵抗力，以鉴别某些与红细胞形态有关的溶血性贫血。红细胞对低渗盐水的抵抗力与其表面积和体积的比值有关，厚度越大，该比值越小，即渗透脆

6、性越大；反之，脆性越小。以浓度为横坐标，溶血度为纵坐标绘制曲线，找出50%容血对应的盐浓度，即红细胞中间脆性（MCF,后者较敏感。【试剂】171mmol/L NaCl（10g/L）溶液：将100c烘干的分析纯氯化钠1.0g置于100ml容量瓶中加少量蒸储水溶解后，再加蒸储水至刻度处。【操作方法】 取12支试管，按5-1分别加入10g/L NaCl和蒸储水。表5-1红细胞渗透脆性试验操作表（国际单位制）试管号 123456789 1011 12 10g/L NaCl（ml） 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6蒸储水（ml）08 0.9

7、1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9NaCl SI g/L 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4制 mmol/L 1 6.3 109.4 102.6 95.8 88.9 82.1 75.2 68.4 61.6 54.7 47.9 41.0浓度 旧制（%0.68 0.64 0.60 0.56 0.52 0.48 0.44 0.40 0.36 0.32 0.28 0.24然后各管立即加入新鲜静脉血各 1滴，并从低浓度到高浓度逐管颠倒混匀，室温静置【结果判断】静置室温2h,观察结果，从高浓度开始，上清

8、液呈透明红色而管底有红细胞者为开始溶血管；溶液透明红色，管底完全无红细胞者为完全溶血管。【质量控制】. NaCl溶液浓度要准确，故应干燥精称。.注射器和试管必须清洁干燥。.应用新鲜静脉血，忌用抗凝血，必要时可用去纤维蛋白血或肝素抗凝血。.结果不易判断时可离心后观察。.黄疸病人开始溶血不易观察，严重贫血红细胞太少时均可用等渗盐水将红细胞 洗涤后再配成50斌细胞悬液进行试验。.每次试验均应做正常对照，与被检血相差0.4g/L ,即有临床意义。【参考区间】开始溶血：71.878.6mmol/L (4.24.6g/L )完全溶血：47.8 54.7mmol/L (2.8 3.2g/L )中间脆性：68

9、.576.2mmol/L【临床意义】患者比正常对照高 6.8mmol/L或中间脆性76.2mmol/L有诊断价值。脆性增加：见于遗传性球形红细胞增多症，也见于自身免疫性溶血性贫血伴球形红细胞增多者。脆性降低：见于缺铁性贫血，各型地中海贫血，HbC D、E病，脾切除术后及阻塞性黄疸等。实验六、酸溶血试验(HaM s test )【实验原理】 正常人红细胞在酸化(pH6.66.8)的自身新鲜血清中(内含补体和备 解素)，经37c孵育1h不溶血。而阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH患者，因红细胞膜缺陷,对补体溶血效应敏感性增强，则发生溶血。【试剂】0.2mol/L HCl 。8.5g/L NaCl 溶液

10、。【操作方法】.配制50%工细胞悬液取10ml离心管2支，标明患者、对照，均加入 8.5g/L NaCl溶液56ml,分别加入患者和对照者未梢血十几滴，混匀，离心后弃去上清，如此重复洗 涤红细胞2次，最后配成50%3C细胞悬液备用。.分离正常对照血清取与患者同型或 AB型血35ml,待自然凝固后分离血清。.按表6-1操作。表6-1酸溶血试验操作表管别正常对照血清50% 红细胞 0.2mol/L悬液(ml)HCl(ml)孵育对照试验管0.50.0250.0537C对照管0.50.0250.05水溶Ih【结果判断】 试验管溶血，对照管不溶血为阳性；试验管和对照管均不溶血为阴性。【 质量控制 】.血

11、清酸化后试管必须塞紧，否则CO逸出使血清酸度降低。.抗凝剂中的Na、K可影响pH,故不宜用抗凝血，但可用脱纤维血。.为保证补体充足，最好用混合血清，但正常对照红细胞必须用O型血。4多次输血者，可因血中异常红细胞相对减少，本试验可呈弱阳性或阴性。【临床意义】正常人为阴性。阳性见于PNH遗传性球形红细胞增多症及自身免疫性溶血性贫血也可呈阳性。 主要与红细胞球形化有关。 血清加热破坏补体， 若本试验转为阴性则更支持PNH。实验七、蔗糖溶血试验实验原理 】低离子强度的等渗蔗糖溶液，在温育条件下可促进补体与红细胞膜的结合，使红细胞对补体损伤的敏感性增强而导致溶血。试剂 】 92.4g/L 蔗糖溶液。操作

12、方法 】取新鲜抗凝血（枸橼酸盐或草酸盐抗凝） 0.5ml 加入 4.5ml 蔗糖溶液中，混匀，置37孵育箱内30min 后离心，上清液呈红色为阳性，无色为阴性。【 质量控制 】注射器、试管应清洁干燥，避免溶血。无蔗糖可用10%葡萄糖代替。【临床意义】正常人为阴性。阳性见于 PNH本试验较Ham试验敏感，是PNH断的筛选试验，但特异性较差。再障-PNH 综合征、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血也可呈阳性。本试验最好与 Ham试验同时操作，用正常血清代替患者血清做试验，可除外患者补体异常所致的假阴性。实验八、热溶血试验【 实验原理 】利用患者的红细胞和自身新鲜血清（含补体） ，经37孵育后，

