基因工程基本讲义

1、基因工程基本讲义工具酶 DNA重组技术中对核酸的“精雕细刻”主要用酶作为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多都用作工具。限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）在重组DNA技术中有重要地位，在此较详细介绍。DNA重组技术中最常用的工具酶限制性核酸内切酶 识别DNA特定序列，切断DNA链 DNA聚合酶 或其大片段（Klenow）缺口平移制作标记DNA探针 合成cDNA的第二链填补双链DNA3凹端DNA序列分析 耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等） 聚合酶链反应（PCR） DNA连接酶 连接两个DNA分子或片段 多核苷酸激酶 催化多核苷酸5羟基末端磷酸化，制备

2、末端标记探针 末端转移酶 在3末端加入同质多聚物尾 SI核酸酶，绿豆核酸酶 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端 DNA端酶 降解DNA，在双链DNA上产生随机切口 RNA酶A 降解除RNA 磷酸酶 切除核酸末端磷酸基 核酸酶核酸外切酶（exonuclease）：是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease)：是从核酸链中间水解3，5磷酸二酯键，将核酸链切断。限制性核酸内切酶的命名用属名的头一个字母和种名的头两个字母，组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称，如大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示，流感嗜血菌（Haemop

3、hilus influenzae）用Hin表示;如有株名，再加上一个字母，一种特殊的菌株，具有几个不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为Hind、Hind和Hind。限制性核酸内切酶的分类类限制性核酸内切酶? 由3种不同亚基构成，兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点以外的DNA序列。这类酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。型限制性核酸内切酶与型限制性核酸内切酶相比， 型限

4、制性核酸内切酶的特点是其切割位点在识别序列上与之靠近，并产生具有粘性末端或其它末端的一定长度的DNA片段。其三个基本特性如下：在DNA分子双链的特异性识别部位，切割DNA分子产生链的断裂；2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此相对的；断裂形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。限制性核酸内切酶的作用限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，切断的双链DNA都产生5磷酸基和3羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同。识别序列（切割位点、靶子序列）绝大多数的型限制性核酸内切酶，都能识别4-8个核苷酸组成的特

5、定核苷酸序列，我们称这样的序列为核酸内切酶的识别位点，限制酶就是从识别序列内切割DNA分子的。有些识别序列是连续的，（如GATC），有些识别序列是断裂的（如GANTC），共同的特点是，它们具有双重旋转对称的结构形式，即回文结构。型限制性核酸内切酶的靶子位点是多样的，靶子序列长度不一样的限制酶，对DNA分子的随机切割频率不同。由限制酶的作用造成的DNA分子的断裂类型通常有两种：两条链上的断裂位置是交错的、但是对称地围绕一个对称轴排列，这种断裂的结果是形成具有粘性末端的DNA片段；两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形成的是平末端DNA片段。粘性末端，是指DNA分子在限制酶的作用下形成

6、的具互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对重新环化，具平末端的DNA片段不易环化。有两种类型的限制酶都可以产生粘性末端:一种是形成具有3-OH单链延伸的粘性末端；另一种是形成具有5-P单链延伸的粘性末端.DNA限制性内切酶粘性末端配对重组同裂酶有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。同尾酶这一类的限制酶来源各异，识别的靶字序列也不相同，但产生相同的粘性末端。由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。影响限制性内切酶活性的因素1 DNA纯度在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除

7、干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。2 核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切限制酶的标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。使用所有限制酶均可发挥活性的一种缓冲液。NaCl的浓度不同限制性内切酶对NaCl浓度的要求不同，这是不同限制酶缓冲液组成上的一个主要的不同。据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液，在进行双酶解或多酶解时，若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好，则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不同，可采用以下三种方法进行消化反应：

8、先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA，然后补足适量的NaCl，再用要求高盐缓冲液的限制酶消化；先用一种酶进行酶解，然后用乙醇沉淀酶解产物，再重悬于另一缓冲液中进行第二次酶解。3 酶切消化反应的温度DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是37，少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37。4 DNA的分子结构DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响，如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍。有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率也有明显差异。限制性内切酶反应的

9、终止 通常是采用65条件下温浴5min；加终止反应液（如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10 mol/L）螯合Mg2+，以终止反应。分子克隆的常用技术 核酸的分子杂交技术 核酸分子的固相杂交是将待测核酸样品结合在某种固相支持物上，然后与溶液中的标记探针进行杂交。目前使用最多的固相支持物是硝酸纤维膜。DNA的吸印转移法（Southern Blot）DNA经过限制性内切酶消化和凝胶电泳后，放入碱性溶液中使其变性，将变性后的单链DNA从凝胶中按原来位置和顺序用滤纸吸印转移到硝酸纤维膜上，然后再与标记探针杂交。此方法比较准确地保持了特异DNA序列在电泳图谱中的位置，而且能测定分子量。

