古典猪瘟检疫规程

1、古典猪瘟检疫规程1范围本标准规定了古典猪瘟临床诊断、实验室检测的技术规范。本标准适用于古典猪瘟病毒和抗体的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。G/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。D：边界病VD：牛病毒性腹泻CSF：古典猪瘟CSFV：古典猪瘟病毒FAT：荧光抗体试验FAVN：荧光抗体病毒中和试验FITC：异硫氰酸荧光素HRPO：辣根过氧化物酶IFA：免疫荧光实验NPLA：过氧化物酶联中和试验4临床诊断4.1流行病学CS

2、FV在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，-年四季均可发生。病猪、潜伏期和康复期带毒猪均能把病毒传播给易感猪。病猪是主要传染源，病猪排泄物和分泌物，病死猪及其脏器，急宰病猪的血、肉和内脏，废水、废料污染的饲料和饮水都可散播病毒。猪瘟主要通过接触传播，经消化道感染。此外，患病和弱毒株感染的母猪也可以经胎盘感染胎儿，产生弱仔猪、死胎、木乃伊胎等。急性病例在1周2周内死亡，亚急性和慢性病例，病程可长达2周4周，甚至数月。4.2临床症状CSFV在所有年龄猪中传播，典型症状为发热、倦怠、结膜炎、厌食、呕吐、腹泻、呆滞和步履蹒跚等。出现临床症状后数天，在眼、腹和大腿内侧会出现紫色斑点

3、。非典型症状则没有体温升高现象，但猪呈渐进性消瘦。4.3病理变化急性病例病理变化不明显或缺乏。典型病例淋巴结呈大理石样红色变化，心外膜、肾、膀胱浆膜、皮下和真皮下出血；亚急性和慢性病例，除有以上病变外，还会在胃肠道粘膜、会咽和喉粘膜中出现坏死性或“纽扣”状溃疡。根据流行病学、临床症状和病理变化可作出CSF的初步诊断，但确诊应经实验室试验。5实验室诊断5.1荧光抗体试验5.1.1仪器和试剂5.1.1.1荧光显微镜。5.1.1.2冷冻切片机。5.1.1.3CSFV荧光抗体结合物。5.1.1.4PBS（见A.1），实验用水应符合G/T6682规定。5.1.1.5碳酸盐甘油缓冲液（见A.2）。5.1.

4、1.6丙酮（分析纯）。5.1.1.7载玻片、盖玻片。5.1.2试验程序5.1.2.1取样取病猪的扁桃体、脾、肾等病料置冰箱内待检。每-试验都应设阳性和阴性组织样品切片作为对照。5.1.2.2样品处理在实验室内将样品组织块修剪出约1Cm1Cm0.5Cm的小块，不经任何固定处理，用冷冻包埋剂包埋或加上蒸馏水置于冰盒中，让组织块在冰盒中冷冻。5.1.2.3切片将组织块切成4m以下切片，置于10mm32mm-角切除的洁净盖玻片上。所有切片以相同的方式放置（如缺口朝右向上）。5.1.2.4固定置丙酮中室温固定10min或37空气干燥20min。5.1.2.5浸润将切片在PBS中浸润片刻，用吸水纸吸去多余

5、的水分，放在湿盒中的架子上。5.1.2.6加猪瘟荧光抗体结合物滴加工作浓度的猪瘟荧光抗体结合物到切片上，在密闭的湿盒中37作用30min。若需要加第二FITC结合物，置室温下2min，用PBS洗5次。然后滴加工作浓度的FITC结合物，在密闭的湿盒中37作用30min。室温下再用PBS洗5次，每次2min。5.1.2.7封片自然干燥后，用碳酸盐甘油缓冲液封片。荧光显微镜观察结果。5.1.2.8结果判定CSF阳性切片细胞胞浆内呈现亮绿或黄绿色荧光。在扁桃体隐窝上皮细胞、肾脏皮质远端及近端小管和髓质集尿管细胞、回肠腺体上皮细胞、脾脏动脉周围淋巴样鞘的类淋巴细胞等细胞的细胞浆内呈现亮绿色荧光的样品，可

