增强型绿色荧光蛋白与单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶共表达质粒

1、 增强型绿色荧光蛋白与单纯疱疹病毒型胸苷激酶共表达质粒载体的构建及其在肝癌细胞株HepG2中的表达唐勇基金项目 本课题受国家自然科学基金资助 基金编号（30872977）作者单位：重庆医科大学附属第二医院肝胆外科，重庆，400010唐勇,男 ,27岁 ,重庆医科大学在读硕士，联系电话-mail：tangyong_2222通讯作者：刘长安，E-mail：liuchanganys 周世骥 蒋金伟 刘作金 刘长安重庆医科大学附属第二医院肝胆外科 重庆 400010摘要 目的：构建增强型绿色荧光蛋白与单纯疱疹病毒型胸苷激酶基因的真核共表达质粒载体pIRES2-EGFP-TK，

2、并鉴定其在肝癌细胞株HepG2中转染和表达。为肝癌靶向基因治疗提供实验依据。方法：从含有目的基因cDNA的 质粒PORF-HSV1-TK 中获得HSV1-TK基因片段，连接到载体pIRES2-EGFP上，得到重组质粒pIRES2-EGFP-TK并进行鉴定、测序。将重组质粒用脂质体法转染肝癌细胞株HepG2，荧光显微镜下观察EGFP在细胞内的表达，RT-PCR检测TK的mRNA表达水平，Western blotting法检测TK蛋白表达情况，G418筛选出阳性克隆。结果：重组克隆载体内的TK序列与GeneBank报告的序列完全一致。肿瘤细胞转染后在荧光显微镜下可观察到有绿色荧光出现，G418筛选

3、的最佳浓度为600mg/L , TK的mRNA表达水平高， TK蛋白有明显表达。结论：本实验成功构建EGFP和TK真核共表达载体，在肝癌细胞能有效的表达。关键词 肝癌；绿色荧光共表达表达载体；HepG2肝癌细胞；单纯疱疹病毒I型胸苷激酶Construction and expression of enhanced green fluorescent protein and HSV1-TK co-expression vectorYong Tang ,Shi-Ji Zhou,Jin-Wei Jiang,Chang-An Liu Department of Hepatobiliary Surger

4、y from the second affiliated hospital, ChongQing Medical University, ChongQing 400010，ChinaAbstract：Objective：To construct EGFP and HSV1-TK co-expression vector and to detect its expression level in hepatoma carcinoma cell line HepG2, and thus to provide experimented bases for the target gene therap

5、y of liver cancer. Methods：HSV1-TK gene was isolated from pORF-HSV1TK plasmids and cloned into eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFPThe recombinant plasmid pIRES2-EGFP-TK was identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. Then recombinant plasmid was transfected into hepato

6、ma carcinoma cell line HepG2 by liposome reagent，and the expression of EFGP in cell were observed by fluorescence microscopy , TK protein and mRNA was analyzed by Western blotting and RT-PCR respectively Results：The sequence of the cloned DNA fragment was identical to HSV1-TK that was reported on Ge

7、ne bankThe recombinant expression plasmid was successfully transfected into HepG2 cell line, and green fluorescent was observed under fluorescent microscope, positive clones were picked out by G418 screening. The optimal G418 screening concentration was 600g/L.The mRNA expression level of TK was hig

8、h and its protein expression was found. Conclusion：The recombinant eukaryotic co-expression vector of EGFP and HSV1-TK was successfully constructed and effectively expressed in HepG2 cell line.Key words Hepatocarcinoma; EGFP expression vector; HepG2 cell; HSV1-TK原发性肝细胞癌(Primary hepatocellular carcin

9、oma，PHC)是一种常见的恶性肿瘤，我国肝癌发病率居世界之首,虽然治疗手段不断进步，但是总体效果不太理想。最近兴起的肝癌自杀基因治疗被认为是最有前景和挑战的治疗手段，其中单纯疱疹病毒型胸苷激酶基因丙氧鸟苷(HSV1-TKGCV)系统是研究得最早、最成熟的自杀基因疗法1，其原理是向肿瘤细胞导入HSV1-TK基因载体，通过表达其编码的胸苷激酶，将低毒的抗病毒药物更昔洛韦(GCV)磷酸化，阻碍细胞DNA的合成，从而杀灭被转染的肿瘤细胞，同时还通过旁观者效应杀伤临近未转染的肿瘤细胞2,3。但是由于缺乏特异性的靶向转载系统和稳定的基因表达载体，应用受到限制。本实验目的在于构建含有目的基因(HSV1-T

