电子教案与课件：《生物化学》教学PPT-2-项目二-蛋白质化学

1、项目二 蛋白质化学任务一 蛋白质的分子组成一、蛋白质的定义与生物学作用1 定义蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。2、蛋白质的生物学重要性分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。酵母细胞蛋白质含量达到50%左右，植物体内由于糖类物质含量高，蛋白质含量相对含量较低，在大麦中约含10%蛋白质。（1）蛋白质是生物体重要组成成分（2） 氧化供能可作为生物催化剂(酶)，人体有4000种

2、以上的酶都具有蛋白质组分。是生物体的重要组成部分和生命活动的物质基础，蛋白质与核酸是细胞自我复制的的重要物质，是制造并维护身体组织、器官的重要组分。代谢调节作用。许多激素是蛋白质及其衍生物，如生长素、胰岛素、肾上腺素、性激素等。免疫保护作用（免疫细胞，如T淋巴细胞，白细胞）物质的转运和存储（脂肪运输需要脂蛋白参与，运载维生素需要专门的运载蛋白完成，铁离子需要运铁蛋白，铁储存需要铁蛋白，储存在肝脏中）运动与支持作用，如肌肉蛋白，结缔组织。参与细胞间信息传递，如生物膜。（3）蛋白质具有重要的生物学功能二、蛋白质的组成1.蛋白质的组成元素主要有C、H、O、N和 S。有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、

3、铜、锌、锰、钴、钼、钙、镁，个别蛋白质还含有碘 。各主要元素在蛋白质中的含量约为C：50-55%、H：6-7%、O2：20-23%、S：0-3%。 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量（要排除非蛋白氮含量），就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量 (g %)= 每克样品含氮克数 6.25100生物材料蛋白质换算系数生物材料蛋白质换算系数大米5.95核桃5.30小麦5.83蓖麻5.30大麦5.83芝麻籽5.30燕麦5.83葵花籽5.30玉米6.25椰子5.30花生5.46乳6.30大豆5.71蛋6.

4、25棉籽5.30肉6.25部分生物材料的蛋白质换算系数 2.蛋白质的化学组成 根据蛋白质的组成，可以将蛋白质分为简单蛋白质与结合蛋白质。 简单蛋白质完全由氨基酸组成，也称单纯蛋白质，结合蛋白质中的非蛋白部分称为辅基。 结合蛋白质辅基有金属离子、磷酸基因等。有些是小分子化学物，如血红素，黄素核苷酸等，有些则是大分子如脂类、核酸等。 结合蛋白质种类多，但辅基少，很多蛋白质可共用相同辅基，如肌红蛋白、血红蛋白和细胞色素类蛋白质都含有血红素辅基，而黄素腺嘌呤二核苷酸（FDA）是许多氧化还原酶的辅基。3.蛋白质的分子大小 分子量（MW）6000D，称肽。已知蛋白质分子量时，可以利氨基酸平均分子量进行肽链

5、数目的估算。构成蛋白质的20种氨基酸的平均分子量是138u，但并非等机率出现，一般分子量小的出现频率更多，加权得到氨基酸的平均分子量为128，由于在聚合过程中要失去一分子水，故氨基酸残基的分子量为110，用蛋白质分子量除以110，就可以计算出氨基酸残基的数目。如胰岛素的分子是5734，计算可得结果为52个氨基酸残基，实际数值为51。N 末端：多肽链中有游离-氨基的一端C 末端：多肽链中有游离-羧基的一端多肽链有两端：4 蛋白质的分类（1）根据形状分 根据分子形状对称性分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。球状蛋白，如血红蛋白（5.5nm），球蛋白溶解性较好，能结晶，大多数蛋白属此类。 纤维状蛋白质，如

6、血纤维蛋白质，高度不对称结构。纤维状蛋白质有能溶于水，如肌球蛋白，血纤维蛋白等，大多数不溶于水，如胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝心蛋白等，在生物体内的功能主要是起到保护作用。（2）根据分子化学组成和结构分 单纯蛋白质和结合蛋白质根据其溶解性和辅基成分不同，可进行进一步的分类。单纯蛋白质的分类结合蛋白质的分类（3）根据生物功能分类分为活性蛋白质和非活性蛋白质。 活性蛋白质是指生命过程中一切有活性的蛋白质及其前体分子。根据其具体功能可分为酶、激素、运输蛋白、受体蛋白、膜蛋白等。 非活性蛋白是一大类在生物体内保护或支持作用的蛋白质，如角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等。任务二 蛋白质的基本单位-

7、氨基酸 氨基酸是羧酸的衍生物，当分子结构中的-碳原子上的H原子被氨基取代后就形成氨基酸。已发现的氨基酸有180多种，参加蛋白质合成的只有20种常见的氨基酸。且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外，因为甘氨酸是对称结构，所以没有LD型之分）。 常见氨基酸直接由生物遗传密码直接编码，而不常见氨基酸都是在已合成的肽链上由常见氨基酸经专一酶催化修饰转化而来。一、氨基酸的结构特点与通式 20种常见氨基酸的中英文名称和三字母简写见P24-25。H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式RC+NH3COO-H 20种氨基酸中，除脯氨酸外，结构上的共同点是与羧酸相邻的-碳原子上的一个H被NH2+取代。除R取代基不同外，所有

8、的-氨基酸都是相同的。除甘氨酸外，所有的氨基酸都具有旋光性，具有L-型和D-型两种光学异构体。蛋白质中所有氨基酸都是L型的。二、氨基酸的结构与分类1 根据R基团化学结构分类 可以分为脂肪族、芳香族和杂环族三类，其中以脂肪族氨基酸最多。 脂肪族氨基酸（共15种）包括： （1）一氨基一羧基氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。 （2）羟基氨基酸：丝氨酸、苏氨酸（3）含硫氨基酸：半胱氨酸、甲硫氨酸（蛋氨基）（4）酰胺基氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺（5）一氨基二羧基氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸（6）二氨基一羧基氨基酸：赖氨酸、精氨酸芳香族氨基酸（共2种）：苯丙氨酸、酪氨酸杂环族氨基酸（共3种）：