6、判为阳性；细胞浆内无亮绿色荧光的样品为阴性；细胞浆内呈现弱的黄绿色荧光的样品为可疑；可疑结果经过重复试验，细胞浆内仍呈现弱的黄绿色荧光可判为阳性。5.2单克隆抗体免疫过氧化物酶试验5.2.1仪器和试剂5.2.1.1显微镜。5.2.1.2冷冻切片机。5.2.1.3HRPO结合CSF毒株、CSF疫苗株、BVD/BD毒株的3种特异性单克隆抗体。5.2.1.4HRPO结合的抗CSFV免疫球蛋白多克隆抗体。5.2.1.5染色底物（配制见A3）。5.2.1.65马血清。5.2.1.7丙酮（分析纯）、醋酸钠、吐温-80。5.2.1.8PBS（见A.1）。5.2.2试验程序5.2.2.1取样取8个或更多切成4

7、m的FAT阳性扁桃体冰冻切片，如果取不到扁桃体也可用其他阳性器官。5.2.2.2固定在丙酮中将切片用飞片法固定10min，空气中干燥。5.2.2.3HRPO-抗体结合物工作液的制备分别制备3种单克隆抗体HRPO结合物和多克隆抗体HRPO结合物工作液，稀释液为PBS（含0.01吐温-80和5马血清，PH7.6）。5.2.2.4加HRPO-抗体结合物用PBS冲洗切片，将单抗结合物工作液滴加到整个切片，每种单抗加2个切片，另2切片滴加多抗结合物工作液作为对照。湿盒中37作用60min。5.2.2.5洗涤用PBS洗板6次，每次10S。5.2.2.6加底物溶液室温下用新配置的染色底物溶液染色5min15

8、min。5.2.2.7洗涤和固定用0.05mol/l醋酸钠（PH5.0）溶液冲洗。蒸馏水冲洗后将切片固定在载玻片上。5.2.2.8观察光学显微镜下检查结果，扁桃体隐窝上皮细胞有暗红着色判为阳性。5.2.2.9结果判定结果判定见表1。表1CSFV野毒株、疫苗株和BVD/BD毒株的鉴别多克隆抗体特异性单克隆抗体判定CSF毒株CSF疫苗株VD/D毒株-CSF野毒-CSF疫苗毒-VD/D株-非CSF瘟病毒注：表示阳性，-表示阴性。5.3病毒分离试验5.3.1仪器和试剂5.3.1.1倒置荧光显微镜。5.3.1.2离心机。5.3.1.3二氧化碳培养箱。5.3.1.4恒温培养箱。5.3.1.5高压灭菌锅。5

9、.3.1.6EIGHTOn管，载玻片、盖玻片。5.3.1.7CSF荧光抗体，由指定单位提供。5.3.1.8CSF阳性、阴性参照血清，由指定单位提供。5.3.1.9PK-15细胞。5.3.1.10细胞稀释液（见A.4）。5.3.1.11细胞生长液（见A.5）。5.3.1.12细胞消化液（见A.6）。5.3.1.13碳酸盐甘油缓冲液（见A.2）。5.3.1.14丙酮（分析纯）。5.3.1.15PBS（见A.1）。5.3.2组织样品细胞培养免疫荧光试验程序5.3.2.1取样和样品处理取1G2G扁桃体等组织，切成小块放在灭菌洁净研钵中，加入少量灭菌的细胞培养液和灭菌砂，将其研磨匀浆，也可在4下用适宜的

10、捣碎机捣碎。5.3.2.2样品的稀释加入细胞稀释液，制成20（质量浓度）悬液。混合液置室温1H。5.3.2.3离心1000g离心15min，取上清液备用。5.3.2.4制备细胞悬液用细胞消化液消化培养3d4d的PK-15细胞，在显微镜下用细胞计数器计算细胞密度，而后用细胞生长液制成2106个细胞/ml的细胞悬液，置4备用。5.3.2.5接种9份细胞悬液与1份上清液（见5.3.2.3制备）混合，接种6支8支含盖玻片的EIGHTOn管或其他适宜的细胞培养瓶，每管接种1.0ml1.5ml混合液。另3支管只接种1.0ml1.5ml细胞悬液作对照。样品接种完成后，再用CSFV接种3支管作为阳性对照。仔细