10、试剂：变性液：0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl中和液：1mol/L Tris-HCl, 1.5mol/L NaCl pH8.020SSC:0.3mol/L柠檬酸钠，3mol/L NaCl1电泳取DNA约5g加限制性内切酶进行酶切，电泳鉴定酶切完全后， 取酶消化后的DNA点样于0.8%1.2%的凝胶上，以0.81V/cm电压电泳过夜，在溴酚蓝离凝胶前缘0.5cm处停止电泳。将电泳后的凝胶翻转，紫外灯照射1020min后拍照。2变性与中和将电泳后的凝胶放入变性液中25振荡60min。蒸馏水洗胶1min，将凝胶放入中和液中25振荡60min。3转移取托盘一只，放入10SSC溶

11、液约5001000ml，托盘上搭一块比凝胶稍宽的长方形玻璃，取一长方形滤纸搭在桥上，两边浸入10SSC溶液中，仔细去掉玻璃与滤纸之间的气泡（用玻棒在滤纸上滚动）。将凝胶放在滤纸上，去掉凝胶与滤纸之间的气泡。将硝酸纤维膜放入2SSC溶液中浸湿后放在凝胶上（如NC膜浸湿不均匀，则考虑更换NC膜，操作时手切勿触及NC膜），去掉凝胶与NC膜之间的气泡。将一张滤纸（长和宽均比NC膜小1mm）放在NC膜上，仔细去掉气泡。将吸水纸切成与滤纸大小，重叠放在滤纸上，再压一重物约5001000g。转膜24h，中间更换吸水纸。4固定用2SSC溶液洗膜5min去掉残余凝胶，让膜自然晾干。将凝胶放入EB液中30min，

12、取出在UV灯下观察是否有DNA残余。80烤膜2h，然后将膜封入塑料袋进行杂交。RNA的吸印转移法（Northern blot）在RNA凝胶电泳之前，先用乙二醛等变性剂处理RNA，再在适宜条件下电泳使充分变性的RNA直接吸印到硝酸纤维膜上。固定后除去变性剂，然后进行杂交。试剂：乙二醛：4mol/L（约为30%），经过阴阳离子交换树脂纯化，使pH为5.56.0磷酸缓冲液：80mmol/L pH6.57.0 磷酸缓冲液：10mmol/L pH6.57.0Tris-HCl:20mmol/L pH7.8 二甲基亚砜：分析纯 20SSC：0.3mol/L柠檬酸钠，3mol/L NaCl基本步骤1.RNA变

13、性吸取1l 80mmol/L磷酸缓冲液，1l RNA样品（最多100g），2l，4mol/L 乙二醇，4l二甲基亚砜。混匀后，50水浴1h，然后放入冰中。2电泳 变性结束后，加入含有50%甘油的10mmol/L磷酸缓冲液2l和少量溴酚蓝，混匀后点样于1.0%的凝胶上，以45V/cm电压电泳。凝胶电泳液为10mmol/L磷酸缓冲液， pH6.57.0。 3转移? 变性处理后的RNA可以转移并结合到硝酸纤维膜上，转移过程和转移变性与DNA相同。4固定? 用20SSC转移RNA。膜夹在两层干净滤纸中晾干，80烤膜2h。RNA膜固定后，放入20mmol/L Tris-HCl中，100处理510min，

14、去除乙二醛，然后进行杂交。Sanger双脱氧法测序原理DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），因它在脱氧核糖的3位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。如，存在ddCTP、dCTP和三种其他的dNTP（其中一种为-32P标记）的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5-引物端和以ddC残基为3端结尾

15、的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下来。类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3端结尾的三组长短不一的片段。将制得的四组混合物平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列. 细菌的转化 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程

16、。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。1928年，Griffith发现给小鼠注入经加热杀死的有荚膜、光滑型致病性肺炎球菌和活的无荚膜、粗糙型非致病性的肺炎双球菌的混合物后，可引起小鼠的死亡。在死亡的小鼠中能分离到活的有荚膜、光滑型肺炎球菌，这种获得的致病特性能遗传。对照实验表明，只注射活的粗造型非致病性的肺炎双球菌或只注入经加热杀死的光滑型致病性肺炎球菌都不会使小鼠死亡。Griffith推测，致病性的肺炎球菌的基因从杀死的致病菌进入了非致病菌中，以至改变了后者的基因表现型。即从不致病转变成致病。1944年Avery 等从死亡的致病性肺炎球菌中提取纯化

17、其DNA，并证明这种纯化的DNA能使非致病菌株转化为致病型，确定了DNA控制基因表现型的作用，人们开始认识到DNA是遗传信息的物质基础。 基因的化学合成随着DNA合成技术的发展，特别是自动化合成技术的引入，人们能简便、快速、高效地合成其感兴趣的DNA片段。目前，DNA合成技术已成为分子生物学研究必不可少的手段，并且已在基因工程、临床诊断和治疗、法医学等各个领域中日益发挥重要的作用。化学法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备。在基因的化学合成中，通常是先合成一定长度的、具有特定序列的寡核苷酸片段。寡核苷酸片段的化学合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法，以及在后者基