9、色氨酸、组氨酸、脯氨酸 杂环化合物构成环的原子除碳原子外，还至少含有一个杂原子。最常见的杂原子是N、S、O。可分为脂杂环、芳杂环两大类。2. 根据R基团的酸碱性质可以分为酸性氨基酸、中性氨基酸和碱性氨基酸。 酸性氨基酸（2种）：天冬氨酸和谷氨酸，侧链含有羧基，为一氨基二羧基氨基酸。 碱性氨基酸（3种）：赖氨酸（侧链有氨基）、精氨酸（侧链有胍基）、组氨酸（侧链有咪唑基），为二氨基一羧基氨基酸。中性氨基酸（15种）：其它15种氨基酸均为中性氨基酸。3. 根据R基团的带电性质（极性） 可以分为非极性氨基酸（疏水氨基酸）、不带电荷的极性氨基酸和带电荷的极性氨基酸3类，后两者称为亲水性氨基酸。 其中，带

10、电荷的氨基酸又可以分为带正电荷的氨基酸和带负电荷的氨基酸两大类。（1）非极性氨基酸（共8种） 分别是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸。它们的侧链是非极性基团或疏水性基团，这类氨基酸在水中的溶解度一般比亲水性氨基酸要小（脯氨酸除外,Pro溶解度P28）。侧链为脂肪烃链侧链为芳环侧链为脂肪烃侧链为杂环（2）不带电荷的极性氨基酸（共7种） 分别是甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。它们的侧链R基团是不解离的极性基团或亲水性基团，能与水形成氢键。其中甘氨酸侧链介于极性与非极性之间，有时也归入非极性类，由于侧链是H原子，对极性较强的-氨基和-

11、羧基影响很小，因此，将其归入极性氨基酸比较合理。（3）带电荷的氨基酸（共5种）带正电荷的氨基酸（共3种）：侧链带有高度极性的R基团，会发生解离带上正电荷，包括有赖氨酸、精氨酸和组氨酸，又叫碱性氨基酸。带负电荷的氨基酸（共2种）：包括天冬氨酸和谷氨酸，又叫酸性氨基酸。3.根据营养价值分类 分为必需氨基酸（人体不能合成或合成量较少）和非必需氨基酸。 必需氨基酸（8种）：异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。 半必需氨基酸（2种）：组氨酸、精氨酸。如组氨酸是婴幼儿必需氨基酸，会缺乏时会患湿疹。 人体必需氨基酸有8种，分别为亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏

12、氨酸、色氨酸和缬氨酸。记忆口决：假设借来一二本书：甲硫氨酸、色氨酸、缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸。4、组成蛋白质的不常见氨基酸 如 -丙氨酸是构成维生素泛酸的主要成分。D-苯丙氨酸参与组成抗生素短杆菌肽S。同型半胱氨酸是甲硫氨酸代谢产物。瓜氨酸和鸟氨酸是尿素合成中间产物。-氨基丁酸（-GABA）是谷氨酸脱羧产物，是抑制神经递质，在大脑中含量较高。一些非蛋白质氨基酸已被开发并作为药物应用于临床的疾病治疗。 这些氨基酸不是在蛋白质合成过程中加入的，而是在蛋白质合成后由酶催化由常见氨基酸转化的。如动物结缔组织中的胶原蛋白含有4-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸，肌肉中的肌球蛋白含有N-甲

13、基赖氨酸，凝血酶中含有-羧基谷氨基。 5、非蛋白氨基酸 在生物体内已发现的氨基酸中，除20种常见氨基酸和少数不常见氨基酸之外，绝大多数种类氨基酸不参与蛋白质构成，称非蛋白质氨基酸，这些氨基酸通常是常见氨基酸的衍生物，也有一些是-氨基酸、-氨基酸、-氨基酸，甚至是D-氨基酸。如在维生素B3中含有-丙氨酸，在尿素循环途径中有L-瓜氨酸和L-鸟氨酸， -氨基丁酸是一种重要的神经传递质，细菌细胞壁的肽聚糖中含有D-丙氨酸和D-谷氨酸。 作业1. 请写出常见20种氨基酸的中文名称及对应的三字母缩写。2.请根据氨基酸侧链性质不同，将氨基酸进行分类，并标示其极性和带电特性？作业收齐后交制药楼223三、氨基酸

14、理化性质 （一）氨基酸的物理性质1.晶体形状 各种氨基酸均为无色结晶，晶形有差异，可作为氨基酸鉴定的依据。而且氨基酸构形不同，晶形也不同。如L-谷氨酸是四角柱形，而D型则是菱片状结晶。 除半胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水，均能溶于稀酸、稀碱溶液，除脯氨酸和羟脯氨酸能溶于乙醇或乙醚外，其它均不能溶于有机溶剂。 2 熔点 由于氨基酸以兼性离子形式存在， 因此，其熔点比相应的羧酸或 胺类要高些，一般在200-300之间；不同氨基酸差别较大，较低的如半胱氨酸为178 ，较高的如酪氨酸为342-344，有些氨基酸还未达到熔点温度就开始分解了（如谷氨酸钠受热分解）。常见氨基酸的熔点P273 氨基酸的味感 各

15、种氨基酸都有一定的味感，味感与氨基酸的结构和构型有关。一般D-型氨基酸多数有甜味，而L-型氨基酸有甜、苦、鲜、酸等4种味感。其中疏水性氨基酸多具有苦味，而亲水性氨基酸多具有甜味，两种氨基酸的钠盐具有显著的鲜味。常见氨基酸的味感见P275. 溶解度 各种氨基酸分子中均有-氨基和-羧基等极性基团，因此都能溶于水，但不同氨基酸在水中溶解性有巨大差异。如酪氨酸在水中溶解度每100mL仅溶解0.04g，而脯氨酸在水中溶解度则很大，每100mL可溶解162g。 所有氨基酸都易溶于稀酸和稀碱溶液中，不溶于乙醚、氯仿等非极性溶剂。常见L-氨基酸在不同温度条件下在水中的溶解度见P286.旋光性 常见氨基酸除甘氨