11、操作避免该阳性病毒悬浮液引起的交叉污染。此外，还应设立CSFV阴性的细胞培养液对照管。5.3.2.6洗涤接种后1d、2d、3d分别将2管培养物及1管对照细胞用细胞稀释液或PBS洗涤2次，每次5min。5.3.2.7固定取出含有细胞的盖玻片，置于预冷的丙酮中固定10min，自然干燥。将细胞培养玻片在PBS液中浸润，用吸水纸吸去周边多余的水分，放入湿盒。5.3.2.8滴加工作浓度的犆犛犉荧光抗体滴加工作浓度的CSF荧光抗体到湿盒中的细胞培养玻片上（细胞培养玻片盖在滴加有PBS液的载玻片上）。37温箱中作用30min。5.3.2.9洗涤和封片室温下用PBS液洗5遍，每次2min。自然干燥后，用碳酸盐

12、甘油缓冲液封片，检查荧光。5.3.2.10结果判定细胞培养玻片标本上，成簇（约10个15个细胞）的细胞胞浆内呈现明亮的黄绿色荧光的样品为阳性；细胞浆内无黄绿色荧光的样品为阴性；细胞浆内呈现弱的黄绿色荧光为可疑；可疑结果需重复试验，细胞浆内仍呈现弱的黄绿色荧光的样品判为阳性。进行病毒分离时，可用平底微量滴定板或24孔板代替EIGHTOn管。微量滴定板的固定和染色方法与NPLA方法相同。如果2扁桃体悬液对细胞有毒性作用，则应将提高悬液稀释度或用其他器官重做。5.3.3全血或白细胞碎片分离病毒操作程序5.3.3.1取-20冻存的全血或白细胞碎片样品置37水浴融化。5.3.3.2在培养有PK-15单层

13、细胞的24孔板中接种300l血样；37吸附1H。5.3.3.3弃去接种液，用细胞稀释液洗涤细胞，然后加细胞生长液。5.3.3.4细胞板孵育3d4d后，如NPLA所述方法洗板、固定和染色，检查荧光。5.3.3.5按5.3.2.10判定结果。5.4荧光抗体病毒中和试验5.4.1仪器和试剂5.4.1.1倒置荧光显微镜。5.4.1.2二氧化碳培养箱。5.4.1.3恒温培养箱。5.4.1.4微量板振荡器。5.4.1.596孔微量细胞培养板。5.4.1.6PK-15细胞。5.4.1.7猪瘟THIVEVA弱毒冻干株，由指定单位提供。5.4.1.8CSF阳性、阴性参照血清，由指定单位提供。5.4.1.9CSF

14、荧光抗体，由指定单位提供。5.4.1.10细胞稀释液（见A.4）。5.4.1.11细胞生长液（见A.5）。5.4.1.12细胞消化液（见A.6）。5.4.1.13丙酮固定液（见A.7）。5.4.1.14PBS（见A.1）。5.4.2试验程序5.4.2.1取样和样品处理无菌取被检猪血液，分离血清，试验前血清56灭活30min。用于筛选阴性猪群的定性试验，用细胞稀释液将血清作1：5稀释；用于检测抗体的定量试验，用稀释液将血清作1：5的两倍连续稀释（1：5、1：10、1：20）；在国际贸易中，根据双边协议的要求稀释血清。5.4.2.2犘犓15细胞悬液的制备将细胞瓶中培养3d4d的PK-15细胞，用细

15、胞消化液进行消化，在显微镜下用细胞计数器计算细胞密度，而后用细胞生长液制成4105个细胞/ml的细胞悬液，置4备用。5.4.2.3病毒滴度的测定在96孔微量细胞板中每孔加入50l细胞培养液，用稀释液将冻存病毒作10-1、10-2、10-8稀释，每-稀释度病毒接种6孔，每孔50l，正常细胞对照6孔不加病毒，仅加稀释液。而后每孔加100lPK-15细胞悬液，置二氧化碳培养箱中37培养72H后收获，进行猪瘟荧光抗体染色试验，并按EEdMUEnCH法计算，判读荧光组半数感染量（TCID50）。5.4.2.4猪瘟犜犺犻狏犲狉狏犪犾病毒工作液的制备以细胞稀释液稀释原毒成含200TCID50实验病毒工作量。

