牙周膜成纤维细胞培养

1、我的细胞培养计划1、培养目的：人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligamentfibroblasts,PDLFs）是牙周组织修复与重建的前体细胞之一.，在牙周病病理变 化和转归中起着重要作用。因此，希望通过较简单的实验方法能较容 易地培养出生长状态良好的牙周膜成纤维细胞,为研究牙周膜的生物 学特点及各种与牙周膜成纤维细胞相关的实验研究提供较好的体外 模型。2、实验室条件：超净工作台、培养箱、倒置显微镜、冰箱、冷冻保存装置、细胞计数 板和电子细胞计数仪、离心机、PH计、天平、水纯化装置、高压蒸汽 消毒装置、电热干燥箱、过滤除菌装置、手术器械、培养器皿、移液 器、特殊用具、

2、杂用品。DMEM培养基，胶原酶，胰蛋白酶，小牛血 清，ABC免疫组化试剂盒。3、培养方法：1） 、培养基：DMEM培养基，内含10%小牛血清、青霉素100u/ ml、 链霉素100Lg / ml。2）具体操作方法及步骤（按实际操作分步列出）；选择12岁25岁因正畸或阻生拔牙患者，X线显示无根尖病变，无 骨质吸收，牙龈正常，主诉该牙无既往病史。在拔牙过程中不增隙也 不使用牙挺，拔除后，用消毒刮匙刮取拔牙创骨壁中部的牙周膜， 将刮取的牙周膜立即放入盛有培养基的无菌瓶中，送往实验室处理。3）、组织块的冲洗：在洁净工作台上用含双抗（青霉素100u/ml,链 霉素100Lg / ml ）的HANK. S

3、液反复冲洗3次尽量去除组织块上 附着的血污等其它杂质和细菌。4）、PBS冲洗2次后，加入0.125%胰蛋白酶及0. 1%胶原酶5ml, 37C 振荡下消化3060min。镜下观察，组织松散、大部分细胞游离时，用 吸管吹打使其彻底分散。将消化的细胞悬液经190目筛过滤，收集并 离心（1000 r / min, 10 min）,弃去上清液。5）、加入含10%小牛血清的DMEM培养基，充分吹打细胞悬液，血细 胞计数板计数，将细胞按4 X 105 /瓶接种于25cm2培养瓶，加入4 mlDMEM培养基，内含10%小牛血清、青霉素100u/ ml、链霉素 100Lg / ml,于二氧化碳孵箱内培养。培养

4、条件为5%CO2、95%空气、37C、饱和湿度。待细胞贴壁后，隔日换液。4、注意事项：1）、在收集标本，供体年龄越小越易取得成功，标本要新鲜并及时 处理。在刮除牙龈1/3牙周组织以避免污染的情况下，要彻底刮下中 2/ 3剩余牙周组织，以防止牙周膜细胞成分的丢失。2）、在消化时间上应根据组织块的大小采用不同的消化时间。本 实验采用0.1%胶原酶和0. 125%胰蛋白酶联合消化约50min左右，显 微镜下密切观察组织消化情况，及时收集细胞，消化时间过长，将 会影响细胞贴壁及成活率。3）、在细胞贴壁方面，通常原代细胞贴壁速度较慢，可通过:a.培 养瓶胶原涂膜；b.在培养瓶内盛有少量培养基并预先1、2

5、天放置二 氧化碳孵箱内，使用前吸出培养基，以改善瓶壁表面性状；c.使用 进口一次性塑料培养瓶（Nunc, Danmark）等方法，可提高牙周膜细 胞成活及贴壁速度。静置培养，在原代培养最初接种24小时内，细 胞尚未完全贴壁或刚贴壁，不可轻易震动培养瓶，以防止刚贴壁的 细胞重新漂浮。4）、由于细胞比较娇嫩,制备单细胞悬液过程中要求操作轻、稳，吹 打时忌产生气泡。另外整个制备单细胞悬液过程在冰上进行，能更好 地保持细胞活力。5）、一定要注意无菌操作。5、目的细胞的鉴定方法：1）、细胞形态学观察倒置显微镜下牙周膜成纤维细胞呈星形、长梭形，胞体丰满，胞浆均 匀，核圆形或卵圆，核仁清晰。2）、免疫组化染色观察牙周膜成纤维细胞波丝蛋白染色阳性，细胞胞浆棕黄色着色，角蛋 白染色阴性，证实该细胞为中胚层来源。6、困难及解决办法：1）、刮离牙周组织要彻底，操作过程中动作轻柔。2）、在实验准备阶段器清洗器械时要细致认