生物化学与分子生物学课件：第15章 DNA损伤与修复

1、DNA损伤与修复DNA Damage and Repair第十五章各种体内外因素所导致的DNA组成与结构的变化称为DNA损伤（DNA damage） 一、DNA的结构发生永久性改变，即突变 二、导致DNA失去作为复制和/或转录的模板的功能 DNA损伤的后果:生物多样性依赖于：DNA突变DNA修复平衡DNA损伤DNA Damage第一节一、多种因素通过不同机制导致DNA损伤（一）体内因素 DNA复制错误 DNA自身的不稳定性 机体代谢过程中产生的活性氧（二）体外因素物理因素化学因素生物因素物理因素：电离辐射、紫外线(ultra violet, UV)化学因素：自由基导致的DNA损伤碱基类似物导致

2、的DNA损伤 碱基修饰剂、烷化剂导致的DNA损伤 嵌入性染料导致的DNA损伤 物理和化学因素对DNA的损伤 二、DNA损伤有多种类型 碱基脱落碱基结构破坏嘧啶二聚体形成DNA单链或双链断裂DNA交联碱基损伤与糖基破坏：化学毒物可通过对碱基的某些基团进行修饰而改变碱基的性质。由于碱基损伤或糖基破坏，在DNA链上可能形成一些不稳定点，最终可导致DNA链的断裂。碱基之间发生错配 ：碱基类似物的掺入、碱基修饰剂的作用可改变碱基的性质，导致DNA序列中的错误配对。在正常的DNA复制过程中，存在着一定比例的自发碱基错配。最常见的是组成RNA的尿嘧啶替代胸腺嘧啶掺入到DNA分子中。DNA链发生断裂：电离辐射

3、、化学毒剂、磷酸二酯键的断裂、脱氧戊糖的破坏、碱基的损伤和脱落都是引起DNA断裂的原因。碱基损伤或糖基破坏可引起DNA双螺旋局部变性，形成酶敏感性位点，特异的核酸内切酶能识别并切割这样的部位，造成链断裂。DNA链上被损伤的碱基也可以被另一种特异的DNA-糖基化酶除去，形成无嘌呤嘧啶位点（apurinic-apyrimidinic site, AP site），或称无碱基位点（abasic site），这些位点在内切酶等的作用下可形成链断裂。DNA 的共价交联：DNA双螺旋链中的一条链上的碱基与另一条链上的碱基以共价键结合，称为DNA链间交联（DNA interstrand cross-link

4、ing）。DNA分子中同一条链中的两个碱基以共价键结合，称为DNA链内交联（DNA intrastrand cross-linking）。DNA分子还可与蛋白质以共价键结合，称为DNA-蛋白质交联（DNA protein cross-linking）。DNA损伤可导致碱基置换缺失 插入 链的断裂 镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链CAC GTG基因正常成人Hb (HbA)亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链CTC GAG基因镰形红细胞贫血病人DNA损伤的修复The repair of

5、DNA damage第二节DNA修复（DNA repair）是指纠正DNA两条单链间错配的碱基、清除DNA链上受损的碱基或糖基、恢复DNA的正常结构的过程。DNA修复是机体维持DNA结构的完整性与稳定性，保证生命延续和物种稳定的重要环节。 常见的DNA损伤修复途径 修复途径 修复对象 参与修复的酶或蛋白 光复活修复 嘧啶二聚体 光复活酶 碱基切除修复 受损的碱基 DNA糖基化酶、无嘌呤嘧啶核酸内切酶 核苷酸切除修复 嘧啶二聚体、DNA螺旋结构的改变 大肠杆菌中UvrA、UvrB、UvrC和UvrD，人XP系列蛋白XPA、XPB、XPCXPG等 错配修复 复制或重组中的碱基配对错误 大肠杆菌中的

6、MutH、MutL、MutS，人的MLH1、MSH2、MSH3、MSH6等 重组修复 双链断裂 RecA蛋白、Ku蛋白、DNA-PKcs、XRCC4 损伤跨越修复 大范围的损伤或复制中来不及修复的损伤 RecA蛋白、LexA蛋白、其他类型DNA聚合酶 一、有些DNA损伤可以直接修复 嘧啶二聚体的直接修复 烷基化碱基的直接修复 无嘌呤位点的直接修复 单链断裂的直接修复 嘧啶二聚体的直接修复烷基化碱基的直接修复无嘌呤位点的直接修复 DNA嘌呤插入酶能催化游离嘌呤碱基或脱氧核苷与DNA嘌呤缺如部位重新生成糖苷共价键，导致嘌呤碱基的直接插入。具有很强的专一性。单链断裂的直接修复 DNA连接酶能够催化D

7、NA双螺旋结构中一条链上缺口处的5-磷酸基团与相邻片段的3-羟基之间形成磷酸二酯键，从而直接参与部分DNA单链断裂的修复，如电离辐射所造成的切口。二、切除修复是最普遍的DNA损伤修复方式 碱基切除修复 核苷酸切除修复 碱基切除修复（base excision repair） 识别水解：DNA糖基化酶特异性识别DNA链中已受损的碱基并将其水解去除，产生一个无碱基位点； 切除：在此位点的5端，无碱基位点核酸内切酶将DNA链的磷酸二酯键切开，去除剩余的磷酸核糖部分； 合成：DNA聚合酶在缺口处以另一条链为模板修补合成互补序列； 连接：由DNA连接酶将切口重新连接，使DNA恢复正常结构 核苷酸切除修复

