工业微生物产生菌的分离筛选课件

1、第六章 工业微生物产生菌的分离筛选 菌株分离：就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。 工业微生物产生菌的筛选包括两部分：（1）从自然界分离（2）野生菌株进一步纯化并进行代谢产物的鉴定收集和筛选的途径：（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。（2）由自然界采集样品，从中进行分离筛选。（3）从一些发酵制品中分离目的菌株 。1. 国内重要菌种保藏机构2. 国外重要菌种保藏机构白霉奶酪 法国蓝纹绵羊奶酪大孔奶酪其臭不亚于臭袜子的“戈达” 菌种的分离和筛选一般可分为采样、富集、分

2、离、产物鉴别这几个步骤。 分离的目的新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。 污染的芽孢杆菌 第一节 含微生物样品的采集采样对象： 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。一、土壤中采样 土壤是人类最丰富的菌种资源库。 一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）放线菌（

3、107）霉菌（106）酵母菌（105）藻类（104）原生动物（103）， （一）根据土壤特点1、土壤有机质含量和通气状况 耕作土、菜园土、津郊土壤；森林土，采土样最好的土层是525cm。一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。2、酸碱度和植被状况 偏碱的土壤（pH7.07.5）环境，适合于细菌、放线菌生长。反之在偏酸的土壤（pH7.0以下）环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。3地理条件 南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多，特别是热带和亚热带地区的土壤。 4季节条件 夏季到秋季，约有710个月处在较高的温度和丰富的植被下，土壤中微生物数量比任何时候都多

4、，因此，秋季采土样最为理想。 （二）采样方法 用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取525cm处的土样1025g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在1030cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。 二根据微生物生理特点采样1. 根据微生物营养类型森林土 纤维素酶产生菌 ；肉类加工厂附近和饭店排水沟 蛋白酶和脂肪酶的产生菌；面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂 蛋白酶、糖化酶的菌株 ；蜂蜜、蜜饯、甜果 酵母；. 根据微生物的生理特性高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采

5、集样品；分离低温酶产生菌时可到寒冷的地方，如南北极地区、冰窖、深海中采样；分离耐压菌则通常到海洋底部采样。 三、特殊环境下采样1局部环境条件的影响海鞘、海参体内的微生物可产生具有细菌毒性和杀菌活性的化合物。从海绵体内的共生或共栖的细菌中分离到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物质。深海鱼类肠道内的嗜压古细菌，80%以上的菌株可以生产EPA 和DHA；从鳕鱼肠道中分离到一株pj20细菌，产EPA14.78mg/L ； 得克萨斯州中南部的一个岩洞中存在着大量嗜碱性的，能进行氨氧化和产几丁质酶的微生物，其原因是这里生活这2000万只蝙蝠，其排泄物造成了洞内10m深的丰富营养层，这种特殊的环境对该种微生物起了选择

6、和富集的作用。 从考拉(Koala)熊肠中也曾分离到萜烯分解酶的产生菌 2极端环境条件的影响 生活在极端环境中的微生物具有不同与一般微生物的遗传特性、特殊结构和生理机能 ，可以产生一些特殊的代谢产物和酶制剂。 如嗜冷菌低温酶； 嗜热菌高温酶； 嗜碱菌碱性蛋白酶 海洋是新抗生素的重要来源。许多海洋生物体内都含有微生物，这些微生物为宿主抵御病害起着关键作用。因此，从鱼组织和虾消化道里分离筛选抗癌药物和抗炎症药物是一个有效地途径。 第二节 含微生物样品的富集培养 富集培养：是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特性设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适环境下迅速生长繁殖，数

7、量增加，由自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种以利分离到所需要的菌株。 富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。一般可从以下几个方面来进行富集。一、控制培养基的营养成分 在增殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。 如: 分离水解酶产生菌以相应底物为惟一碳源 。 分离耐高渗酵母菌培养基中30%40%葡萄糖 连续富集培养 如以苯胺作惟一碳源对样品进行富集培养，待底物完全降解后，再以一定接种量转接到新鲜的含苯胺的富集培养液中，如此连续移接培养数次。同时将苯胺浓度逐

8、步提高，便可得到降解苯胺占优势的菌株培养液，采用稀释涂布法或平板划线法进一步分离，即可得到能降解高浓度苯胺的微生物。 二、控制培养条件控制pH：中性细菌；酸性酵母，霉菌控制培养温度；低温嗜冷菌；高温嗜热菌；控制氧气；通气培养好氧菌；静置培养厌氧菌。 三、抑制不需要的菌类 通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到富集的目的。 高温处理抑制不产芽孢菌； 胆盐和十二烷基磺酸钠抑制革兰阳性菌 ；硫乙醇酸钠 抑制好氧菌；四环素等抗生素抑制细菌 ；重铬酸钾抑制土壤真菌、细菌 。第三节 微生物的分离 虽然在进行富集以后，目的微生物得到了增殖，占了优势，但其

9、他微生物只是数量上的减少，并未死亡，也非纯种。一、好气微生物的分离粗放：菌落纯细化：菌株纯、细胞纯（一） 稀释涂布法（二）划线分离法（三）利用平皿的生化反应进行分离1、透明圈法 混浊底物被分解后形成透明圈。如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶、有机酸等。 2、变色圈法：直接用显色剂或指示剂淀粉酶变色圈试验变色圈大的为淀粉酶高产菌落果胶酶：刚果红（绛红色水解圈）谷氨酸：溴百里酚兰（pH 6.2以下为黄色， pH 7.6以上为蓝色）内肽酶：吲羟乙酸酯被产酶菌落水解为3-羟基吲哚，后者氧化成蓝色物质）乙醇：蓝色的盐类物质在醇脱氢酶和NAD作用下反应产生电子脱色，形成淡白色晕圈。3、生长圈法 用于分离筛选