10、K)及报告基因增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）和氨基糖苷类抗生素G418抗性基因（neo）的真核共表达载体，使阳性转染细胞稳定的表达胸苷激酶，并方便地对转基因细胞进行筛选和检测。为肝癌的靶向基因治疗提供试验依据。1 材料和方法1.1 材料含目的基因HSV1-TK的质粒pORF-HSV1-TK和含增强型绿色荧光蛋白基因及G418抗性基因的质粒pIRES2-EGFP购置于invitrogen公司，Sal I和BamH I等限制性内切酶，T4DNA连接酶购于TaKaRa公司，TRIZOL Reagent RNA分离液、脂质体Lipofectamine 2000购自invitrogen公司， 质粒小

11、抽试剂盒、PCR切胶回收试剂盒购于加拿大BBI公司。RPMI 1640培养基为美国Gibco公司产品，新生小牛血清为杭州四季青公司产品，GCV为Sigma公司产品，RT-PCR试剂盒为美国Promega公司产品。HepG2人肝癌细胞由重庆医科大学超声医学影像学研究所惠赠。1.2方法1.2.1pIRES2-EGFP-TK真核共表达载体的构建从GenBank中查到HSV1-TK的cDNA序列，借助Premier5.0软件辅助设计上游引物P1：TKF：ACGCGTCGACATGGCCTCGTACCCCGGCCATCAACAC和下游引物P2：TKR：CGCGGATCCTCAGTTAGCCTCCCCCA

12、TCTCCCGGG，下划线部分为设计的酶切位点，下划线上游为保护碱基，引物由赛百盛生物公司合成。以pORF-HSVTK质粒为模板，用上游引物TKF与下游引物TKR进行PCR扩增，PCR条件为：94预变性2min；进入循环：94 30s，65 45s，72 1.5min，30个循环后再72延伸10min。PCR 扩增产物在1%琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯下观察电泳结果并拍照。采用DNA快速回收试剂盒，玻璃奶法回收约1.2kb的目的HSV1-TK片段, 然后将回收的HSV1-TK目的基因片段和pIRES2-EGFP空载体进行酶切处理，酶切处理产物的回收方法同前。将回收后的已酶切处理目的片段和pIRE

13、S2-EGFP空载体用DNA连接酶定向连接。将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，涂布于相应抗性的LA平板培养12-16小时，待菌落长出后，挑选阳性克隆小抽提取质粒，再用Sal I和BamH I酶切鉴定，并由TaKaRa公司测序。1.2.2细胞培养及质粒转染将培养的HepG2肝癌细胞以1107个/孔接种到6孔板上，加入含10%小牛血清和双抗的新鲜培养基培养24小时，随机分为空质粒组和pIRES2-EGFP-TK组。观察细胞融合度在50%-70%时，更换新鲜无血清无双抗培养基,将质粒与脂质体按照体积比1：3混合，每孔加入质粒1ug，转染4小时后换成新鲜含双抗血清培养基RPMI 1640，24h，

14、48h后荧光显微镜下观察荧光。1.2.3细胞中的HSV1-TK转录水平mRNA表达的检测转染48小时后，收集各组细胞，使用trizol(总RNA提取试剂)按照说明书上步骤操作从细胞中分离和纯化细胞RNA，按照TK的序列设计合成TK上游引物CAGCAAGCCACGGAAGT和下游引物CGCACCGTATTGGCAAGTAG，Actin上游引物为GTGGACATCCGCAAAGAC,下游引物为GAAGCATTTGCGGTGGAC（引物由北京博迈德科技发展有限公司合成）。按如下反应体系Template 1ug,primer 1 0.1ul,primer2 0.1ul,2Master Mix 12.5

15、ul,ddH2O补至25ul。PCR条件为：94预变性3min；进入循环：94 30s，55 30s，72 1min，30个循环后再72延伸5min。反应结束后取5ul反应产物1 %琼脂糖凝胶进行电泳检测。1.2.4 细胞中的TK蛋白表达的检测收集细胞的总蛋白，-20保存。免疫印迹法检测TK蛋白，步骤为：40ml/L浓缩胶，100ml/L分离胶，预染蛋白Marker 3.0ul，样本总蛋白20ug/孔，加样至100ml/L SDS中电泳60V，30min后改电压为100V，90min至溴酚蓝跑至胶最下面时取胶，同步化将蛋白转移至PVDF膜，20V、50min。转膜后以50ml/L脱脂奶粉TBS