16、酸没有不对称碳原子外，其余均有不对称碳原子，因此，均有旋光性。 氨基酸的旋光度除与侧链R基性质有关外，还与测定时的pH有关，这是因为氨基酸为两性电解质，在不同pH条件下氨基和羧基的解离状态不同。比旋光度是一个可以进行氨基酸鉴别和纯度测定的物理常数。常见氨基酸的比旋光度见P296.紫外吸收性质 标准20种氨基酸在可见光区域均没有吸收，均为无色晶体，在远紫外区（pI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性离子 阳离子阴离子 氨基酸的等电点可以利用pK值计算得到，对于侧链不解离的中性氨基酸： 而对于侧链R基团含有可解离的酸性氨基酸和碱性氨基酸，由于这些氨基酸含有三个可解离基团，其完全质子化可以看成是一

17、个三元酸，存在3步解离，具有4种不同的离子形式。在进行等电点计算时，要先写出解离方程式，从中找出兼性离子形式，等电点pI应为兼性离子形式两侧的两个pK值的一半。对于酸性离子 ， ，如天冬氨酸，pI=(2.09+3.86)/2=2.98 对于碱性离子， ，如赖氨酸，pI=(8.95+10.53)/2=9.74在pI点，氨基酸所带净电荷为零；当pHpI时，氨基酸酸性解离大于碱性解离，而带上负电荷。 在电场环境下，带正电荷的氨基酸向负极移动，而带负电荷的氨基酸向正极移动，兼性离子则在电场中不移动，这就是电泳法分离氨基酸的基本原理。 如要分离丙氨酸（pI=6.02），赖氨酸（pI=9.74）和谷氨酸（

18、pI=3.22）可在pH=6.02的缓冲条件下进行电泳，此时，赖氨酸（pHpI）带负电荷，将向正极移动，而丙氨酸，则不移动，从而得以分离。8 疏水性 氨基酸的疏水性（hydrophobicity）为1mol氨基酸从水溶液转移至乙醇溶液时所产生的自由能变化。 不考虑活度系数变化前提下，Go=-RTln(S乙醇/S水)，其中S乙醇和S水分别为氨基酸在乙醇和水中的溶解度，单位为mol/L。 氨基酸结构可分为甘氨酸基和侧链，假定甘氨酸侧链（R=H）的Go为0，则Go=Go（甘氨酸）+Go（侧链），所以，氨基酸侧链残基的疏水性Go（侧链）=Go-Go（甘氨酸）。氨基酸侧链残基的疏水性常用Tanford法

19、测定。常见氨基酸侧链的疏水性见P30。（二）氨基酸的一般化学性质1. -氨基参与的反应 （1）与亚硝酸反应 氨基酸的游离-氨基可与亚硝酸反应，生成-羟基酸和氮气。 生成氮气分子一半的氮来自于氨基酸，另一半来自亚硝酸，该反应是范式（Van Slyke）定氮法的理论基础。 脯氨酸为亚氨基酸，没有游离-氨基，因而不能发生此反应。赖氨酸除了-氨基外，还有-氨基也能发生亚硝酸反应生成氮气，但反应速率较慢，控制反应时间在3-4min， -氨基可作用完全。（2）酰基化和烃基化反应 氨基酸与酰基化试剂或烃基化试剂反应， -氨基上的氢原子被酰基或烃基取代，生成相应的产物。其反应通式为： 生成的取代产物对氨基酸的

20、氨基具有保护作用，常用于多肽及蛋白质人工合成时保护氨基以及蛋白质一级结构测定时进行N-末端氨基酸分析与测定。 常用的酰基化试剂有苄氧甲酰氯、叔丁氧甲酰氯、对-甲苯磺酰氯、邻苯二甲酸酐、丹磺酰氯，等等。常用的烃基化试剂有2,4-二硝基氟苯（DNFB或FDNB，也称Sanger试剂）和苯异硫氰酸酯（PITC）。 2,4-二硝基氟苯，也称Sanger试剂，在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（DNP氨基酸）。常用来鉴定蛋白质和多肽的N-末端氨基酸残基。 苯异硫氰酸酯（PITC）和氨基酸反应比较特殊，PITC在弱碱性条件下先和氨基酸反应生成烃基化产物苯氨基硫甲酰氨基酸（P

21、ITC-AA），此化合物在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-AA）。此反应在多肽和蛋白质氨基酸序列分析中具有特殊重要作用。（3）形成希夫碱（Schiffs base） 氨基酸-氨基能与醛类化合物反应生成弱碱，称为希夫碱。 赖氨酸侧链的-氨基也可以发生该反应。希夫碱是某些酶促反应，如转氨基反应的中间产物。（4）脱氨基反应氨基酸在氧化剂或氨基酸氧化酶的作用下发生氧化脱氨反应生成相应的-酮酸。 此反应是生物体氨基酸分解代谢的第一步。氨基酸只有脱氨基后才能在体内进行代谢。2. -羧酸参加的反应（1）成盐和成酯反应 氨基酸与碱作用即生成盐，如氨基酸钠盐。氨基酸的重金属盐不溶于水

22、。氨基酸的羧基与醇反应可以得到相应的酯。如在干燥HCl气体条件下，氨基酸与无水甲醇或乙醇就得到相应的甲酯或乙酯。当氨基酸在成盐、成酯后，羧基的化学性质被保护，而氨基的化学性质得到加强，容易与酰基、烃基等发生反应。 也有一个例外：氨基酸与对硝基苯酚生成相应的对硝基苯酯后，羧基的反应活性反而增强了，易发生酰化反应，这种酯称为活化酯。 氨基酸的成盐、成酯反应在多肽与蛋白质合成中经常被用到。 （2）成酰氯反应 氨基酸的氨基经保护后，其羧基可以和五氯化磷或二氯亚砜等作用生成相应的酰氯。 氨基酸生成相应的酰氯后羧基被活化，容易与另一个氨基酸的氨基之间形成肽键，因而，此反应在多肽人工合成中经常使用。（3）叠