18、础上发展起来的固相合成法和自动化法。磷酸二酯法基本原理是将一个5端带有适当保护基的脱氧单核苷酸与另一个3端带有适当保护基的脱氧单核苷酸偶联起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。亚磷酸三酯法原理是将所要合成的寡核苷酸链的3末端先以3-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠连接，然后依次从3-5的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，其中5-OH用4,4-二对甲氧基三苯基保护，3-端的二丙基亚磷酸酰上的磷酸的OH，用甲基或?氰乙基保护。 寡核苷酸连接法目前，化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150-200bp，而绝大多数基因的大小超过了这个范围，因此，需要

19、将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因。常用的基因组装方法主要有两种：第一种方法是将寡聚核苷酸激活，带上必要的5-磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，再用T4DNA连接酶将它们彼此连接成一个完整的基团或基团的一个大片段。第二种方法是将两条具有互补3末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产生的单链DNA作为模板在大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链DNA片段，可经处理插入适当的载体上。DNA合成在基因工程和分子生物学研究中的应用合成基因目前有许多基因和蛋白质的核苷酸和氨基酸序列已得到阐明，人们已经可以根据需要合成出具有实

20、际应用和研究价值的多肽和蛋白质基因。已报道的合成基因有人生长激素、干扰素、胰岛素、表皮生长因子、白细胞介素II、集落刺激因子等，绝大多数已在原核和真核系统中获得表达。合成基因的方式1 全基因合成：分子较小而又不易得到的基因采用该方式。将双链基因分成若干寡核苷酸单链片段(尤其待合成基因在100个核苷酸以上时)，每个片段长度控制在4060个碱基，并使每对相邻互补的片段之间有46个碱基交叉重叠。在体外将除基因两端末端外的所有片段磷酸化。混合退火后加入DNA连接酶，即可得到较大的基因片段。2 酶促合成：又称基因的半合成。全基因，特别是较大的基因的全部化学合成成本昂贵，使用半合成的方法可以降低成本，从而

21、利于普及使用。首先合成末端之间有1014个互补碱基的寡核苷酸片段，退火后以重叠区作为引物，在4种dNTP存在的条件下，通过DNA聚合酶I大片段(Klenow酶)或反转录酶的作用，获得两条完整的互补双链。合成探针人工合成的具有特定顺序的寡聚DNA片段，已应用于筛选和鉴定重组质粒或噬菌体。实验证明用合成的寡核苷酸片段，即使只有1对碱基错配采用严谨条件杂交也能与完全互补的双链相区别。合成引物1.合成PCR引物进行基因扩增：PCR技术是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。该法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万特异DNA序列拷贝。PCR技术的特异性取决于所用引物和模板DNA结合

22、的特异性。2.序列测定用引物：DNA序列测定是分子生物学中最重要和最精细的研究技术，其中最常使用的是末端终止法，即是一种依赖于特异DNA引物的序列测定方法。3.合成导入突变用的引物：利用寡核苷酸引导的突变，可在目的DNA序列的任何部分产生点突变、插入和缺失，从而使得基因编码的蛋白质在结构和功能上发生改变。合成连接子和接头在DNA重组中常需要将外源DNA片段插入某些载体DNA中。如果载体或外源DNA上没有合适的限制性内切酶位点，为提高插入效率或实现定向克隆，可采用合成连接子(linker)和接头(adaptor)的方法。合成基因在医学中的应用许多疾病，如遗传性疾病、肿瘤、心血管疾病等可在基因结构

23、上找到某些变化，如基因的缺失、突变、转位，以此作为证据可对这些疾病作同相应的判断。目前，合成DNA探针已广应用于临床，成为一种有效的诊断手段。1 用于遗传病的诊断过去仅有少数遗传性疾病可以凭借蛋白质和酶学方面的异常作出判断，随着分子生物的发展，对遗传病的诊断有了巨大的进步，出现了基因诊断法。例如镰刀状细胞贫血症即是由于AT突变造成-珠蛋白第六位谷氨酸变为缬氨酸，从而造成珠蛋白结构异常，并引起红细胞形态及对氧的亲合力发生改变。2 用于传染病的诊断临床上对传染性疾病的传统诊断程序常常是检测病原体及其抗体，需时较长，达不到早期诊断的目的。合成探针在传染病特别是由病毒感染性所致的传染病检测中，已得到广

24、泛应用，尤其是结合PCR方法使诊断的灵敏度可进一步提高，目前国内已制出检测乙肝病毒、艾滋病病毒(HIV)、轮状病毒和疱疹疾病等多种基因探针诊断试剂盒。人工合成核酸在某些疾病的治疗上也显露了端倪。如，寡聚核苷酸及其衍生物对肿瘤的治疗。作为蛋白质翻译抑制剂的寡核苷酸现称为反义RNA或反义DNA。反义RNA或反义DNA国际上研究课题的热点，人们寄希望它在抗病毒，尤其是对艾滋病和肿瘤基因治疗上发挥重要。反义RNA的作用原理可能有以下几种：反义RNA与体内靶mRNA结合形成双螺旋，使mRNA不能成为翻译蛋白质的模板。反义RNA(DNA)与DNA结合。影响DNA复制。反义RNA能阻止mRNA与核蛋白体结合