13、由于葡萄糖分解产酸，使有内在缺陷的红细胞溶解而溶血。【 操作方法 】 抽取静脉血1-2ml ， 取下针头， 沿管壁缓缓注入小试管内， 避免产生气泡，置37c孵育箱保温24h,取出后离心。上清呈红色（溶血）为阳性。【 质量控制 】注射器要干燥，小试管要清洁，操作过程中避免溶血，防止出现假阳性。孵育 24h 血块未回缩者，可用小玻棒沿管壁轻轻分离，然后离心，观察结果。【 临床意义 】 正常人为阴性。 阳性见于PNH， 其他溶血性贫血亦呈阳性， 但阳性率比PNH为低。本试验用于PNH的筛选。实验九、高铁血红蛋白还原试验一、比色定量法【实验原理】6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD在戊糖旁路中使 6-磷酸葡

14、萄糖转变为 6- 磷酸葡萄糖酸，同时彳t化氧化型辅酶II （NADP形成还原型辅酶II （NADPH,再使氧化型谷胱甘肽（GSSG形成还原型谷胱甘肽（GSH。NADP层高铁血红蛋白还原酶的辅酶，在递 氢体美兰和高铁血红蛋白还原酶的作用下，使暗褐色的高铁血红蛋白还原为红色的血红蛋 白。当红细胞内 G6P论量不足或缺乏时，高铁血红蛋白还原速度减慢，甚至不能还原。【 试剂 】12.5g/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液亚硝酸钠1.25g,葡萄糖5g,加蒸储水至100ml。置棕色瓶内4 C下可保存1个月。0.0004mol/L美蓝溶液 美蓝15mg放乳钵中，加少量蒸储水研磨后过滤，再加蒸储 水至100ml。室温

15、可保存12个月。0.02mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4） 取 N&HPO229.5mg, KH2PO52.2mg,力口蒸储水 至 100ml。【 操作方法 】1 静脉采血 1.5-2.0ml ， 加入含有 38g/L 枸橼酸钠抗凝剂的小瓶内 （血： 抗凝剂 =9:1 ） ， 再加葡萄糖20mg 摇匀。2取血液1.0ml ，加亚硝酸钠 -葡萄糖溶液和美蓝溶液各0.05ml ，颠倒混合 12次，使与空气中的氧充分接触。加塞，370.5C水浴（或孵箱）保温 3h。3.取出后摇匀，取0.1ml加于10ml磷酸盐缓冲?中溶解，2min后于波长635nm处（或 红色滤光板）比色，用蒸馏水作空白，测其

16、吸光度（A） 。4另取原血液0.1ml ，按上法加缓冲液溶解后比色，测其吸光度（B） 。再于此液中加亚硝酸钠-葡萄糖液1 滴，摇匀， 5min 后比色，测其吸光度（S） 。【 计算 】A-B高铁血红蛋白还原率 =（1） X 100S-B【 参考区间】高铁血红蛋白还原率75%（比色法）【 质量控制】1红细胞比积低于30%时，高铁血红蛋白还原率显著降低，必须调整红细胞与血浆的比例。2.本试验抗凝剂若用 ACD呆养液时，该保养液与血液之比为0.15:1 。该抗凝血可保存1 周。因草酸盐具有还原性，不宜使用。3标本不应有凝块或溶血，以免影响测定结果。4测定吸光度时，分光光度计的波长应准确。一般要求S

17、比 B 大 8 倍以上。【 临床意义】本试验用于 G6PD|fe乏症的过筛检查，蚕豆病和伯氨唾咻型药物溶血性贫血患者，由于G6PD|fe陷（隐性遗传），高铁血红蛋白还原率明显下降。杂合子型多在74%- 31%之间，纯合子型常在30%以下。二、细胞化学法【 实验原理 】 红细胞内血红蛋白可被亚硝酸钠氧化为高铁血红蛋白，后者可经美兰还原为血红蛋白； G6PD 缺乏时则高铁血红蛋白不被还原。加入氰化物后形成氰化高铁血红蛋白，易被过氧化氢洗脱， 染色后形成空影红细胞。 正常的红细胞， 氧合血红蛋白的过氧化酶活性，不被氰化物抑制，阻止了枸椽酸盐的洗脱作用，保证红细胞的正常形态。【 试剂 】1反应试剂取

18、0.0004mol/L 美蓝溶液 1ml， 12.5g/L 亚硝酸钠 -葡萄糖溶液0.5ml ，生理盐水 8.5ml ，混匀。此液于冰箱中可放置1 周。2 0.4mol/L 氰化钠（或氰化钾） 。3洗脱液95% 酒精 40.0ml ， 0.2mol/L 枸椽酸 8.0ml ， 30% H2 O22.5ml ，混匀。4固定液甲醇5染液5g/L 苏木素液， 4g/L 伊红液。【 操作方法 】.取ACD抗凝血0.05ml ,置于预先盛有 0.05ml反应试剂之小试管中，摇匀，放 37C 水浴（或孵箱）中保存4h 。.取出后用滴管轻轻吸去上清液，于剩下的红细胞中加入0.4mol/L氧化钠0.005ml

19、 （细玻棒蘸起一小滴） ，摇匀。. 5min后加入1滴患者血浆（或AB型血浆），用滴管混匀，取出1滴作薄涂片，待干。.将玻片放入盛有洗脱液的染色缸内，上下移动1min,再静置于液中24min,取出后甲醇固定半分钟，水冲洗，待干。.用苏木素染23min,水冲洗，再以伊红染14min水冲洗，待干。6在高倍镜下观察，计数1000 个红细胞（涂片四角及中央各数200 个） ，算出 G6PD缺乏红细胞（空影红细胞）的百分率。【 质量控制 】 本法受洗脱液H2O2 浓度的影响，因H2O2 易分解，不易保存所需浓度，因此使用过程中宜随时补充少量H2O2。 补充的量依使用次数的多少、 放置时间和室温高低而定，