16、5.4.2.5中和试验5.4.2.5.1在96孔细胞培养板上，A排各孔加入80l细胞稀释液，其余各排每孔加入50l稀释液，向A排各孔内加入20l被检血清，每个样品加3孔。5.4.2.5.2将被检血清混匀后吸出50l至排，依次倍比稀释至H排然后齐去50l，即血清稀释依次为1：5、1：10、1：201：640。5.4.2.5.3按滴定的病毒滴度，将病毒稀释成50l中含200TCID50的工作毒。向3孔中的2孔加入50l工作毒，另-孔加入50l稀释液，作血清毒性试验。盖上板盖，于微量振荡器上振荡2S后，置湿盒内，放37二氧化碳培养箱中和1H。5.4.2.5.4每孔加入100l已制好的细胞悬液，置37

17、二氧化碳培养箱中72H后收获，每天观察细胞的生长状况。5.4.2.5.5每次实验需同时作病毒回归（工作毒及其10-1、10-2、10-3、10-4稀释物）及阴性参照血清、阳性参照血清和正常细胞作为对照，每个对照做6孔。A）阴性血清对照：5倍稀释血清50l50l病毒工作液100l细胞悬液；）阳性血清对照：5倍稀释血清50l50l病毒工作液100l细胞悬液；C）细胞对照：100l稀释液100l细胞悬液；d）病毒用量滴定：1）病毒工作液200TCID50/50l50l稀释液50l细胞悬液100l；2）10-1病毒工作液50l稀释液50l细胞悬液100l；3）10-2病毒工作液50l稀释液50l细胞悬

18、液100l；4）10-3病毒工作液50l稀释液50l细胞悬液100l；5）10-4病毒工作液50l稀释液50l细胞悬液100l。5.4.2.6CSF荧光抗体染色试验5.4.2.6.1弃掉微量板中的培养液，并沿孔壁缓缓加入300lPBS洗2次，尽量甩干。5.4.2.6.2每孔加入20丙酮固定液100l，室温固定10min。然后尽量甩去固定液，置37培养箱中干燥3H。5.4.2.6.3每孔中加入CSV荧光抗体工作液50l，置湿盒中37作用45min后弃去。5.4.2.6.4用PBS洗3次，再以蒸馏水洗2次，室温干燥后，在倒置荧光显微镜下观察。5.4.2.6.5镜检记录：（-）无荧光；（）荧光微弱，

19、形态不清晰；（）荧光较亮，形态清晰；（）荧光较强，明亮闪烁，形态清晰。5.4.2.7结果判定5.4.2.7.1当阴性血清对照孔、样品血清对照孔和细胞对照孔细胞出现明亮的黄绿色荧光，而阳性血清对照孔细胞不出现荧光时，实验结果成立。病毒用量与原测定滴度相差应在0.3OG10范围内实验结果有效。5.4.2.7.2根据5.4.2.6.5记录的情况判定，结果以能抑制50的细胞出现荧光判为阳性，并以阳性最高血清稀释度的倒数来表示血清中和抗体滴度。5.5过氧化物酶联中和试验5.5.1仪器和试剂5.5.1.1倒置显微镜。5.5.1.2二氧化碳培养箱。5.5.1.3恒温培养箱。5.5.1.4微量板振荡器。5.5

20、.1.596孔微量细胞培养板。5.5.1.6PK-15细胞。5.5.1.7病毒：猪瘟THIVEVA弱毒冻干株，由指定单位提供。5.5.1.8CSF阳性、阴性参照血清，由指定单位提供。5.5.1.9抗猪IGGHRPO结合物，由指定单位提供。5.5.1.10CSF高免猪抗血清，由指定单位提供。5.5.1.11细胞稀释液（见A.4）。5.5.1.12细胞生长液（见A.5）。5.5.1.13细胞消化液（见A.6）。5.5.1.14丙酮固定液（见A.7）。5.5.1.15染色底物溶液。5.5.1.16PBS（见A.1）。5.5.2试验程序5.5.2.1取样和样品处理无菌采取被检猪血液，分离血清，试验前血

21、清56灭活30min。在国际贸易中，用细胞稀释液将血清作1：5稀释（终浓度1：10），或根据双边协议的要求稀释血清。5.5.2.2PK-15细胞悬液的制备将细胞瓶中培养3d4d的PK-15细胞，用细胞消化液进行消化，在显微镜下用细胞计数器计算细胞密度，而后用细胞生长液制成2105个细胞/ml的细胞悬液，置4备用。5.5.2.3病毒滴度的测定在96孔微量细胞板中每孔加入50l细胞培养液，用稀释液将冻存毒作10-1、10-2、10-8稀释，每-稀释度病毒接种6孔，每孔50l，正常细胞对照6孔不加病毒，仅加稀释液。而后每孔加100lPK-15细胞悬液，置二氧化碳培养箱中37培养72H后收获，进行猪瘟