23、氮反应 氨基酸的氨基用适当基团保护后，羧基经酯化后生成相应的酯，然后再与肼和亚硝酸反应，生成叠氮化合物。生成的叠氮化合物同样使羧基被活化，此反应也应用于多肽人工合成中。（4）脱羧基反应 生物体内，氨基酸在氨基酸脱羧酶的催化下脱去羧酸生成相应的伯胺并放出二氧化碳。脱羧酶专一性很强，一种氨基酸脱羧酶只能催化一种特定的氨基酸脱羧，而不能催化其它的氨基酸脱羧。 在发酵法生产氨基酸的过程中，可以利用该反应进行氨基酸的产量。加入特定的氨基酸脱羧酶后，利用瓦勃呼吸计可以定量测定CO2量，从而计算出氨基酸的量。3. -氨基和-羧基共同参加的反应 （1）茚三酮反应 在弱酸性溶液中，将-氨基酸和茚三酮共热发生氧化

24、还原反应，氨基酸氧化脱氨、脱羧，生成相应的醛、氨和CO2，茚三酮被还原成还原茚三酮。而还原茚三酮、氨和水合茚三酮共同作用生成一种蓝紫色的物质。氨基酸和茚三酮反应的颜色与条件_陈忠云：/view/6f69d368783e0912a2162a49.html 茚三酮反应非常灵敏，广泛用于氨基酸的定性和定量分析，该蓝色物质在570nm有最大吸收，在0.5-50g/mL范围内，氨基酸含量与吸光值成正比。 脯氨酸是亚氨基酸，与茚三酮反应并不释放氨气，也不会生成蓝色物质，而是直接生成一种黄色物质，此化合物的最大吸收波长在440nm。（2）合成肽反应 一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间脱水缩合生成酰胺化

25、合物为肽，形成酰胺键为肽键。由两个氨基酸组成的肽称为二肽。如甘氨酸和丙氨酸反应如下： 这两种肽是完全不同的两类化合物，因此，两种不同的氨基酸可以形成两种二肽，三种不同的氨基酸可以形成6种三肽，而n种不同的氨基酸可以形成n!种不同的多肽。 许多氨基酸的侧链R基代有可发生化学反应的官能团， 包括Ser、Thr的羟基，Tyr的酚羟基，Cys的巯基，Trp的吲哚基，His的咪唑基，Arg的胍基，Met的甲硫基，Lys的氨基，Asp、Glu的侧链羧基等等。这些侧链可以发生很多化学反应，可用于氨基酸的定性定量分析和蛋白质化学修饰。（1）Cys巯基参加的反应 半胱氨酸的巯基（-SH）是一个化学性质很活泼的反

26、应基团，可发生很多反应。巯基很容易被氧化，氧化方式常见有2种。在较弱的氧化剂作用下，两个Cys巯基之间发生氧化，形成二硫键，产物是胱氨酸。4. 由侧链R基参与的反应 此反应可逆，在还原剂如巯基乙醇（ -巯基乙醇）、二硫苏糖醇等作用下，胱氨酸的二硫键打开，重新形成两个半胱氨酸。 -S-S-/-SH自成一个氧化还原体系，在机体氧化还原作用中起一定的作用。二硫键广泛存在于蛋白质分子中，它们将不同的多肽肽或一和条多肽链的不同部位连接到一起，对于稳定蛋白质空间结构起着非常重要的作用。 在较强的氧化剂如过甲酸的作用下，巯基或二硫键被氧化成磺酸基。此反应不可逆，常在测定蛋白质一级结构时用来打开二硫键。 巯基

27、易与烷化剂，如碘乙酸、对氯汞苯甲酸等作用生成相应稳定的烷基化衍生物。有许多蛋白质的生物学活性与Cys的巯基直接有关，当烷化剂与巯基作用后可使这些蛋白质失去活性。（2）Tyr的酚基参加的反应 Tyr（酪氨酸）的酚羟基在碱性条件下具有还原性，可以使Folin-酚试剂（含磷钼酸和磷钨酸）还原生成蓝色的钼蓝和钨蓝，在680nm下有最大吸光。利用Folin试剂可以对酪氨酸进行定量测定。 蛋白质分子由于含有酪氨酸（色氨酸也有此反应），可以常用此法进行定量测定，此外，还可以用此法进行蛋白酶活力测定。 Tyr的酚基在羟基两侧的3位和5位容易发生亲电取代反应，如发生碘化和硝化，此外，还可以和重氮化合物结合生成橘

28、黄色的化合物，此反应称为Pauly反应，也被用于检测酪氨酸。氨基酸侧链基团的部分化学反应5.氨基酸的甲醛滴定 氨基酸在水溶液中主要以两性离子存在，但由于氨基酸在水溶液中酸度很低，无法直接用碱进行滴定。要使反应进行到底，必需要使反应终点pH在12-13范围内，这么高的pH条件下没有合适的指示剂指示反应终点，所以不能直接滴定。 加入甲醛反应促使氨基酸电离产生H+，使其pH下降，就可以用酚酞作指示剂，用NaOH直接滴定，根据消耗的NaOH量就可以计算出氨基酸中氨基的量，即氨基酸的含量。此法可用于游离氨基酸的测定，大体判断蛋白质水解或合成程度。 在中性条件下，若在氨基酸溶液中加入过量的甲醛，能与-NH

29、2很快反应生成羟甲基衍生物和二羟甲基衍生物。 由于甲醛的存在，使解离后的氨基酸（A-）不断被反应掉，大大促进了氨基酸-NH3+的解离，使该反应的终点由pH12-13降到9附近，落入酚酞的指示范围，因此，可以利用NaOH滴定来指示终点。 甲醛滴定法是一种常用的氨基酸测定方法，测得结果常用氮含量来表示氨基酸含量，称为甲醛氮。甲醛滴定法测定氨基酸：/view/66002cc84028915f804dc240.html?from=search （三）肽和肽键 （一）肽键 是一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基缩合脱去1分子水形成的酰胺键。（二）肽 肽是氨基酸的线性聚合物。每条肽链有自由氨基的一端称