20、需凭经验掌握，最好用阴性、阳性样本对比试验来确定。【临床意义】正常人空影红细胞0.4%, G6PDT重缺乏者88.0%,杂合子0.4%88%此法对于杂合子的检出敏感性较高，但作为筛选法则过于繁琐。实验十、变性球蛋白小体检查【实验原理】氧化物质可使 G6PW乏患者的红细胞中积蓄多量的HQ等氧化剂，使 血红蛋白氧化变性。 而与某些碱性染料 （如煌焦油蓝） 或结晶紫孵育后形成蓝黑色或紫黑色 颗粒定位于红细胞内。【试剂】 用0.73%NaCl溶液配制成1%勺结晶紫（龙胆紫）溶液。【 操作方法 】 滴 1 滴试剂于载玻片上，用玻棒或竹签蘸一点患者血液于其上，混匀，加盖玻片，染510min后在高倍镜下观察

21、。计算 500个红细胞中含变性珠蛋白小体红细胞 的百分率。含变性珠蛋白小体的红细胞是在红细胞中出现多个紫黑色、 或细或粗、 形状不规则的颗 粒，位于细胞的边缘或中央，血红蛋白或仍均匀分布，或完全缺如。【 参考区间 】 正常人无变性珠蛋白小体，或偶见几个（ 0.01 ）细小者。【临床意义】阳性见于G6PD|fe乏症,患者（3% 82%,随着溶血的恢复逐渐减少或消失。 还见于不稳定血红蛋白病， 呈单一的圆形或卵圆形粗大颗粒， 附着于红细胞膜或突出于 其外。另外，硝基苯、苯胺、苯肼等化学物质中毒者也可出现变性珠蛋白小体。实验十一、葡萄糖6- 磷酸脱氢酶荧光斑点试验【实验原理】在葡萄糖-6-磷酸（G6

22、P）和NADW在下，G6PDI归使NADP原成NADPH后者在紫外线照射下可发出荧光。【 试剂 】混合剂的成分与配方如下：0.1mol/L G6P1ml7.5mmol/L NADP1ml0.7mol/L Tris-HCl（pH7.8）3ml8mmol/L 氧化型谷胱甘肽1ml10g/L 皂素 2ml蒸馏水 2ml此混合试剂分装，置-20 C保存，可稳定数月。【 操作方法 】1.取末梢血或抗凝血510小，加入含100“ 反应试剂的小试管中。亦可取血滴于滤纸上 , 干后取直径约为1cm 的血迹剪碎, 置含反应试剂的小试管中洗脱。2,放 37C孵育 10min。3.取约10“溶血液滴于新华滤纸上，晾

23、干后立即用冷风吹干，在长波紫外线下观察 结果。【 结果观察 】 G6PD 正常者可见明亮荧光，严重缺乏者无荧光，杂合子介于两者之间。【 质量控制 】.本法是直接测定 NADPH勺量，特异性较好。.每次或每批要有（G6PD正常和缺陷者的标本作对照。.取血量以510“ 为宜，正常者宜偏少，贫血者可偏多。4干血滤纸片存在其酶活性可损失，宜同时作正常对照血样品。.加入GSSG为了提高敏感f因有残余G6P前性的标本（如杂合子），可产生少量NADPH若有足量的 GSS的在，则通过谷胱甘肽还原酶的作用，再将其氧化为 NADP这样 患者和正常红细胞即可显示明显差别。不使用GSS刖可，效果稍差，可将 G6P-N

24、2和NADP浓度减半，血样本用生理盐水稀释至1/4 ，孵育时间缩至3min ，可减弱残余酶活性的影响。【临床意义】正常人有很强的荧光。G6PD缺乏者荧光很弱或无荧光；杂合子型或某些G6PD异体者可有轻度或中度荧光，本试验适用于大批量筛选，但不利于杂合子型的检 出。实验十二、硝基四氮唑蓝试验硝基四氮口坐蓝试验 （nitroblue-tetrazoliumtest ）有定性试验和 G6P前性定量测定两 种。一、定性纸片法【实验原理】NADPH通过吩嗪二甲酯硫酸盐（M-PMS的递氢作用，使淡黄色的硝基 四氮吵蓝（NBT）,还原成紫色的甲。G6P呦乏时由于 NADPHfc成不足，不显紫色。【 试剂 】

25、0.25mol/L Tris-HCl 缓冲液（ pH7.4） 称取三羟甲基氨基甲烷（ Tris ） 7.6g ，溶 于蒸储水约100ml中，先加入1mol/HCl 60ml,然后用pH计调整pH至7.4 ,再加蒸储水200ml。 在4 C可保存数月。0.6g/L M-PMS M-PMS 6mg 加蒸馏水 10ml 溶解，加入 0.01mol/L HCl1 小滴调整 pH 至 3.8 左右。于棕色瓶内，暗处存放，可保存2 周以上。如试剂由黄变绿，应重新配制。3g/L NBTNBT15mg力口蒸储水5ml,在水浴中加热至 80C左右溶解，过滤。用棕色瓶 盛装，可保存2 周以上。6.25mmol/L

26、 G6P-Na 称取 G6P-Na10mg 用 Tris-HCl 缓冲液 4ml 溶解。放 0C可保 存 1 个月以上。6.25mmol/L NADP 称取 NADP 10mg如用含 70%勺制品则称 14mg）,加 Tris-HCl 缓冲 液2ml溶解。放0C可保存数月。0.12mol/L MgCl 2称取分析纯 MgC2 6屋。2.10g溶于蒸储水至 100ml。M才为G6PD 的激活剂。7反应试剂M-PMS 0.1ml ， NBT 0.5ml ， G6P-Na2 0.4ml ， NADP 0.1ml ， MgCl2 0.1ml ， 混合，当天配制。8.对照试剂用等量Tris-HCl代替G