8、（nucleotide excision repair, NER） 首先，由一个酶系统识别DNA损伤部位； 其次，在损伤两侧切开DNA链，去除两个切口之间的一段受损的寡核苷酸； 再次，在DNA聚合酶作用下，以另一条链为模板，合成一段新的DNA，填补缺损区； 最后由连接酶连接，完成损伤修复。E.coli的NER主要由4种蛋白质组成：UvrAUvrBUvrCUvrD 人类的DNA损伤核苷酸切除修复 首先由损伤部位识别蛋白XPC和XPA等，再加上DNA复制所需的SSB，结合在损伤DNA的部位； XPB、XPD发挥解旋酶的活性，与上述物质共同作用在受损DNA周围形成一个凸起； XPG与XPF发生构象改

9、变，分别在凸起的3-端和5-端发挥核酸内切酶活性, 在增殖细胞核抗原（PCNA）的帮助下，切除并释放受损的寡核苷酸； 遗留的缺损区由聚合酶或进行修补合成； 最后，由连接酶完成连接。 NER不仅能够修复整个基因组中的损伤，而且能拯救因转录模板链损伤而暂停转录的RNA聚合酶，即参与转录偶联修复（transcription-coupled repair）。作用方式：NER蛋白质被募集于暂停的RNA聚合酶。在这一过程中，RNA聚合酶起到损伤传感蛋白的作用。 转录偶联修复的意义：将修复酶集中于正在转录DNA，使该区域的损伤尽快得以修复。碱基错配修复（ mismatch repair）错配是指非Watso

10、n-Crick碱基配对。碱基错配修复也可被看作是碱基切除修复的一种特殊形式，主要负责纠正： 复制与重组中出现的碱基配对错误； 因碱基损伤所致的碱基配对错误； 碱基插入； 碱基缺失。 E.coli错配修复系统修复复制差错Dam甲基化酶（methylase）使E.coli处于暂时的半甲基化状态，标记母链和新合成的DNA链，帮助新合成的DNA链被错配修复系统识别并修复。模板链的GATC序列甲基化 MutH仅切割新合成的DNA链 MutH的切口位于错配核苷酸的5侧，使用外切酶或RecJ，按53方向降解DNA；切口位于错配的3侧，则使用外切酶，按3 5方向降解DNA。DNA聚合酶填补所产生单链DNA缺口

11、。MSH（MutS homologs）蛋白与MutL同源的MLH和PMS蛋白真核细胞错配修复系统无MutH，也无半甲基化标记母链。错配修复系统利用冈崎片段连接前的DNA缺口辨别错配碱基所在的DNA链。真核细胞核苷酸修复错配系统：三、DNA严重损伤时需要重组修复 同源重组修复(homologous recombination repair)发生在同源DNA序列之间的重组修复，在重组酶作用下受损DNA与其姐妹链交叉互补，并以结构正常的两条DNA链为模板重建损伤链，然后解开交叉互补、连接新合成的链，完成同源重组。参与该过程的蛋白包括：Rad51, Rad51B，Rad51C, Rad51D, Rad

12、52, XRCC2, XRCC3, MRN复合物等。同源重组修复非同源末端连接的重组修复（non-homologous end joining recombination repair) 是哺乳类动物细胞DNA双链断裂的一种修复方式，两个DNA分子的末端无需同源性就能连接起来。也是一种生理性基因重组策略，将原来并未连接在一起的基因或片段连接产生新的组合， 如B细胞、T细胞的受体基因，免疫球蛋白基因的构建和重排等。 四、某些修复发生在跨越损伤DNA的复制事件之后 重组跨越损伤修复当DNA链的损伤较大、无法作为模板复制时，细胞利用同源重组的方式，将DNA模板进行重组交换，使复制能够继续下去。合成跨

13、越损伤修复DNA双链发生大片段、高频率损伤时，细胞可以紧急启动应急修复系统，诱导产生新的DNA聚合酶替换损伤位点的DNA PolIII，在子链上以随机方式插入核苷酸以使复制继续，越过损伤部位后，再由DNA PolIII继续复制。这种复制出错率很高，是大肠杆菌SOS修复的一部分。重组修复至少需要4种酶组分： 重组基因recA：编码一种分子量为40000的蛋白质，它具有交换DNA链的活力，recA蛋白被认为在DNA重组和重组修复中均起关键作用。 recB、recC基因分别编码核酸外切酶V的两个亚基。 此外，修复合成还需要DNA聚合酶和连接酶。1将健康母链与缺口部分交换重组蛋白（RecA、RecB、

14、RecC等）参与。健康母链：同一细胞内已经完成复制的链或来自亲代的一条链。2健康母链缺口的填补 原核细胞中，SOS修复反应是由RecA蛋白和LexA相互作用引发的，有近30个“SOS”相关基因编码蛋白参与此反应。正常情况下，RecA以及其他“SOS”可诱导基因的转录被LexA蛋白阻遏，仅少量表达。DNA严重损伤时，RecA蛋白被激活并水解LexA蛋白，LexA蛋白从RecA和“SOS”相关基因的操纵序列上解离下来，被抑制基因得以表达，参与“SOS”修复活动。修复完成后，LexA蛋白重新合成，重新关闭一些相关基因的表达。SOS修复中LexA-RecA操纵子的作用机制 DNA损伤和修复的意义The significance of DNA damage and repair第三节一、DNA损伤具有双重效应 一是给DNA带来永久性的改变即突变，可能改变基因的编码序列或者基因的调控序列；二是DNA的这