30、为氨基末端或N端，有自由羧基的一端称为羧基末端或C端。由于氨基酸之间通过脱水缩合形成酰胺键，氨基酸结构不完整，常称氨基酸残基。任务三 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构包括: 高级结构一级结构(primary structure)二级结构(secondary structure)三级结构(tertiary structure)四级结构(quaternary structure)一、蛋白质的一级结构（primary structure） 蛋白质的一级结构又称为共价结构，是指肽键中的氨基酸残基排列顺序。 一级结构研究不仅包括肽链中氨基酸顺序，还包括肽键数目，末端氨基酸残基种类，链内和链间二硫键位置等

31、。一级结构决定空间结构，是蛋白质发挥生物学功能的基础。牛胰岛素一级结构 肽的化学名称是根据氨基酸的顺序由N-末端开始向C-末端阅读，称为某氨酰某氨酰某氨基酸，C末端的氨基酸读作某氨基酸。 如下面由5个氨基酸组成的5肽读为丙氨酰谷氨酰亮氨酰缬氨酰组氨酸，简写为Ala-Glu-Leu-Val-His。 Mw6000称为蛋白质。 多肽链存在顺式和反式两种构型。正常情况下，由于顺式结构使-碳原子的R基团相互靠近而产生空间位阻，因此，多肽链都是反式构型。 一个特例是含有Pro的肽键可以是顺式，也可以是反式存在。 氨基酸的序列决定了蛋白质结构与功能。一级结构中的某些位点的氨基酸残基可以被其它氨基酸残基取代

32、，甚至成片缺失，并不影响或很少影响蛋白质的生物功能，这些位点的氨基酸称为可变氨基酸。而一级结构中的另一些位点的氨基酸的保守性很强，一旦被取代或缺失，则导致蛋白质生物学功能严重降低甚至丧失，这些氨基酸称为保守氨基酸。一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能胰岛素氨基酸残基序号A5A6A10B30人ThrSerIleThr猪ThrSerIleAla狗ThrSerIleAla兔ThrGlyIleSer牛AlaGlyValAla羊AlaSerValAla马ThrSerIleAla（1）一级结构与空间结构的关系 蛋白质的天然构象即空间结构由其氨基酸序列决定，直接证据来源于20世纪60年代White和

33、Anfinsen所做的牛胰核糖核酸酶复性实验。 牛胰核糖核酸酶由124个氨基酸组成，有4对二硫键。牛胰核糖核酸酶通过4个二硫链及次级键，肽链盘曲折叠成三级结构，具有活性。（2）同源蛋白质的一级结构差异与生物进化同源蛋白质是指在不同生物体中实现同一功能的蛋白质，如血红蛋白。同源蛋白质一级结构有许多相似之处，常具有相同或相近肽链长度，并且在很多位点上的氨基酸是相同的，被称为不变氨基酸，其它位点上的氨基酸残基对于不同来源的蛋白质可能会有所变化，称为可变残基。同源蛋白质的氨基酸顺序上存在的这种相似性称为顺序同源现象，对该现象的研究有助于对生物进化中的亲缘关系进行分析，绘制出进化树。细胞色素c（Cyt

34、C）目前顺序同源现象研究最多的蛋白质。不同生物Cyt C与人Cyt C氨基酸残基的差异数生物类型氨基酸差异数生物类型氨基酸差异数黑猩猩0响尾蛇14猴子1海龟15兔1金枪鱼21猪、牛、羊10小蝇25狗11蛾31驴11小麦35马12粗糙链孢霉43鸡13酵母44黑猩猩与人的基因组相似度高，常用于药物的动物试验，如HIV病毒试验细胞色素C构建的物种进化树（3）一级结构的局部断裂与蛋白质（酶原）激活 生物体内有些蛋白质是以没有活性的前体形式合成的，称蛋白质原。蛋白质原的部分肽链需按照特定方式断裂才能具有活性，这一过程称蛋白质激活。如胰岛素以前胰岛素原形式合成，其N端有一段信号肽，是分泌蛋白质的标志，进入

35、到内质网后，在信号肽酶的作用下，信号肽被切除，生成胰岛素原。胰岛素原含有一段连接肽，在连接肽切除后，才能形成活性的胰岛素分子。胰岛素在体内的转化过程 许多酶类，如蛋白水解酶也都是以无活性的酶原形式合成，只有被分泌到特定部位后，在专门的激活剂的帮助下，一级结构发生局部断裂，才有催化活性。（4）一级结构与分子病每一种蛋白质都有其特定的生物学功能，因蛋白质生物大分子组成和结构发生改变而导致的疾病称为分子病。镰刀状贫血病是最早被认识的一种分子病，流行于非洲一些地区。患者血液红细胞形态异常，有很多呈新月状或镰刀状，在红细胞脱氧时镰刀状细胞数量增加，严重时导致红细胞破裂、溶血而致命。致病原因是患者的血红蛋

36、白异常。A.正常的血细胞，血红蛋白肽链中的第六个氨基酸是谷氨酸；B.镰形细胞，其血红蛋白的第六个氨基酸是缬氨酸 血红蛋白是红细胞内携氧的重要功能蛋白质，为四聚体蛋白质，由两个亚基和两个亚基组成（ 22 ），其中亚基包含141个氨基酸， 亚基包含146个氨基酸。患者血红蛋白（HbS）的亚基的N-末端的第6位的氨基由原来正常血红蛋白（HbA）的高度极性的Glu变与非极性的Val。这种改变导致血红蛋白表面电荷减少，在脱氧状态下溶解度下降，发生不正常聚集，形成镰刀状红细胞，严重时甚至出现红细胞破裂溶血。血红蛋白共有574个氨基酸残基组成，仅在两个亚基上各改变一个氨基酸残基，生理功能却发生了极在变化，可