27、6P-N0和NADP余同反应试剂。【 操作方法 】1.取末梢血1滴，滴于干净滤纸上，血迹直径1.0cm左右，自然晾干（密封后4C保存，酶活性可维持 57天）2用打孔机打出一小圆血迹红片（直径约5mm） ，置于反应板的小孔内，加入蒸馏水1滴摇匀，静置5min ，待红细胞完全溶解。用6 号半至 7 号注射针头吸取反应试剂，在每个放置血纸片的小孔中央加入 1 滴，轻轻混匀。加盖，置 37C水浴箱中温育1030min。以对照试剂取代反应试剂作对照。结果观察】正常酶活性者纸片变为紫蓝色； 酶严重缺乏者仍为红色； 杂合子为淡紫红色。观察时与对照孔比较看颜色的区别。质量控制】.血迹纸片放置时间长短对结果观察

28、为重要。如为新鲜血纸片，37 C 510min能看到结果，若放置数小时，则 2030min才现结果，故应在同一批标本相互比较。.缓冲液的pH要准确。3遇到酶缺乏或可疑标本，应用定量法来确证。二、葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶活性定量测定【实验原理】与定性纸片法相同。NADPHfe成的量与甲生成的量在一定范围内呈线性关系，在分光光计波长650nm测定甲的吸光度，可反映NADPHfe成的量，用以代表G6PD活性。【 试剂 】1反应试剂对照试剂及其各种组成液均与定性纸片法相同。. 7mol/L尿素 称取分析纯尿素 210g,溶于蒸储水至 500ml （可微热溶解），室温保 存。氰化高铁血红蛋白测定法试剂（

29、 Drabkin ） NaHCO31.0g,K 3Fe（CN） 60.2g,KCN0.05g ， 加蒸馏水至1000ml ，置棕色瓶内暗处保存。【 操作方法 】.取抗凝血（肝素或EDTAB需在12h内测定，ACDB在04C可保存至3天）0.1ml , 用生理盐水洗涤红细胞3 次（ 2000r/min ） ，吸去上清液及白色层（为血小板及白细胞，如不吸去则结果增高） 。.红细胞悬液内加入蒸储水34ml,（一般视其颜色深浅而定），使其溶血，混匀，静置 10min 。3取 0.4ml 溶血液，加入 4.0ml Drabkin 试剂，放置15min ，用 Drabkin 试剂作空白， 光径1cm,于5

30、40nm波长读取吸光度（H）。.另取2只试管，每管准确加入溶血液0.1ml于管底。.于第一管中加对照试剂 0.1ml ,摇匀，放入37+0.5 C水浴中保温，并立即用秒表记 录时间。于第二管中加入反应试剂0.1ml ,摇匀，待秒表行至 30s时，放入水浴中保温。.准确30min取出第一管，立即加入 7mol/L尿素2.5ml ,以终止反应。30s钟后取出 第二管加入尿素 2.5ml。.用分光光度计比色，光径1cm,波长650nmi以第一管为空白，测定第二管吸光度（S）。【计算】 以每克Hb每分钟吸光度变化值作为单位，即NBT单位（U） =AA/min/Hb（g）。0.1ml溶血液中含Hb（g）

31、 64458 4.4 11=0.1 x HX XXX440.4 1000 1000=HX 0.00161S 1 SG6PD（U）= X =- X 20.7H X0.00161 30 H【参考区间】：6.720.5U中间缺乏值（杂合子）：1.76.6U。严重缺乏值：低于 1.6U。【质量控制】.试剂配制必须严格按照操作规程。反应试剂配制后放置24h,显色反应明显降低。.标本如不能及时测定，应保存于冰箱（04）。洗涤后的红细胞，特别是溶血液不能久置（4不能超过4h）。.缓冲液的pH,保温温度、时间及加入溶血液量都必须十分准确。.尿素的作用是终止酶促反应，并保持色泽澄明度。加尿素后应尽快比色（不超过

32、1h）。.由于甲溶解度低，溶血浓度不宜过高，一般以吸光度0.3000.400为宜。.由于使用的NBT不同，各实验室最好建立自己的参考值。. Hb测定必须准确，应用 HICN标准液校正所有仪器，测得的H值应先乘以校正系数然后带入计算公式。实验十三、丙酮酸激酶（PK0荧光斑点试验【实验原理】 由PK产生的丙酮酸作用于 LDH,使其转变为乳酸，同时NADH专变为NAD。 在长波紫外线照射下 NADHt荧光，NAD无荧光，故反应后荧光逐渐消失。【试剂】0.15mol/L PEP 249mgPEP 溶于蒸储水 5ml 中，0.2mol/L NaOH 调整 pH 至 78。0.03mol/L ADP AD

33、P二钠盐 150mg溶于蒸储水 5ml 中，用 0.2mol/L NaOlH整 pH7 8。0.08mol/L MgSO 4 MgSO4 7H2O 98mg溶于蒸储水 5ml 中。0.25mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4） 取 KH2PC4 3.40g,K 2HPO 4.35g ,分别配成 100ml。然后取KHPC溶液19.2ml , K2HPC溶液80.8ml混合，校准pH7.4。反应试剂 PEP 30 “，ADP 100“，MgSO 100 “，磷酸盐缓冲液50科l ,蒸储水720“，混合。在4C保存1周，临用时加NADHFF粉1mg混匀。【 操作方法 】.取抗凝血（肝素、EDTA