10、氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。 利用某些具有特殊营养要求的微生物（营养缺陷型菌株）作为工具菌，要分离的微生物能在一般培养条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长，形成生长圈 。 如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。 4. 抑菌圈法 常用于抗生素产生菌的 分离筛选。 如青霉素菌种选育。 检验菌：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。（四）组织分离1. 对一般有病组织的分离方法 清洗组织表面0.1升汞表面消毒无菌水冲洗适宜温度培养挑取菌落2. 食用菌孢子分离方法（1）组织块分离法：组织块切小块，斜面直接培养。（2）多孢子分离

11、：表面消毒，孢子采集。（3）单孢子分离：收集到的孢子稀释涂布培养。（五）单细胞或单孢子分离法 采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养 。1、显微挑取法2. 小滴分离纯化培养法（六）特殊菌类环保降解菌的分离 多环芳烃、有机染料和颜料、表面活性剂、农药、酚类和卤代烃。分离筛选这类物质的降解微生物时，通常采用以该物质为唯一碳源或氮源的培养基进行富集培养。 注意有些有毒污染物降解菌因本身对微生物生长就有抑制作用，所以应该根据不同情况设计合理的筛选模型。加拿大16岁的高中生丹尼尔伯德 加拿大年仅16岁的高中生丹尼尔伯德通过潜心研究，发现通过一种神奇的假单细胞菌，可以将塑

12、料袋的自然降解过程从最多上千年缩至短短3个月！二、通过控制营养和培养条件进行分离1、营养成分 各种微生物对碳源、氮源的需求不同。 分离放线菌，使用HV（腐殖酸维生素）琼脂培养基、土豆-胡萝卜水汁液培养基和淀粉琼脂培养基。 筛选水解酶产生菌时，通常利用以底物为惟一碳、氮源的平板进行分离。 2、pH 细菌放线菌偏碱、霉菌酵母偏酸。 培养基种碳氮比（C/N）偏高，则培养后倾向于酸性，偏低则倾向于碱性。 例如，分离柠檬酸产生菌的黑曲霉，就是利用调节培养基的酸碱度获得成功的。其分离方法是：取红芋粉醪20%、柠檬酸10%20%配成培养液，调节pH2.02.5，以一定量的培养基和土样均匀混合，用毛细吸管点种

13、在平皿内事先覆盖的无菌滤纸上（23层），于30培养，这样可以分离到产生柠檬酸的黑曲霉。 3、排除不需要的菌类 细菌：加制霉菌素 放线菌：加SDS；氟哌酸 + 制霉菌素 + 青霉素 霉菌和酵母：青霉素、链霉素、四环素 根霉和毛霉：加去氧胆酸钠或山梨醇防止菌丝蔓延4、控制温度 高温微生物（5060 ）； 中温微生物（2040 ） ； 低温微生物（15 或更低）三、厌气菌的分离（一）加还原剂： 分离培养基内加入还原剂，如半胱氨酸、D型维生素C、硫化钠等。培养皿于置于事先已抽真空密闭的容器内（充CO2或N2也可）培养。 （二）焦性没食子酸法 焦性没食子酸和NaOH互相反应除去氧气。 除去100ml空气

14、中的氧气需要焦性没食子酸固体1g和10%NaOH溶液10ml。 （三）平皿厌气培养法 无菌培养皿一套，在皿盖内到上分离培养基，凝固后，皿底一侧放焦性没食子酸固体，另一侧放10% NaOH溶液，使二者不相接触。分离操作后，摇动平皿使焦性没食子酸固体和NaOH溶液混合，发生化学反应，除去皿内的氧气。 培养基焦性没食子酸NaOH（四）试管厌气培养法1. 穿刺培养法：用两头开口的试管，接种后密封培养，分离时用无菌玻璃棒将橡皮塞和固体培养基一起挤出来。2. 滚管法：用橡胶塞密封的试管，通入氮气除氧，然后加入将培养基融化，冷却到45，将分离样品混入，在冷水中滚管，管内壁形成培养层，长出菌落后挑出。（五）玻

15、璃板隔绝空气培养法 平板培养基接种后，立即用比培养皿小的无菌玻璃板盖上，培养基与玻璃板贴紧，形成缺氧区域。（六）生物吸氧法 利用植物，如发芽旺盛的燕麦、大麦的呼吸，消耗培养容器中的氧气。第四节 野生菌株的筛选和目的产物的鉴别 在目的菌株分离的基础上，进一步通过筛选，选择具有目的产物合成能力相对较高的菌株。一、初筛 是从大量分离到的微生物中将具有合成目的产物的微生物筛选出来的过程。 1. 平板筛选 2. 摇瓶发酵筛选 1. 平板筛选（1）筛选碱性蛋白酶，可点样接种至平板培养基上，培养后测量水解圈和菌落直径的比值来衡量酶活力的大小。（2）筛选谷氨酸产生菌，将分离的菌落用打孔器转移到灭菌过的滤纸上，放置一段时间，菌落产生的谷氨酸会渗透到滤纸上，移走菌落后，喷上茚三酮显色，出现的色圈以及大小可判断是否产谷氨酸以及产量高低。2. 摇瓶发酵筛选 经过平板定性筛选的菌种可以进行摇瓶培养，一般一个菌株接种一个三角瓶，在一定的转速和稳定的的摇床上振荡培养，得到发酵滤液后再进行活性测定。 活性测定最好采用简便的方法，如琼脂薄板法。二、复筛 通过初筛淘汰85