37、见，蛋白质的一级结构对于功能具有重要的决定性作用。二、蛋白质的空间结构蛋白质的二级、三级和四级结构统称为蛋白质的高级结构，也称空间结构。只有特定空间结构的蛋白质才能表现出生物功能。蛋白质的一级结构是依靠肽键（共价键）维持的，而高级结构维持则通过众多化学键来维持。（一）维持蛋白质空间结构的化学键 蛋白质空间结构稳定性主要靠大量弱的相互作用即非共价键或次级键来维系，其中包括氢键、范德华力、疏水作用、盐键。这些次级键的键能往往比共价键低很多，但却是蛋白质空间结构维持的重要和主要力量。 此外，还有两种共价键-二硫键和配位键（常与金属共价配位螯合）在维持某些蛋白质的构象中也起着重要作用。（1）氢键 在多

38、肽主链上，存在大量的羰基和亚氨基（每个氨基酸残基都含有一个羰基和一个亚氨基），亚氨基是理想的供氢体，而羰基的氧原子是理想的受氢体，它们之间形成氢键。 多肽主链的羰基和亚氨基之间形成的氢键是维持蛋白质二级结构的最主要的作用力。部分氨基酸侧链也带有形成氢键的基团，如Ser、Thr的羟基，Tyr的酚羟基，Cys的巯基，Asp、Glu的侧链羧基等。 侧链之间以及侧链与主链之间形成的氢键也是维持蛋白质三级结构的重要力量。（2）疏水作用 也称疏水键，是指非极性基团为了避开极性环境而聚集到一起的作用力。 20种常见的氨基酸中有8种属于疏水性氨基酸，即Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Pro，大

39、多分布在球状蛋白质的内部。 疏水氨基酸侧链之间形成的疏水作用对于维系蛋白质三级和四级结构具有特别重要的作用。（3）范德华力 范德华力实质上也是静电力，主要表现为极性基团永久偶极之间的静电相互作用（定向效应）、极性基团永久偶极与非极性基团诱导偶极之间的静电相互作用（诱导效应）、非极性基团的瞬时之间的静电相互作用（分散效应）。 范德华力虽然很弱，但存在范围广泛，数量巨大，可存在于极性基团之间，也可存在于极性与非极性基团之间，或存在于非极性基团之间。范德华力成为维持蛋白质三级和四级结构不可忽视的作用力。 （4） 盐键 也称为离子键，是由正负离子之间的静电所形成的化学键。在生理pH条件下，酸性氨基酸侧

40、链带负电荷，而碱性氨基酸侧链带正电荷。多数情况下，这些氨基酸分布于球状蛋白质的表面，与水及溶液中的离子发生相互作用，但有时，少数相反电荷的侧链也出现在蛋白质分子的内部形成盐键。盐键的强弱受环境pH、溶剂种类、盐浓度等影响较大。（6）二硫键 二硫键形成于两个Cys-SH之间，属共价键。可将不同多肽链或同一条多肽链不同部位相连接。因为只有当肽链形成特定的空间结构后，才能形成正确的二硫键配对，所以二硫键并不指导肽链的折叠，但对其空间构象起着稳定作用。 二硫键数目越多，蛋白质抗外界因素的作用力就越强，因此，在生物体内一些起着保护作用的蛋白质往往含有很多的二硫键。 此外，还有一些二硫键是蛋白质行使生物功

41、能所必需的。2. 蛋白质的二级结构（secondary structure） 是指肽链中的主链借助氢键（肽键中的酰胺氮和羰基氧之间形成氢键），有规则的卷曲折叠成沿一维方向具有周期性结构的构象，主要研究内容是肽链的共价主链，而不涉及侧链R基团的空间排布，是蛋白质的构象单元。基本二级结构有：-螺旋、-折叠、-转角和无规则卷曲等。CD可用于蛋白质二级结构的测定。（1）-螺旋 是蛋白质分子中最常见且最稳定的二级结构构象，它是多肽主链环绕一个中心轴有规律的盘旋前进形成的螺旋型构象。由于该螺旋最初被发现于-角蛋白中，故称为-螺旋，分为左手螺旋和右手螺旋两种，天然蛋白质中存在的主要是右手螺旋，只在嗜热菌蛋白

42、酶中发现一圈左手螺旋。-螺旋结构特点P35。（2）-折叠 又称-结构、-构象， - 片层，是蛋白质分子中又一种常见的二级结构，该构象是一种较伸展的构象，由两条或两条上的肽段充分伸展并侧向聚集，按肽链长轴方向平行排列在一起，相邻肽链的羰基和亚氨基之间（肽链间形成氢键）形成有规则的氢键的一种折叠片层结构。如蚕丝丝心蛋白几乎全部由堆积的反平行-折叠结构组成。球状蛋白质中也广泛存在这种结构，如溶菌酶、核糖核酸酶、木瓜蛋白酶等球状蛋白质中都含有-折叠结构。NH，来自亚氨基O，来自COOH-折叠结构的特点：（1）主链走向呈折叠状，相邻肽平面依次折叠成锯齿状，侧链交错伸向锯齿样结构左下方。（2）两条以上肽链

43、（或同一条多肽链的不同部分）平行排列，相邻肽链之间靠肽键的羰基氧（CO）和亚基氢（N-H）形成氢键相连，氢键方向与肽链长轴垂直。（3）有顺式和反式两种结构。肽链N端在同侧为顺式，不同侧为反式。反式结构比顺式结构要稳定。链间有氢键相连。氢键也是维持-折叠结构的主要作用力。形成折叠的氨基酸残基较小且不带同种电荷。甘氨酸和丙氨酸在-折叠中出现频率较高。蚕丝蛋白几乎都是-折叠结构。（3）-转角 又称-弯曲或发夹结构，是球状蛋白质中发现的第三种二级结构，可占 到球状蛋白质全部氨基酸残基的1/4。 球状蛋白质分子肽链在盘旋过程中往往发生1800的急转弯，这种回折部位的构象即为-转角。常发现pro的存在。转