25、，降低蛋白质合成效率。基因操作的主要技术原理电泳概论电泳是指带粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。不同的带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同。常用泳动度（或迁移率）来表 示。泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下电泳的速度。电泳技术以支持物分纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，淀粉凝胶电泳，琼 脂（糖）凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。经凝胶形状分有水平平板电泳，园盘柱 状电泳及垂直平板电泳。用支持体的电泳技术：1.纸上电泳2.醋酸纤维薄膜电泳3.薄层电泳 4.非凝胶性支持体区带电泳 （支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)5.凝胶支持体区带电泳 淀粉液 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂（糖）凝胶不用支持

26、体的电泳技术：1.Tiselius或微量电泳2.显微电泳 3.等电点聚焦电泳技术4.等速电泳技术5.密度梯度电泳 不用支持体的电泳技术：1.Tiselius或微量电泳2.显微电泳 3.等电点聚焦电泳技术4.等速电泳技术5.密度梯度电泳 核酸的凝胶电泳在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，它具有下列优点：（1）琼脂含液体量 大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附 极微。（2）琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。（3） 电泳速度快。（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（5） 区带易染色，样品易回收。琼脂糖凝胶电泳可

27、用于分离、鉴定和提纯DNA片段。本法操作简单、迅速，能分辨其它方法不能分开的DNA片段混合物，分开的DNA可用低浓度的萤光染料（0.5g/ml溴化乙锭）染色，在紫外灯下直接观察检测少至1ng的DNA。DNA通过琼脂糖凝胶的迁移率取决于以下参数：DNA分子的大小线状双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。据此用已知分子量的标准物质和待测分子量的DNA片段同时电泳，比较其电泳速率，即可求出待测片段的分子大小。琼脂糖浓度：给定大小的DNA片段，以不同速度通过不同浓度的琼脂糖凝胶。因此利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛，大小不同的DNA片段。DNA构型相同分子量的闭环（型），开环（型）

28、和线状（型）DNA，以不同速率通过凝胶，一般情况下，迁移率型型型。应用的电压在低电压时，线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比。但是电压增高时，大分子量DNA片段迁移率的增大是不同的，因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。为了获得DNA片段的最大分辨力，凝胶电泳时电压不应超过5V/cm。聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于分析和制备小于1Kb长度的DNA片段。聚丙烯胺凝胶多用垂直平板电泳，准备凝胶时，先配制30%单体母液（29克丙烯酰胺，1克双丙烯酰胺，加水溶解，定容至100ml），再用它来配制所需浓度的凝胶。每100ml上述液体加30l四甲基乙胺（TEMED），混匀后即可灌注于予先准备好的洁净不

29、渗漏的凝胶玻板，待凝胶灌至近顶端时，立即插入合适的“梳子”，放室温聚合60分钟，若冬天室温太低，则可放37度温箱内，以促进聚合。聚合完成后，拔出“梳子”，将凝胶板固定于电泳槽中，向电泳槽倾入1TBE，用滴管冲洗加样孔和凝胶底部以除去气泡，即可加样电泳。一般所用电压1-8v/cm，随时观察标记染料的迁移。电泳结束，从电槽中取出玻板并小心地撬开，凝胶浸于溴化乙锭液（0.5g/ml1TBE)染色，45min后放紫外灯下观察电泳结果。分子量参照物为了判断目的DNA片段的大小，常在同一凝胶的目的DNA旁加一分子量参照物，同时电泳并染色后，就能在紫外灯下很快知道目的片段的大小。最常用的分子量参照物是 Hi

30、nd 消化物，各片段的大小以bp表示，分别为：23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125。核酸分子杂交基本原理液相核酸分子杂交菌落原位杂交核苷酸顺序分析的基本原理基因的化学合成随着DNA合成技术的发展，特别是自动化合成技术的引入，人们能简便、快速、高效地合成其感兴趣的DNA片段。目前，DNA合成技术已成为分子生物学研究必不可少的手段，并且已在基因工程、临床诊断和治疗、法医学等各个领域中日益发挥重要的作用。DNA合成在基因工程和分子生物学研究中的应用1.合成基因目前有许多基因和蛋白质的核苷酸和氨基酸序列已得到阐明，人们已经可以根据需要合成出具有实际应用和研究价值