34、ACD经1000r/min离心沉淀5min ,将血浆及白细胞小心吸弃。2用冷生理盐水洗红细胞3 次，最后用冷生理盐水配成20%红细胞悬液。.于小试管中加 200膜反应试剂，再加红细胞悬液 20”，混匀，置37C水浴中反 应。4在反应开始、10、 20、 25 、 30 和 60min 各取此液，点在新华滤纸上，晾至完全干燥，在长波紫外线下观察荧光点。【结果观察】PK活性正常者荧光在 20min消失，中间缺乏者（杂合子）荧光在 25 60min 消失，严重缺乏者（纯合子）荧光60min 不消失。【 质量控制 】1每次试验都应用正常人血液作阴性对照。.白细胞和血小板中含有与红细胞中类型不同而活性很

35、高的PK同工酶，而且在 PK缺乏症其活性也不降低，故血液离心后应尽量除去白细胞和血小板。3本法不用皂素而用低渗反应试剂来破坏红细胞，这样可使由残存白细胞和血小板中释放出的酶量很少，不影响试验的可靠性。临床意义 】正常人本试验为阴性， 即荧光逐渐消失。 丙酮酸激酶缺乏症患者呈阳性（荧光不消失） ，可用于丙酮酸激酶缺乏症的过筛试验。实验十四、丙酮酸激酶活力测定实验原理 】在ADP存在下，丙酮酸激酶（PR使磷酸烯醇式丙酮酸（PEB转变为丙酮酸，后者通 过乳酸脱氢酶（LDH）作用转变为乳酸，同时 NADH专变为NADo NADHB 340nm处有吸收峰， 故可根据吸光度的改变来推算 PK的活力。试剂

36、】0.3mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.4）:取 Tris 3.63g,KCl 1.679g,MgSO4 7HO0.592g 溶于90ml蒸储水中，用 0.1mol/L HCl调节至pH7.4,加水至100ml,每管5ml分装，于-20 C保存。AD蹄液：取ADP二钠盐6.5mg,溶于1ml蒸储水中，宜少量配制，置4C备用。5mmol/L NADH溶液：取 NADH 3.5mg溶于1ml蒸储水中，宜少量配制，1C备用。LDH溶液：自兔肌肉提取之悬液，活力单位为600U/ml。30mmol/L PEP 溶液：称取磷酸烯醇式丙酮酸铵盐14.43mg ，溶于 1ml 蒸馏水中，用前宜少

37、量配制，置 4C备用。【 操作方法 】1.取肝素或EDTAa凝血3.5ml ,力口 1ml 60g/L右旋糖酊，室温（20 C）静置30min后 吸弃上层含有白细胞的血浆。2再加 1ml 右旋糖酐，并用生理盐水补足 4.5ml ，重复 6 次，然后把几乎无白细胞的红细胞用生理盐水洗2 次。.取洗过的红细胞经压积为80390%勺悬液，吸0.1ml ,加入4ml蒸储水中，使其溶血。溶血液置冰浴中备用。.在10mmt径的比色杯中依次加入Tris缓冲液1.00ml , H2O1.48ml , NADH?夜0.10ml ,ADP夜 0.10ml,LDH 溶液 0.02ml,PEP 溶液 0.20ml ,

38、总容量 2.90ml,37。保温。.分光光度计340nm, 37C在测定管加入0.1ml溶血液后，立即计时，用蒸储水调零， 每分钟测吸光度1 次，共测 15min 。.根据读数记录，在线性反应期算出平均吸光度下降值AA/min ,再按下式计算。【 计算 】PK活性（U/ml红细胞） TOC o 1-5 h z A/min 4.1 3.01=XXX6.220.1 0.1 PCV（6.22=NADH 的毫摩尔吸光系数）【 参考区间】1.2 2.2U/ml 红细胞（37 C）【 质量控制】.血液标本需新鲜，若以4C贮存血进行测定，则须有同样贮存血的正常对照。.血细胞含有相当高PK活性，即使在红细胞P

39、K缺乏症亦是如此。故必须尽可能从红细胞 悬 液中除去。【 临床意义 】 红细胞丙酮酸激酶缺乏症为常见的先天性非球形细胞溶血性贫血， 属常染色体隐性遗传。纯合子时， PK 活性显著降低；杂合子时，无贫血症状，但酶活性降低，介于正常人和纯合子之间。实验十五、自身溶血试验及纠正试验【 实验原理 】 将肝素抗凝血置37孵育48h， 观察自然溶血程度， 并结合加葡萄糖及ATP纠正试验，协助遗传性球形红细胞增多症的诊断，并鉴定其类型。【 试剂 】10% 葡萄糖（无菌） 。等渗盐水（无菌） 。0.4mol/L ATP 生理盐水无菌液。0.4g/L 氨水（浓氨水 0.16ml加水至100ml）或HiCN转化液

40、。【操作方法】.取小试管4支，分别加1g/L肝素0.02ml, 3.624kg （8磅）15min高压灭菌，烘干。.取静脉血4ml,以无菌手续按表15-1加入各管，混合抗凝，然后依次操作。.以冷藏血离心后的血浆 0.2ml加0.4g/L氨水或车t化液4.8ml为空白对照管，在540nm 处测各管吸光度 A值。.计算各管溶血率（相当于空白对照管100%勺比值）。测定管AX （ 1-红细胞压积）测定管溶血率二溶血对照管AX 4【质量控制】 操作过程严格无菌。【临床意义】 正常人血液无菌时孵育48h后溶血率很低，一般4.0%。加葡萄糖或ATP后，溶血率更低（0.6%）,而各类溶血性贫血溶血率不同程度