22、过氧化物酶联试验，并按EEdMUEnCH法计算，判读半数感染量（TCID50）。5.5.2.4猪瘟ThivErvAl病毒工作液的制备以细胞稀释液稀释原毒成含200TCID50实验病毒工作量。5.5.2.5加样将血清稀释液加到微量板中，每个样品加两孔，每孔50l。胎牛血清应确保无VDV及其抗体。每个样品应设第3个含血清但不含病毒的对照孔，以检测血清的细胞毒性和（或）非特异性染色。5.5.2.6接毒每孔加50l已用生长液稀释到含200TCID50/50l的病毒悬液，在微量振荡器上混合20S。5.5.2.7孵育将微量板置于二氧化碳培养箱中37孵育1H。5.5.2.8加生长液每孔加50l含2105细胞

23、/ml的生长液。细胞在5二氧化碳的环境中生长融合，通常3d4d内形成单层。5.5.2.9病毒回归及对照试验每次实验需同时作病毒回归（工作毒及其10-1、10-2、10-3、10-4稀释物）及阴性参照血清、阳性参照血清和正常细胞作为对照，每个对照做6孔。具体操作同5.4.2.5.5。5.5.2.10洗板弃掉生长液，用0.15mol/l氯化钠（NAcl）冲洗微量板-次。用吸水纸吸干微量板中的水分。5.5.2.11固定单层细胞可用以下任何-种方法进行固定：A）将微量板在37孵育45min后，-20至少再放置45min，每孔加100l含4多聚甲醛的PBS，再在室温孵育5min10min。去掉多聚甲醛，

24、用0.15mol/l氯化钠冲洗；）将微量板在7080放置1H2H；C）用含20丙酮的PBS固定10min，2530干燥4H。5.5.2.12加CSF高免猪抗血清每孔加50lCSF高免猪抗血清，血清用PH7.6含有1吐温20和0.1叠氮钠的0.5mol/l氯化钠溶液稀释，在37 孵育15min。抗血清的工作稀释度应在滴定前测定，如NPLA滴定为1：30000的血清，使用时作1：100稀释。5.5.2.13洗板用含1吐温-20（PH7.6）的0.15mol/l氯化钠溶液洗板5次。5.5.2.14加工作浓度的抗猪IGG-HRPO结合物每孔加50l工作浓度的抗猪IGG-HRPO结合物，该溶液用含1吐温

25、-20（PH7.6）和0.1叠氮钠的0.15mol/l氯化钠溶液稀释。37孵育10min。5.5.2.15洗板重复5.5.2.13。5.5.2.16加底物每孔加50l染色底物溶液（见A.3），室温染色15min30min。5.5.2.17结果判定当阴性血清对照孔、样品血清对照孔和细胞对照孔细胞出现完全或部分染成红棕色，而阳性血清对照孔细胞没有出现颜色，试验结果成立。细胞层被完全或部分染成红棕色或细胞的胞浆染成暗红色判为阴性，细胞层或细胞的胞浆没有染上颜色判为阳性。5.6单克隆抗体ELISA试验5.6.1仪器和试剂5.6.1.1酶标检测仪。5.6.1.2恒温培养箱。5.6.1.3可调移液器。5.

26、6.1.4洗板机。5.6.1.5猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原。5.6.1.6猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原。5.6.1.7酶标二抗。5.6.1.8标准阴、阳性血清。5.6.1.9包被液（见A.9）。5.6.1.10稀释液（见A.10）。5.6.1.11洗涤液（见A.11）。5.6.1.12底物溶液（见A.12）。5.6.1.13终止液（见A.13）。5.6.2试验程序5.6.2.1包被用包被液将猪瘟病毒（强毒或弱毒）单抗纯化酶联抗原作100倍稀释，每孔加入100l，置湿盒于4过夜。5.6.2.2洗板弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，每次3min5min，甩干孔内残液，于吸水纸上拍打吸干。5.6.2.3加被