16、T室温下封闭4h；加入一定浓度的一抗孵育室温2h后,4过夜。TBST洗膜3次，15min/次，加入适当浓度的结合HRP的二抗（1：5000）孵育，室温下轻摇2h，洗膜、化学发光法显影、曝光。1.2.5 G418筛选浓度确定及转基因细胞的筛选按肝癌细胞以1106个/孔接种到培养板上，加入新鲜培养基培养24h，将培养基RPMI 1640与G418配成01000mg/L共12个浓度级别，隔日换液，连续培养10d，以710d 90%细胞致死量为筛选浓度，确定600mg/L为最佳筛选浓度。转染后的HepG2肝癌细胞用浓度为600mg/L G418连续培养2wk，大部分未转染的HepG2细胞死亡，改用30

17、0mg/L G418、含10%小牛血清和双抗的RPMI 1640培养基，转染重组质粒的HepG2细胞逐渐形成克隆。统计学处理 采用SPSS13.0统计软件分析，数据以meanSD表示， P0.05表示差异有统计学意义。2.结果2.1 pIRES2-EGFP-TK酶切及序列测定pORF-HSV1-TK质粒经PCR扩增后，PCR 扩增产物在1%琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯下观察电泳结果并拍照（图1）。结果提示与GeneBank 所示TK分子量完全吻合,均为1128bp。经过酶切，连接反应，TK基因全编码序列被定向克隆入质粒载体pIRES2-EGFP的SalI 和BamHI两酶切位点间。然后对重组质粒

18、pIRES2-EGFP-TK进行SalI+BamH I双酶切鉴定(图2)。2.2 空质粒组和转染组中EGFP的表达重组质粒pIRES2-EGFP-TK组和空白质粒pIRES2-EGFP组脂质体法转染肝癌细胞株HepG2，24h和48h后。在荧光显微镜下观察荧光，均可以见到特异性绿色荧光（图3、图4）。两组荧光的强度没有明显的差异。说明目的基因对EGFP表达没有影响。2.3 TK蛋白及mRNA的表达Western blotting 检测，结果显示pIRES2-EGFP-TK质粒组在53kd处有单一条带（图5、表1），而空白质粒对照组几乎看不到条带，两组比较有显著差异（p0.005）；RT-PCR

19、检测显示TK mRNA明显增加，在420bp处出现条带，而空白质粒组几乎没有条带出现，两组比较有显著差异（p0.005）,说明导入的基因在蛋白水平得到表达，电泳结果如下（图6、表1）。3讨论肿瘤的基因治疗，已经成为继传统的手术切除，放射治疗，化学药物治疗等治疗方法之后一种新的抗肿瘤治疗措施。自杀基因治疗是肿瘤基因治疗中最有成效的方案之一。其旁杀作用强大，有研究显示即使10%的肿瘤细胞被转染就可杀灭整个肿瘤组织4。基因克隆时选择适合的载体是关键，同时载体是基因转染、表达的关键。理想的肿瘤基因治疗载体必须具有高度靶向性，高转染效率及低免疫原性，并且要求安全性好且操作简便。目前肝癌基因治疗实验中常用

20、的载体系统有病毒和质粒，虽然病毒载体感染效率高，但由于病毒可能会在体内复制，非特异地感染正常肝细胞，引起强烈的炎症反应造成细胞毒性，或发生插入突变及补体介导的病毒失活，影响目的基因的长期稳定表达5,6，应用受到限制。我们所选用的质粒载体pIRES2-EGFP除没有上述病毒质粒的缺点外，兼备克隆和真核表达功能，其分质量仅5.3kb，能在细菌中稳定的存在并有较高的拷贝数，具备报告基因和筛选基因，转染真核细胞后能被方便的地检测和筛选。在外源基因转录活性的研究中，报告基因发挥着极其重要的作用，绿色荧光蛋白基因是目前唯一能在细胞内表达且不需要其他外源底物参与的报告基因7。本实验采用的pIRES2-EGF