41、增强。遗传性球形红细胞增多症自身溶血早而明显，能被葡萄糖纠正。遗传性非球形红细胞溶血性贫血，自身溶血增加， 其中1型因6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性降低，能被葡萄糖和ATP纠正；n型表15-1自身溶血试验操作表123溶血对照肝素抗凝血（ml）1.01.0 1.01.010喻萄糖（ml）0.050.4mol/L ATP（ml）0.05一9g/L NaCl（ml）0.05一37 C孵育48小时测红细胞压积4C冷藏孵育血浆（ml）0.20.20.20.4g/L氨水或4.84.84.89.9HiCN转化液（ml）全血0.1系丙酮酸激酶缺乏，溶血不能被葡萄糖纠正，但能被ATP纠正。PNH自身免疫性溶血性贫血、

42、药物性溶血等均不能被葡萄糖纠正。大部分不稳定血红蛋白病例自身溶血率轻度增加， 加葡萄糖1型可以纠正，n型则不能纠正。实验十六、血红蛋白电泳【实验原理】 利用各种血红蛋白（包括正常或异常Hb）珠蛋白及等电点不同，在一定电场和pH缓冲液中电泳方向和速度亦不相同，Hb与等电点缓冲液的 pH差别越大，Hb电泳速度越快；相反则电泳速度越慢。采用不同的缓冲液，支持介质和电泳仪其分辨率不同。以 此来判断异常Hb的性质，为诊断异常 Hb病提供依据。在电泳中，因所用支持物不同，而有纸上电泳、琼脂电泳、淀粉胶电泳、醋酸纤维素薄 膜电泳等。电泳胶分辨率较高，但制板较费时且不方便，琼脂凝胶电泳应用于某些异常Hb的分辨

43、。醋酸纤维素膜电泳方法简便，省时，易于洗脱定量，对异常Hb分辨率较好，适于一般试验室作为异常Hb 的筛选试验。 在缓冲液选择上，多以碱性（ pH8.5 或 9.1 ）缓冲液浸泡薄膜，用硼酸盐缓冲液进行电泳筛选。必要时再用pH66.2缓冲液电泳鉴别。【 试剂 】 0.26mol/L Tris 缓冲液（ pH9.1 ） （用于阳极） 三羟甲基氨基甲烷25.2g,EDTA2.5g或 EDTA-Na22.83g ，硼酸1.9g ，加蒸馏水至1000ml。 巴比妥缓冲液（ pH8.6） （阴极） 巴比妥钠 5.15g, 巴比妥 0.92g ， 加蒸馏水至1000ml。.醋酸纤维素薄膜浸泡液、两种缓冲液等

44、量混合。.氨基黑10B染色液氨基黑10B 1g,磺基水杨酸10g,冰醋酸20ml,加蒸储水至400ml。.漂洗液 乙醇45ml,冰醋酸5ml,蒸储水50ml混合。6透明液冰醋酸 25ml ，无水乙醇75ml 。 0.4mol/L NaOH 。【Hb液的制备】将抗凝血离心去血浆，加生理盐水洗涤3次。每ml红细胞加1.4ml蒸馏水和 0.4ml 四氯化碳， 强烈振摇 5min ， 离心后取上清液于4冰箱保存备用 （不适用于不稳定血红蛋白检查） 。【 操作方法 】 电泳槽内阳极注入 pH9.1 的 Tris 缓冲液； 阴极注入 pH8.6 的巴比妥缓冲液， 要求两 极液面平行。.醋酸纤维素薄膜切成1

45、2x 4cm的条状，置于浸泡液内10min后取出，用滤纸吸去多余液体，使粗面朝上，贴于电泳槽的支架上，用两层纱布搭桥，自然平衡5min 。.用Hb吸管吸取23 d l 10%Hb夜，放在盖玻片上（长约 1cm）边缘，使之印在靠阴 极端1.5cm薄膜片处，薄膜下衬一张干燥滤纸以吸去多余的Hb液，同时用正常人血红蛋白液做对照。.接通电源，平衡 5min后，调电压至150v,电流0.2mA/cm薄膜宽，电泳1530min。 取下薄膜条，置于氨基黑10B 染液中，10min 后取出，用漂洗液至薄膜条洁白为止。.定量测定 将各小区带剪下，HbA用20ml 0.4mol/L NaOH 脱色，HbA用4ml

46、 0.4mol/L NaOH兑色。另取一条无色膜条（与 HbA带相仿大小），力口 0.4mol/L NaOH液4ml作为空白， 用分光光度计，在 640nm处比色，记录吸光度，按下式求其含量（%HbA吸光度HbA 2（%） = X 100HbA2吸光度+HbA吸光度X 5【 质量控制 】醋酸纤维素薄膜应在浸膜液中浸透。2防止被检血红蛋白以外的标本污染薄膜。3为保证电泳效果，电泳槽内缓冲液最多使用两次。【参考区间】1.1%3.2%。【 临床意义 】HbA 2 增高是轻型地中海贫血的重要特征。此外，巨幼红细胞性贫血，恶性贫血，某些不稳定血红蛋白等，HbA也相对增高。在电泳分组中，以HbA为标志，较