31、的多肽和蛋白质基因。已报道的合成基因有人生长激素、干扰素、胰岛素、表皮生长因子、白细胞介素II、集落刺激因子等，这些基因均已被克隆，绝大多数已在原核和真核系统中获得表达。目前，合成基因的方式有2种。全基因合成：一般对于分子较小而又不易得到的基因采用该方式。可将双链基因分成若干寡核苷酸单链片段(尤其待合成基在在100个核苷酸以上时)，每个片段长度控制在4060个碱基，并使每对相邻互补的片段之间有46个碱基交叉重叠。在体外将除基因两端末端外的所有片段磷酸化。混合退火后加入DNA连接酶，即可得到较大的基因片段。如果需连接亚克隆的方法，最后将亚克隆的较大片段重组为完整的基因。采用分步连接、亚克隆的方法

32、时，为便于亚克隆中回收基因片段。应在片段两侧设计合适的酶切位点，由于每个亚克隆可以分别鉴定，从而可减少顺序错误的可能性。酶促合成：此法又称基因的半合成。全基因，特别是较大的基因的全部化学合成成本昂贵，使用半合成的方法可以降低成本，从而利于普及使用。首先合成末端之间有1014个互补碱基的寡核苷酸片段，退火后以重叠区作为引物，在4种dNTP存在的条件下，通过DNA聚合酶I大片段(Klenow酶)或反转录酶的作用，获得两条完整的互补双链。在合成基因的结构中，应包括有克隆和表达所需要的全部信号及DNA顺序，基因密码的阅读框架也应该同表达体系相适应。此外，由于不同种类的生物体或密码子的使用都具有明显的选

33、择性，在基因合成和克隆时必须考虑这个问题。选择合适的密码子，以获得高效表达。2 .合成探针基因的克隆和分离已成为现代分子生物这研究必不可少的手段。DNA合成技术在其中起着越来越重要的作用。它不仅使得过去颇费周折的基因筛选与鉴定成为常规技术，而且使得克隆载体的构建及克隆基因和载体的连接变得更加容易和准确。蛋白质的结构可以通过mRNA的结构间接地得出。相反，如果已知某个肽段的氨基酸顺序，也可根据密码简并的原则推导出所有可能的mRNA序列密码。人工合成的具有特定顺序的寡聚DNA片段，已应用于筛选和鉴定重组质粒或噬菌体。实验证明用合成的寡核苷酸片段，即使只有1对碱基错配采用严谨条件杂交也能与完全互补的

34、双链相区别。因此，使用作探针的寡核苷酸，应将密码的简并度调至最高限度时，可减少假阳性，增加筛选的准确率。3.合成引物3.1.合成PCR引物进行基因扩增：PCR技术是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。该法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万特异DNA序列拷贝。PCR技术的特异性取决于所用引物和模板DNA结合的特异性。合成引物在PCR反应中的使用。3.2.序列测定用引物：DNA序列测定是分子生物学中最重要和最精细的研究技术，其中最常使用的是末端终止法，即是一种依赖于特异DNA引物的序列测定方法，此外该法对模板的需要量较大，这就要求待测DNA片段尤其是拷贝数少的片段首先克隆

35、到适合的载体中经过扩增后进行序列测定。常用的克隆载体如M13、pUC19、PBR322等均可购到有商品出售的公用测序引物。3.3.合成导入突变用的引物：利用寡核苷酸引导的突变，可在目的DNA序列的任何部分产生点突变、插入和缺失，从而使得基因编码的蛋白质在结构和功能上发生改变。4 合成连接子和接头在DNA重组中常需要将外源DNA片段插入某些载体DNA中。如果载体或外源DNA上没有合适的限制性内切酶位点，为提高插入效率或实现定向克隆，可采用合成连接子(linker)和接头(adaptor)的方法。使用连接子和接头需要插入片段是平末端，否则，首先需要用DNA聚合酶I大片段补齐或者用核酸酶S1或Bal

36、31处理得到平末端后才可同连接子或接头连接。具有多酶切点的接头(polylinker)还广泛应用于构建某些运载体，使之带有多个新的酶切位点。这在质粒pUC系列及用于序列分析的M13mp噬菌体系统中都得到了广泛的应用。接头片段带用来调整表达载体的读码框架，用于基因表达及功能的研究。合成基因在医学中的应用随着科学技术的发展，人们对疾病的认识已逐步从整体和器官的水平深入到细胞分子水平。医学家发现，许多严重危害人类健康的疾病，如遗传性疾病、肿瘤、心血管疾病等可在基因结构上找到某些变化，如基因的缺失、突变、转位或致病左因的存在，以此作为证据亦可对这些疾病作同相应的判断。例如镰刀状细胞贫血症即是由于AT突

37、变造成-珠蛋白第六位谷氨酸变为缬氨酸，从而造成珠蛋白结构异常，并引起红细胞形态及对氧的亲合力发生改变。通过人工合成的19个核苷酸作为探针即可明确区别正常人、杂合和纯合的病人。目前，合成DNA探针已广应用于临床，成为一种有效的诊断手段。1 用于遗传病的诊断过去仅有少数遗传性疾病可以凭借蛋白质和酶学方面的异常作出判断，随着分子生物这的发展，对遗传病的诊断有了巨大的进步，出现了基因诊断法。医学上使用基因诊断法最早成功的报道是1985年Saiki等人对镰刀状红细胞贫血的诊断。另外，对于以突变为主的-地中海贫血，以合成DNA片段为探针，亦可得同满意的结果。2 用于传染病的诊断临床上对传染性疾病的传统诊断