27、检血清和对照血清用稀释液将待检血清作400倍稀释，每孔加100l。同时将标准阴性、阳性血消分别作100倍稀释作对照，37培育1.5H2H。5.6.2.4洗板重复5.6.2.2。5.6.2.5加酶标二抗用稀释液将兔抗猪IGG-辣根过氧化物酶结合物稀释至工作浓度，每孔加入100l，37 培育1.5H2H。5.6.2.6洗板重复5.6.2.2。5.6.2.7加底物每孔加入OPD底物溶液（见A.12）100l，室温下避光反应5min15min。5.6.2.8终止反应当标准阳性血清对照孔呈黄色，标准阴性血清对照孔无色或略微显色时，每孔加入50l终止液（见A.14）终止反应，5min内测定光密度（OD）。

28、5.6.2.9测定光密度值以标准阴性血清对照作空白调零，于酶标仪上测定490nm波长的密度（OD）。5.6.2.10判断标准判断标准如下：A）在猪瘟弱毒酶联板上，标准阳性血清对照孔OD0.2时，试验成立。按以下标准判定结果：OD0.2，为猪瘟弱毒抗体阳性；OD0.2，为猪瘟弱毒抗体阴性；）在猪瘟强毒酶联板上，标准阳性血清对照孔OD0.5时，试验成立。按以下标准判定结果：OD0.5，为猪瘟强毒抗体阳性；OD0.5为猪瘟强毒抗体阴性。5.7双抗体夹心犈l犐犛犃试验5.7.1仪器和试剂5.7.1.1酶标检测仪。5.7.1.2可调移液器。5.7.1.3洗板机。5.7.1.4猪瘟特异性单克隆抗体。5.7

29、.1.5猪瘟多克隆抗体。5.7.1.6酶标二抗。5.7.1.7阴、阳性对照。5.7.1.8包被液（见A.9）。5.7.1.9稀释液（见A.10）。5.7.1.10洗涤液（见A.11）。5.7.1.11底物溶液（见A.12）。5.7.1.12终止液（见A.13）。5.7.2试验程序5.7.2.1包被用包被液将CSFV多克隆抗血清稀释成10g/ml，每孔加入100l，置湿盒于4过夜，加入含1 BSA的PBS溶液，37封闭1H。5.7.2.2取样和样品的处理取猪的扁桃体、脾、肠、淋巴结或肺1G2G碾碎，加入5ml样品稀释液，振荡混匀，室温下置1H，1500g离心10min取上清液。或取10ml（按1

30、：1体积加入抗凝剂）抗凝血的白细胞，按10倍稀释加入样品稀释液，振荡混匀，室温放置1H。5.7.2.3洗板弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，每次3min5min，甩干孔内残液，于吸水纸上拍打吸干。5.7.2.4加特异性单克隆抗体每孔加入25l猪瘟特异性单克隆抗体。5.7.2.5加样品及对照每孔分别加入75l制备好的样品及阴阳性对照（阴阳性对照各加2孔）。轻拍酶标板，使样品混合均匀。用胶条密封后室温（1825）孵育过夜。5.7.2.6洗板重复5.7.2.3。5.7.2.7加酶标二抗用稀释液将酶标二抗稀释至工作浓度，每孔加入100l，室温培育1H。5.7.2.8洗板重复5.7.2.3。5.7.2.9

31、加底物每孔加入底物溶液（见A.12）100l，室温下避光反应10min15min。5.7.2.10终止反应每孔加入100l终止液（见A.13）终止反应，5分钟内测定光密度（OD）。5.7.2.11测定光密度值在酶标仪上测定450nm波长的密度（OD）。5.7.2.12判断标准阳性对照孔平均矫正OD0.5时，阴性对照孔平均OD0.15时试验成立，按以下标准判定结果：样品的矫正OD0.3为阳性；样品的矫正OD0.2为阴性，样品的矫正0.2OD0.3为可疑。矫正OD样品OD-阴性对照OD。附录A（规范性附录）溶 液 配 制A10.01mol/mlPH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）磷酸氢二钠（NAH2PO4 ） 1.43G磷酸二氢钠（NAH2Po4） 0.53G氯化钠（NAcl） 8.5G加双蒸水溶解至 1000ml。A20.5mol/mlPH9.5碳酸盐甘油缓冲液磷酸氢钠（NAHCO3 ） 3.70G磷酸钠 0.60G蒸馏水 100ml1份碳酸缓冲液加9份甘油混合即成碳酸盐-甘