47、HbA快者包括H组和J 组，属快速异常HbHbA2 减低见于缺铁性贫血及铁粒幼红细胞性贫血等。实验十七、抗碱血红蛋白（HbFF测定实验原理】抗碱血红蛋白具有抗碱变性的能力， 在碱性溶液中不易变性沉淀， 其他Hb在碱性溶液中可变性而被沉淀剂沉淀，测其滤液中Hb含量即HbF的含量。试剂 】 0.083mol/L KOH 4 保存，用前应滴定校正。若有沉淀或混浊应弃去。2半饱和硫酸铵取饱和硫酸铵（约 390g/500ml ） 4ml ，加蒸馏水4ml 及 1mol/L 盐酸0.2ml 。【 操作方法 】1 . Hb液的制备 取抗凝血12ml,用等渗盐水离心沉淀，洗涤红细胞23次。然后向洗涤的红细胞中

48、加入蒸储水和四氯化碳（或氯仿、甲苯） ，其比例是1 ： 1.5 ： 0.5 ,用力 振荡56min,离心20min ,上层透明液即为 Hb液（约100g/L）。2取大试管1 支，加0.083mol/L KOH3.2ml,Hb 液 0.2ml 。立即混匀，准确碱化 1min ，立即加入半饱和硫酸铵6.8ml ，混匀后优质滤纸过滤，其滤液为甲液。3另取试管1 支，加蒸馏水4ml ,Hb 液 0.02ml ，混匀后为乙液。4.以蒸储水作空白，在 500nm处，测甲、乙液的吸光度（A）值。5计算 TOC o 1-5 h z 甲液 A 值51抗碱血红蛋白（% = x x 100乙液 A 值201式中51

49、和201分别为甲、乙Hb液的稀释倍数。【 质量控制 】KOHB度必须准确，pH应12,校正后最好小瓶密封，使用量及作用时间必须十分准 确。半饱和硫酸镂必须准确配制，其pH应为3.0,最好小批量分装。试验所用试管、吸管、仪器均不能污染酸碱，过滤纸应为优质，型号必须稳定，滤液应清晰透明，否则应重新过滤或离心沉淀。滤液呈淡黄色或淡红色，可使结果偏高。与所用试剂质量、浓度不足有关。每次最好做重复试验。【参考区间】 成人1.0%3.1%。新生儿55%85% 24个月后逐渐下降，1岁左右接 近成人水平。【临床意义】3 -地中海贫血HbF明显升高，重者可达 30%- 90%白血病、淋巴瘤、再 障、PNH真性

50、红细胞增多症等也轻度升高。HbF升高还应结合Hb电泳图谱，以判定是 HbF升高，还是Hb Bart 升高。实验十八、HbF酸洗脱试验实验原理 】 HbF 除抗碱能力强外，抗酸能力也较强。因此，血片经酸洗脱后，只有 含 HbF 的红细胞不被洗脱而染色。试剂 】 80%乙醇固定液 0.1mol/L 枸橼酸 枸橼酸 9.6g ，加水至 500ml。. 0.2mol/L 磷酸氢二钠 NazHPO- 12HO 35.81g ,加水至 500ml。4枸橼酸一磷酸缓冲液取液 37.7ml 与液 12.3ml 混合， pH3.3 0.2 。5 苏木素染液取 1g 苏木素溶于 10ml 无水乙醇中，取2g 明矾

51、溶于 200ml 蒸馏水中，混合后煮沸，加氧化汞0.5g ，至成深紫色，放冷水中冷却，次日过滤。1%伊红Y 溶液 200ml 中加 1 滴冰醋酸。【 操作方法 】1取新鲜干燥血涂片置80%乙醇中固定5min ，自然干燥。枸橼酸盐抗凝血4冰箱保存 3 日内可以使用。2将上述处理的血涂片，入37 pH3.3 的缓冲液中 5min ，取出后流水冲洗，待干。苏木素染液染1min ，以免误认为阳性红细胞。水洗后用伊红染液染1min ，水洗，干后镜检。结果判断】含有 HbF 的红细胞被伊红染液染成鲜红色，为阳性红细胞； 仅留下淡影的红细胞为阴性红细胞。 仿网织红细胞计数法，计数 1000 个红细胞中阳性细

52、胞所占百分率。质量控制】血涂片要薄，细胞平铺分散。涂片在2h 内染色，否则易出现假阳性。2缓冲液的温度、pH 及洗脱时间要严格掌握，否则影响结果。也可用稀释瑞氏染液做对比染色。【 临床意义 】 脐带血几乎所有的红细胞均为阳性； 1 个月后的婴儿阳性细胞为67%；46个月后偶见阳性细胞；成人则多 1%重型地中海贫血阳性细胞明显增加，轻型者仅有 少数阳性细胞，且细胞着色深浅不一。遗传性HbF持续存在综合征者全部为均匀淡红色阳性 细胞，但比脐血着色浅。再障和溶贫等也可出现含 HbF 的红细胞，但数量极少。实验十九、抗人球蛋白试验（ Coomsb试验）【实验原理】本试验是用于检查不完全抗体的试验，包括

53、直接试验和间接试验。直接试验是检查红细胞表面的不完全抗体。经盐水洗涤的致敏红细胞(表面结合有不完全抗体)在盐水介质中不发生凝集，加入抗人球蛋白血清后出现凝集为Coomb s试验直接阳性；间接试验是检查血清中游离的不完全抗体。正常人Rho (D)阳性O型的红细胞加入患者血清，若有不完全抗体，则使红细胞致敏，经洗涤后加入抗人球蛋白血清，可发生凝集，即为 Coomb s间接试验阳性。【试剂】.受检者红细胞取患者全血脱纤维蛋白或抗凝，离心除去上清液，用大量生理盐水洗涤红细胞3-5次，然后制成10%勺红细胞悬液。.受检血清。.正常 O型混合红细胞取数名正常“ O”型抗凝血，离心除去血浆，用大量生理盐水洗