38、程序常常是检测病原体及其抗体，需时较长，达不到早期诊断的目的。合成探针在传染病特别是由病毒感染性所致的传染病检测中，已得到广泛应用，尤其是结合PCR方法使诊断的灵敏度可进一步提高，目前国内已制出检测乙肝病毒、艾滋病病毒(HIV)、轮状病毒和疱疹疾病等多种基因探针诊断试剂盒。人工合成核酸在医学上不仅可以作为一种手段，而且在某些疾病的治疗上显露了端倪。寡聚核苷酸及其衍生物对肿瘤的治疗已经取得可喜的进展。作为蛋白质翻译抑制剂的寡核苷酸现称为反义RNA或反义DNA。其作用原理可能有以下几种：反义RNA与体内靶mRNA结合形成双螺旋，使mRNA不能成为翻译蛋白质的模板。反义RNA(DNA)与DNA结合。

39、影响DNA复制。反义RNA能阻止mRNA与核蛋白体结合，降低蛋白质合成效率。反义RNA或反义DNA最近年来国际上研究课题的热点，人们寄希望它在抗病毒，尤其是对艾滋病和肿瘤基因治疗上发挥重要，为征服这两类严重威胁人类健康的疾病作出贡献。基因的转移与重组体的检测自然界的基因转移接合作用 （conjugation）当细胞与细胞相互接触时，DNA分子从一个细胞向另一个细胞转移，这种遗传物质的转移方式称为接合作用。 接合作用的典型的例子是细菌所含的一种质粒DNAF因子。当F+细菌与F-细菌接触时，两细胞间形成鞭毛连接，F因子被酶切成单链并通过鞭毛连接桥向F-细胞转移，从而使F-细菌转变为F+细菌。 转化

40、、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。 转化和转导主要适用于原核细胞和酵母之类的低等真核细胞，显微注射和电穿孔主要适用于高等动植物的真核细胞。转化 (transformation)指宿主细胞直接吸收外源DNA分子(如质粒载体或重组体等等），并获得某些新遗传性状的生命过程。转化现象在原核生物中广泛存在，是自然界中原核生物基因重组的一种主要方式。基因工程中，转化的目的是把具有复制能力，但在细胞外无复制活性的目的基因-载体重组体装入细胞，使目的基因随载体在细胞内复制、扩增。DNA进入细胞的效率很低，可采取一些方法处理细胞，使细胞容易接受外界DNA，成为感受态细

41、胞，再与外源DNA接触，可提高转化效率。细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础。基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。例如大肠杆菌经冰冷CaCl2处理，成为感受态细菌，加入重组质粒，并由4转入42作短时间处理，质粒DNA就能进入细菌。用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔（electroporation）转化法。革兰氏阳性细菌，转化过程的几个阶段：1 细菌感受态的形成由于分泌一种称为感受态因子的小蛋白而导致细菌感受态的形成。2 转化因子的吸收双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合，并激活临近

42、的核酸酶。DNA双链中的一条单链逐步降解，同时另一条单链逐步进入细胞。3 整合复合物前体的形成一种特殊蛋白与单链DNA结合，有效保护单链DNA免遭核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处。4 单链DNA转化因子的整合转化DNA单链可以通过同源重组，置换受体细胞染色体DNA的同源区，形成异源杂合双链DNA结构。5 转化子的形成受体菌染色体组进行复制，杂合区段亦半保留复制，当细胞分裂后，此染色体发生分离，于是新形成一个转化子。影响转化的因素 DNA能否进入细胞； DNA进入细胞后的稳定性； 质粒DNA的大小，大质粒的转化效率低于小质粒，到目前，大于30kb的质粒，转化效率仍很低； DNA的浓

43、度、纯度和形状； 诱导感受态细菌所用的离子的种类和浓度； 热休克时间的长短及平板培养条件等。Cohen转化法-用CaCl2处理制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞1 从37培养1620h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1ml新鲜的1620h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml培养瓶中。于37振摇培养约23h（旋转摇床200300r/min），每隔2030min测量OD600值0.4。2在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，冰上放置1020min；3 于44000转 /分离心10min，回收细菌细胞；4 将管倒置1min，以使最后残

44、留的痕量培养液流尽；5 以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上 ， 44000转 /分离心10min，回收细菌细胞；6 每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70贮存备用。7 用无菌吸头从感受态细胞悬液中取200l转移到无菌的微量离心管中，加DNA或连接反应混合物（体积10l，DNA50ng），轻旋以混匀内容物，冰浴30min；8 将离心管放到预加温到42的水浴中，90s；9 将混合物快速转移到冰浴中，冷却1-2分钟，加入适当的培养基在37 培养45 分钟，使细胞复苏，并表达质粒所携带的转化基