21、P真核表达载体含有EGFP编码序列，其荧光强度比普通荧光（GFP）强35倍8。增强型绿色荧光蛋白无种族特异性且无需抗体，辅助因子或酶底物等其他介质的辅助即可在活细胞及已固定的细胞样品中直接在荧光显微镜下观察检测。故EGFP越来越多地被用于基因转染的相关研究中。本研究转染后24h及48h均观察到荧光，证明真核表达载体已经成功导入靶细胞中并开始转录和表达。而neo序列为氨基糖苷类抗生素抗性编码序列，当质粒转染成功后可用G418筛选稳定表达细胞系。本研究所采用的pIRES2-EGFP真核表达载体有EGFP标签并且在多克隆位点（MCS Multiple cloning sites）与EGFP编码区之间

22、有内部核糖体进入位点（Ternal ribosome entry site,IRES）9,它们相连并处于巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）启动子的调控之下，因此克隆入MCS的基因和EGFP能分别同时表达，而产生非融合蛋白，而彼此不影响各自的表达。根据荧光显微镜下绿色荧光的存在可确定目的基因得到表达。另外，质粒还含有高效增强子SV40，是能促进基因转录活性的顺式作用元件；而在EGFP基因的下游存在定SV多聚腺苷酸加尾信号能指导双顺反子mRNA 3端的加工，有效提高目的基因的表达和稳定遗传。本实验利用基因克隆技术构建了含绿色荧光蛋白与TK的真核共表达质粒pIRES2-EGFP-T

23、K,然后利用脂质体法转染HepG2肝癌细胞，可观察到荧光表达，TK mRNA及TK蛋白检测，证明胸苷激酶得到表达，增强绿色荧光蛋白与单纯疱疹病毒型胸苷激酶基因的真核共表达质粒载体，可为肝癌的靶向基因治疗研究提供很好的实验基础。表1两组质粒转染细胞后TK mRNA及蛋白表达(IODTK/IOD-actin，n=3，s）分组TK mRNATK蛋白空白质粒pIRES2-EGFP组0.0720.0690.0140.069重组质粒pIRES2-EGFP-TK组3.0250.069a1.6110.013ba：P 0.005,两组TK mRNA比较； b：P 0.005，两组TK蛋白比较图片如下： 图1：M

24、，DNA maker；1、2均为对质粒pORF-HSV1-TK PCR扩增后所得目的基因片段进行电泳结果，与GeneBank查到的tk大小相符。图2 M, DNA maker;1、2、3、4、6均为重组质粒pIRES2-EGFP-TK经SalI+BamH I双酶切产物酶切结果琼脂糖电泳分析产物与HSV1-TK吻合 图3：重组质粒pIRES2-EGFP-TK转染HepG2肝癌细胞株，在荧光显微镜下观察荧光。24h （400） 图4：空白质粒pIRES2- EGFP转染HepG2肝癌细胞，在荧光显微镜下观察荧光，24h （400）1，空白质粒pIRES2-EGFP组TK表达情况； 2，重组质粒pI

25、RES2-EGFP-TK组TK表达情况，以-actin为内参照，结果显示TK蛋白有明显表达。图5 Westernblot测定两组TK蛋白表达M：DNA ladder；1道：空白质粒pIRES2-EGFP组；2道：重组质粒pIRES2-EGFP-TK组，结果在420bp处重组质粒组有清晰条带显示图6 RT-PCR测定两组TK mRNA的表达参考文献1 Nicholas TW,Read SB,Burrows FJ,et al.Suicide gene therapy with herpers simplex virus thymidine kinase and ganciclovir is enh

26、anced with connexins to improve gap junctions and bystander efectsJ.Histol Histopathol,2003,18(2):4952Asklund T,Appelskog IB,Ammerpohl O,et al.Gap junction mediated bystander effect in primary cultures of human malignant gliomas with recombinant expression of the HSV/tk gene J.Exp Cell Res,2003,284(

27、2):1853 Hadaczek P,Mirek H,Berger MS,et al.Limited efficacy of gene tansfer in herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir gene therapy for brain tumors J.J Neurosurg 2005,102(2);3284 Qian C，Idoate M，Bilbao R，et a1Gene transfer and therapy with adenoviral vector in rats with diethylnitrosamine induced hepatocellular carcinomaJHum Gene Ther，1997，8(3)：349-3585 Iizuka T,Kanzaki