54、涤3-5次，制成10%红细胞悬液。.抗人球蛋白血清。.抗D血清。. AB型血清。. 0.85%生理盐水。【操作方法】.直接试验检查红细胞膜上是否吸附着不完全抗体。其方法是：(1)取试管3支按表19-1操作表19-1检查红细胞膜上是否吸附不完全抗体123受检压积红细胞2对照同型压积红细胞一 22一抗D血清一 4一AB型血清一一4(2)将2、3管置37c水浴中1h,然后3支试管均用大量生理盐水洗2次，每管再以生理盐水配成 10%!细胞悬液。(3)取小试管4支，按表19-2操作。表19-2直接试验操作步骤反应物(滴)受检者盐水对照阳性对照阴性对照抗人球蛋白血清222第1管内容物第2管内容物22一 2

55、第3管内容物一2(4)混合后，置室温 30min,观察结果。若阳性对照凝集，盐水对照及阴性对照均无 凝集，表示试剂及操作均无问题。受检管凝集者为阳性，表示患者红细胞上有不完全抗体。 无凝集者为阴性。、间接试验检查患者血清中是否有游离的不完全抗体。其方法是：（1）取试管4支，按表19-3操作。表19-3 间接试验检查血清中是否有游离不完全抗体 TOC o 1-5 h z 1234反应物（滴）受检者 盐水对照阳性对照阴性对照受检血清 2抗D血清一一 2一AB血清一一一 2受检压积红细胞 11正常压积红细胞一一 11生理盐水一 2（2）混合，置37c水浴1h。（3）离心，弃上清，用大量生理盐水洗2次

56、，每管用生理盐水配成 5%3c细胞悬液。（4）取小试管4支，按表19-4操作。表19-4 间接试验操作步骤反应物（滴） 受检者 盐水对照阳性对照阴性对照 TOC o 1-5 h z 抗人球蛋白血清 2z 22第1管内容物 1第2管内容物一 2第3管内容物一一 1一第4管内容物一一一 1生理盐水一 1（5）混匀后，室温 30min观察结果。若盐水和阴性对照不出现凝集，而受检者和阳性 对照出现凝集为阳性，表示患者血清中有游离的不完全抗体存在。【质量控制】标本应新鲜，试管洁净，避免血浆蛋白污染，以防假阴性。阴、阳性对照 结果应鲜明，否则应重做。【临床意义】正常人直接、间接抗人球蛋白试验均为阴性。直接

57、试验阳性主要见于温抗体型（IgG）自身免疫性溶血性贫血，亦见于药物免疫性溶血性贫血和同种免疫性溶血性贫 血（新生儿溶血病及溶血性输血反应）。制备抗IgG和/或抗补体的特异性 Coomb s血清，可将温抗体型自身免疫性溶血性贫血分为三个亚型： IgG型（24%）;IgG及C3型（60%） 。型（12%。少数患者虽有典型临床表现，并对激素疗效较好，但Coomb s试验为阴性，可能为IgA或IgM型。Coomb s试验的强度与溶血的严重程度无关。间接抗人球蛋白试验 最常用于Rh或ABO壬娠免疫性新生儿溶血病母体血清中不完全抗体的检测。自身免疫性溶 血性贫血患者本试验可以阳性，也可以阴性，这主要取决于

58、自身抗体的总量及其与红细胞的亲和力。实验二十、冷凝集素试验【 实验原理 】 冷凝集素综合征患者血清中的冷凝集素能与自身红细胞、 O 型红细胞或与患者同型红细胞在04 C条件下产生凝集现象。当加热至37C时，已凝集的红细胞可发 生完全可逆性的散开。【 试剂 】1受检者血清。2正常O 型或与受检者同型红细胞，经生理盐水洗涤3 次，配成20%红细胞生理盐水悬液。【 操作方法 】1取小试管12 支，每管加0.2ml 生理盐水。2取待检血清0.2ml ，在上述试管中作对倍稀释。第12 管不加血清，作盐水对照。3.每管中加入20%O型红细胞悬液0.2ml ,混匀，放4C冰箱中24h,取出观察结果后， 将试

59、管放入37C水浴30min再观察。【结果判断】在4C时出现凝集现象，放入37 C 30min后凝集现象消失者为阳性。出现凝集的血清最高稀释度的倒数为凝集效价。参考区间】冷凝集素效价64） 。 冷凝集素综合征多高达256 以上， 且此种异常的冷凝集素作用的温度范围也常扩大，有时在30C时效价仍高，这就很有诊断意义。故如 4 C时效价增高不很明显而又疑为本病者，应再用20C、30C作试验。为使诊断更明确，应进一步做冷热溶血试验，及冷球蛋白试验，以除外PCHM冷球蛋白血症等冷敏感性疾病。实验二十一、冷热溶血试验【实验原理】阵发性寒冷性血红蛋白尿（PCH症患者体内存在一种冷热溶血素，属IgG抗体，当温

60、度低于 20C时，能牢固结合于自身红细胞表面，温度恢复至37C时，激活补体使红细胞溶解而溶血。【 试剂 】1豚鼠血清。2生理盐水。【 操作方法 】.取小试管16支，前8支（18）为试验组，后 8支（916）为对照组。.取新鲜豚鼠血清，以生理盐水稀释10倍。.取患者静脉血910ml,注入盛有小玻璃珠的小三角瓶内，轻轻转摇，至纤维蛋白 析出附于玻璃珠上。将去纤维蛋白血低速离心，分离出血浆。红细胞用生理盐水洗涤3次,配成50斌细胞盐水悬液。.取正常同型血910ml,按上法分离血浆和配制50%：细胞盐水悬液。.按表21-1加入各种反应物。然后将试验组的试管置冰箱中30min,再置37C水浴中2h。对照