45、因；10 将适当体积（每个90mm平板可达200l）已转化的感受态细胞转移到相应抗生素的平板培养基上。 11 将平板置于室温至液体被吸收 ，倒置平板于37培养箱中，1216h，平板培养，克隆在此期间应该出现，否则转化不成功。CaCl2能诱导DNA分子对大肠杆菌的转化，可能的原因：1 在0 CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开，诱导大肠杆菌形成感受态。2 Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42 热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发

46、生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。 Hanahan转化法除了用CaCl2二价离子处理细胞外，还利用二甲基亚砜、二硫苏糖醇和氯化六氨高钴等进一步处理细胞。此法的优点是形成高频率的感受态细胞，转化效率可提高100-1000倍，而且对大小质粒都能进行有效的转化。此法要求条件高，对外界污染物极为敏感。只在极少情况下才用这种方法，如：从较难得到的样品中分离极少量的mRNA，构建cDNA文库时，用此法以获得高的转化率。转染 （transfection）采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理成感受态细菌，再将重组?噬菌体DNA直接导入受

47、体细胞，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染。转染是转化的一种特殊形式。 转导 将噬菌体DNA分子导入大肠杆菌受体细胞的常规方法是转导操作。所谓的转导是指通过 ?噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径，把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。具有感染能力的?噬菌体颗粒除含有?噬菌体DNA分子外，还含有外被蛋白。对宿主菌的要求作为基因工程的受体细胞，应利于外源DNA的转化或转导，同时又要有较好的安全性。通常从下面几个方面加以考虑：首先应当是限制系统缺陷型，大肠杆菌的限制系统主要是由hsdR基因编码，因此具有hsdR-遗传表型的大肠杆菌菌株均丧失了降解外源DNA的能力，大

48、大增加了外源DNA的可转化性，转化效率可提高1000倍左右。也可以采用限制-修饰系统缺陷型菌株，更便于重组DNA分子的多种基因操作。重组系统 大肠杆菌可编码催化同源DNA序列重组的若干代谢途径，由于许多真核基因组DNA携带的序列是同源重组的理想产物，克隆于载体的真核DNA在增殖过程中可能发生重排，这种重排的机率虽低，但可能导致克隆基因的缺失和分析上的困难。RecA蛋白是一个单链蛋白，能促进DNA分子之间的同源联会和DNA单链交换，recB、recC和recD基因的突变也可以降低遗传重组的发生频率。选用同源重组缺陷型的菌株（recA-等）以阻止可能发生的克隆片段的重排现象。因此，受体细胞必须选择

49、体内同源重组缺陷型的遗传表型，相应的基因型recA-、 recB-或 recC-等，有些大肠杆菌突变体则是三个基因同时失活。易于转化或转导可利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的通透性及细胞膜的特异吸附性，从而提高转化效率。有明显的选择性差异遗传表型差异大，便于重组子的检测。通常是使受体细胞呈现与载体所携带的选择标记互补的遗传性状。感染寄生缺陷型受体细胞不能具有感染寄生性。原核生物细胞这是较为理想的受体细胞类型，原因：大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入；没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，外源DNA和裸露的染色体DNA容易进行重组；基因组简单，不含线粒体和质

50、体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析；原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。以原核生物细胞来表达真核生物基因存在一定的缺陷：原核生物不具备真核生物的蛋白质折叠系统，即使许多真核生物基因能得以表达，得到的也多是无特异性空间结构的多肽链；原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用；原核生物内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定。真菌细胞酵母菌是外源真核基因理想的表达系统，优点如下：酵母菌是结构最为简单的真核生物之一，其基因表达调控机理比较

51、清楚，遗传操作较为简单；具有真核生物蛋白翻译后加工系统；不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌属（如酿酒酵母等）在食品工业中有着几百年的应用历史，是安全型的基因工程受体系统；培养简单，利于大规模的发酵生产，成本低廉；能将外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取和加工等。植物细胞作为基因转移的受体细胞，植物细胞最突出的优点就是其全能性。全能性，即 一个分离的活细胞在合适的培养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。外源DNA直接导入受体植物外源DNA直接导入技术，是植物分子育种的内容之一。它不同于载体转化的基因工程技术，也有别于通过

52、杂交实现植物间基因交流的传统育种方式。而是以植物为受体，直接将带有目的性状的供体遗传物质(总DNA)或目的基因进行导入，创造大量的变异材料，通过筛选获得目的性状的后代，达到改良品种的目的。动物细胞动物细胞也可用作受体细胞，尤其是哺乳细胞作为受体细胞的优点是：能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪接加工成成熟的mRNA；真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产物具有较好的蛋白质免疫原性；易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性；经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。重组体的筛选与鉴定重组子指含有重组DNA分子的转化子。如果重组子中含有外源目的基因则成