44、角的第二个氨基酸残基常为脯氨酸，其他残基有Gly、Asn、Asp和Trp等。常见转角含有4个氨基酸残基，有两种类型：转角I特点：第一个氨基酸残基羰基氧与第四个残基的酰氨氮之间形成氢键；转角第三个残基往往是Gly.这两种转角中的第二个氨基酸残基大都是脯氨酸。（4）无规则卷曲 也称自由回转，是指没有一定规律的松散结构，这是一种不规则的构象，是多肽主链多向性随机盘旋所形成的构象，常见于球状蛋白质分子中，使蛋白质肽链整体形成球状构象。 无规则卷曲不是任意形成，在同一种蛋白分子的相应部位，无规则卷曲的具体位点和结构是完全一样的，由一级结构决定的。因此，从某种意义上来说，无规则卷曲是有规律可循的，是一种稳

45、定的构象。 酶的功能部位常处于这种构象区域，使酶的活性中心具有柔性。（5）超二级结构、结构域（自学）超二级结构是指蛋白质分子中由若干相邻的二级结构单元（-螺旋、-折叠、-转角等）组合在一起，彼此相互靠近，形成在空间上能辨认的有规则的二级结构组合体。在蛋白质结构的组织层次上，超二级结构高于二级结构，低于结构域和三级结构。超二级结构最基本组合形式有3种，即-螺旋聚集体（）， -折叠聚集体（）和-螺旋与-折叠的聚集体（）。在多数情况下，形成超二级结构时，二级结构之间的接触面是由非极性氨基酸残基以疏水键发生相互连接，稳定超二级结构的构象，而极性氨基酸残基大多位于超二级结构表面。较大蛋白质的三级结构往往

46、由几个相对独立的三维实体构成，这些三维实体称为结构域。结构域是在三级结构与超二级结构之间的一个组织层次。一条长的多肽链可先折叠成几个相对独立的结构域，然后再缔合成三级结构。结构域常有相对独立的生理功能，如一些要分泌到细胞外的蛋白，其信号肽就构成一个结构域，此外，还有些残基修饰有关的结构域、与酶原激活有关的结构域。3. 蛋白质的三级结构 球状蛋白质在一级结构和二级结构的基础上，再进行三维多向性盘旋形成近似球状的构象称为蛋白质的三级结构。二级结构讨论的是共价主链的构象，而三级结构则涉及主链和侧链所有的原子和原子团的空间排布关系，但不讨论亚基间和分子间的排布。 蛋白质的空间结构是由一级结构决定的，其

47、中二级结构决定于氨基酸的短程顺序，三级结构氨基酸的长程顺序。 二硫键是维持三级结构唯一的共价键。维持蛋白质三级结构的主要作用键4. 蛋白质的四级结构 由多条肽链组成的蛋白质分子中，每一条肽链都独立形成三级结构，这样的三级结构单位再相互缔合，则形成了蛋白质的空间构象，即蛋白质的四级结构，这样的蛋白质被称为寡聚蛋白，寡聚蛋白分子中的每个结构单位称为一个亚基或亚单位（subunit）。 蛋白质的四级结构是指寡聚蛋白分子中亚基与亚基在空间上的相互关系和结合方式，亚基的数目和种类也是四级结构的研究内容，但不涉及亚基本身的构象（是三级结构研究内容）。血红蛋白（HB）四级结构（multiple subuni

48、t）肌红蛋白 (Mb) 三级结构(mono-subunit) 5. 蛋白质结构与功能 （1）单亚基蛋白质（肌红蛋白、胰岛素） 肌红蛋白是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质，由一条多肽链和一个血红素辅基构成，属结合蛋白质。相对分子质量为16 700，由153个氨基酸残基组成，主链中约有75%氨基酸以-螺旋结构存在，螺旋分为8段，分别以A、B、C、D、E、F、G、H编号，肌红蛋白分子内还含有非螺旋区，由-转角和无规则卷曲构成。分子内部只有一个能容纳4个水分子的空间。平面形的血红素处于分子表面的一个洞穴内。血红素也称铁卟啉，由原卟啉IX和一个Fe2+组成，卟啉中心的Fe2+有六个配位键，四个分别与卟啉环中的

49、4个N原子结合， 另外两个配位键垂直于环平面，其中一个与肽链93位His残基（F8）中咪唑基的N原子结合，另一个处于开放状态，用来与O2可逆结合。Fe2+在水环境中很容易被氧化成Fe3+而失去与氧结合的能力，蛋白质的空间构象为血红素提供了一个疏水环境，避免Fe2+发生氧化，保证了血红素的氧合能力。 肌红蛋白 (Mb) myoglobin153 AA1 HemeAH八段-螺旋无-S-S-键功能：储存O2 胰岛素分子由A、B两条多肽链组成，通过二硫键形成整体，三级结构是其最高层次的结构。胰岛素是一种激素，经血液循环到靶细胞表面时，与细胞膜上的受体发生专一性结合，这种结合的结合部位就是胰岛素的活性中

50、心。该活性中心位于分子表面，由两部分组成，一部分具有相当面积的疏水区，它是活性中心的主体，由几个芳香族氨基酸残基组成，它们对于胰岛素的 生物活性至关重要。另一部分分散在疏水区周围的一些带电荷或极性基团，活性中心，特别是疏水区的氨基酸残基一旦发生结构变化，将直接导致胰岛素活性的下降或丧失。（2）多亚基蛋白质-血红蛋白 血红蛋白是血液红细胞的主要成分，起着输送氧气和二氧化碳的作用。成人红细胞中有两种血红蛋白，分别称为HbA和HbA2，其中HbA占总量的96%以上，是主要的血红蛋白。相对分子质量约64 000，亚基组成为22。由两个亚基和两个亚基组成的四聚体蛋白质，其中亚基由141个氨基酸组成， 亚

51、基由146个氨基酸组成，四个亚基各结合有一个血红素辅基，因此，血红蛋白分子有4个O2结合位点。血红蛋白(hemoglobin，Hb)血红蛋白的一、二、三、四级结构一级结构：相邻AA间的共价结合二级结构：短距离AA之间的非共价连接三级结构：远距离AA之间的非共价连接四级结构：多肽链之间的非共价连接（3）变构效应(allosteric effect)一些效应剂可与某些蛋白质分子特定部位可逆地结合，而使其构象改变，从而改变生物活性，称变构效应。蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。任务四 蛋白质的理化性质一、蛋白质的两性解离与等电点 氨基酸的-氨基和-羧基已经用于形成肽键了，但在N末端

52、和C末端还有游离的氨基和羧基，可发生解离。可解离基团主要来自于氨基酸侧链。很多氨基酸的侧链有可解离基团，其中有些可以进行酸性解离，如Asp和Glu的侧链羧基，Tyr的酚羟基，Cys的巯基；有些能进行碱性解离，如Lys的侧链氨基，Arg的胍基，His的咪唑基。如果是结合蛋白质，则辅基中可能也含有可解离基团。 一般情况下，pH低，有利于碱性解离，蛋白质中正电荷增加而负电荷减少，带正电荷。pH高，则有利于酸性解离，蛋白质中正电荷减少而负电荷增加，带负电荷。解离情况如下： 当pH=pI时，蛋白质以两性离子形式存在，当pHpI时，蛋白质带上负电荷。大多数蛋白质的等电点在略偏酸性的范围内，这主要是由于羧基

53、的解离度大于氨基的解离度。 一般情况下，酸性氨基酸含量越高，蛋白质pI就越低，碱性氨基酸含量越高，pI就越高。具有可解离的氨基酸位于蛋白质分子内部，参与氢键、盐键的形成 以及稳定蛋白质构象，这些氨基酸就不会影响蛋白质表面的带电特性，对蛋白质的pI没有贡献。 如肌红蛋白中就有5个His残基分布在分子内部，虽然它们都是碱性氨基酸，但不影响肌红蛋白的pI。蛋白质的pI与酸性氨基酸、碱性氨基酸的比例没有必然的数量关系。 蛋白质pI并非蛋白质的特征性常数，受溶液中盐种类和浓度等影响。在纯水中不受其它离子干扰时，使蛋白质带正负电荷相等的pH称为等离子点，等离子点是蛋白质的特征性常数。由于蛋白质总是处于含有

54、离子的溶液环境中，所以人们通常讨论的都是蛋白质的等电点。 在等电点时，蛋白质的各种物理性质，如溶解度、导电性、黏度都达到最小值。等电点时蛋白质净电荷为零，分子间排斥力消失，双电层被破坏，分子间容易发生聚集而沉淀。二、蛋白质的胶体作用 分散介质在1-100nm之间称为胶体溶液，这是在一条件下能够保持稳定的分散系统。蛋白质相对分子质量大多在1万-100万之间，分子大小属于胶体粒子的范围，因此，蛋白质溶液为胶体溶液，表现出很多胶体性质，如丁达尔效应、布朗运动，不能透过半透膜。 蛋白质胶体溶液要保持稳定需具备两个因素：分子表面带同种电荷和分子表面形成水化层。 蛋白质亲水胶体，疏水氨基酸分布在分子内部，

55、亲水氨基酸则分布在分子表面，亲水氨基酸和水分子之间以氢键连接，构成了蛋白质的结合水。大量亲水氨基酸的存在，使1g蛋白质可结合0.3-0.5g水，蛋白质表面水化层能有效防止蛋白质分子间发生聚集。三、蛋白质的变性与复性 天然蛋白质受到某些理化因素的作用，有序的空间结构被破坏，导致生物活性丧失，并伴随发生理化性质的异常变化，称为变性作用。蛋白质的变性作用涉及蛋白质二级、三级、四级结构的丧失，但一级结构仍保持不变，肽键不发生断裂，所以蛋白质变性前后分子量没有变化。蛋白质变性因素可以分为物理因素和化学因素：（1）物理因素：如加热、UV、超声波、X-ray、高压、表面张力、剧烈振荡、搅拌、研磨等。（2）化

56、学因素：酸、碱、有机溶剂、重金属盐、变性剂、去污剂、生物碱试剂。 变性蛋白与天然蛋白在很多性质上会有区别，主要表现在：（1）理化性质的改变。变性蛋白由于疏水基团的外露，溶解度降低，因此，变性过程常伴随蛋白质的沉淀。同时，蛋白质溶液黏度增加，旋光性变化，等电点有所提高。由于Trp、Tyr和Phe外露，蛋白质的紫外吸收值增加。（2）生物活性丧失。这是蛋白质发生变性的最重要的标志。（3）生物化学性质的改变。主要反映在变性后分子结构松散，容易被蛋白酶所水解，熟食易于消化就是这个道理。四、蛋白质的沉淀作用 蛋白质稳定需满足带同种电荷和形成水化层两个条件。破坏蛋白质表面电荷或水化层，稳定性就会下降，发生絮

57、结沉淀，这就是蛋白质的沉淀作用。沉淀作用与蛋白质变性作用是有区别的，发生沉淀作用时，蛋白质的空间结构仍保持原状，仍具有生物学活性，若恢复到原来的条件，蛋白质可重新溶解。 常用沉淀方法有等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物碱试剂和某些酸类沉淀法以及热变性沉淀法等。（1）盐析法 在盐浓度很低时，向蛋白质溶液中加入少量的中性盐（如NaCl、KCl、硫酸铵、硫酸钠等），蛋白质溶解度增加，这种现象称为盐溶，当加入大量的中性盐后，蛋白质溶解度下降并发生絮结沉淀，这种现象称为盐析。盐溶现象是由于少量中性盐有利于双电层的形成，增加了蛋白质和水的亲和力，促进了蛋白质溶解。而盐析现象的发生是由于高浓度的盐结合了大量水，破坏了水化层，加强了蛋白质间直接作用。盐析法是最常用的沉淀蛋白质的方法，不会导致蛋白质的变性。 案例：硫酸铵分级盐析分离血清中的主要蛋白质1、取100ml血浆或血清置于500ml烧杯中，加PBS（phosphate buffer saline）100ml搅拌10min。2、在搅拌下慢慢滴加200mlpH7.2饱和硫酸铵溶液。3、加完饱和硫酸铵溶液后继续搅拌2030min以充分沉淀球蛋白。4、离心（3500r/min）2