53、为阳性克隆子或期望重组子。克隆子的筛选（screening） 通过某种特定的方法，例如核酸杂交以及免疫测定等，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正具有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。重组子的筛选可根据载体类型、受体细胞种类以及外源DNA分子导入受体细胞的手段等采用不同的方法。如：遗传检测法物理检测法核酸杂交检测法免疫化学检测法DNA-蛋白质筛选法转译筛选法遗传检测法1 根据载体表型特征选择重组体分子的直接筛选法：构建基因工程载体时，载体分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组子的筛选。选择培养基 根据

54、宿主细胞类型配置的培养基，在培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。选择物是由载体DNA分子上所携带的选择标记基因所决定，一般与标记基因的遗传表型相对应，主要有抗菌素和显色剂等。相应的筛选包括抗药性记号插入失活筛选、显色互补筛选等。插入失活利用载体上遗传标记内部的限制酶位点进行基因克隆时，由于外源DNA片段的插入可以导致该遗传标记灭活，即所谓插入失活。抗药性标记、 营养代谢标记都是克隆载体设计时考虑的插入失活标记。抗药性记号插入失活选择法；这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法，常用的选择标记物有：氨苄青霉素（ampicillin,Ap或Amp）氯霉素（chloramph

55、enicol,Cm或Cmp）卡那霉素（kanamycin,Kn或Kan）四环素（tetracymic,Tc或Tet）链霉素（strentomycin,Sm或Str）质粒及其药物抗性筛选用基因?-半乳糖苷酶显色反应选择法许多载体（如pUC系列质粒载体等）均含有一个大肠杆菌DNA的小片段，其中含有?-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调节序列和头146个氨基酸的编码信息。此编码区中插入了一个多克隆位点，可使少数几个氨基酸插入到?-半乳糖苷酶的氨基端但不会破坏读框。这些载体可与编码?-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主之间发生功能上的互补-?互补，产生具有完整?-半乳糖苷酶活性的Lac+细菌，它们在生色底物X-

56、gal（5-溴-4-氯-3-吲哚- ?-D-半乳糖苷）及诱导物IPTG（异丙基?-D-硫代-半乳糖苷）存在下形成兰色菌落。然而，外源DNA片段插入到质粒多克隆位点后，几乎不可避免的导致产生无?互补能力的氨基酸片段，因此，带重组质粒的细菌形成白色菌落。 ?-半乳糖苷酶基因 ?-半乳糖苷酶X-Gal(白色) 蓝色化合物 2 根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法这种方法所依据的原理是，转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。物理检测法凝胶电泳检测法；在转化子初步筛选的基础上进一步对重组子

57、进行筛选或鉴定，主要是根据有外源DNA片段插入的重组质粒与载体DNA之间大小的差异来区分重组子和非重组子。质粒DNA的电泳迁移率是与其分子量大小成比例的。因此，带有外源DNA插入序列的分子量较大的重组体DNA，在凝胶中的迁移，比不具有外源DNA插入序列的质粒DNA缓慢。此法直观快捷，尤适合用于插入片段较大的重组子的筛选。基本步骤：转化菌落在平板上长到直径2mm时，将菌落挑入50l的细菌裂解液（50mmol/L Tris-HCL, pH6.8; 1%SDS; 2mmol/L EDTA; 400mmol/L 蔗糖；0.01%溴酚蓝）中悬浮，37下保温15min后于4 ，12000r/min离心，然

58、后吸取30-35 l的上清液，立即进行1%琼脂糖（含0.5-1 g/ml的溴乙锭，EB）凝胶电泳，在短波紫外灯下观察质粒DNA分子的迁移距离。杂交检测法杂交反应主要有两种：原位（菌落或噬菌斑）杂交；分子杂交（Southern杂交和Northern杂交）。前一种方法是从大量重组克隆中筛选和鉴定目的克隆的有效手段，后一种是进行克隆基因分析、定位的常用方法。具有互补 的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA分子，当它们混合在一起时，其相应的同源区将会退火形成双链结构。依据这一原理用放射性同位素标记的DNA或RNA探针进行核酸杂交，已成为分子生物学中一种主要的DNA分析方法。Southern杂交和Nort

59、hern杂交这两种方法与原位杂交的最大区别是，用于杂交的核酸需经分离纯化、限制酶解、凝胶电泳分级，然后转移到硝酸纤维素滤膜等支持物上，再与相应的探针杂交。凝胶中DNA片段的相对位置DNA转移到滤膜的过程中继续保持着，而滤膜上的DNA条带与32P标记的探针杂交。通过放射自显影确定与探针互补的每一条带的位置，从而可以确定众多消化产物中含某一特定序列DNA片段的位置与大小。Southern杂交根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。Northern 杂

60、交主要针对RNA分子的检测，基本步骤和Southern 杂交相似。但RNA不易结合到硝酸纤维素滤膜上，经乙二醛-DMSO、氢氧化甲基汞或甲醛进行变性处理后， 才能牢固结合于滤膜上。同时，在RNA电泳时必须解决两个问题：一是防止单链RNA形成高级结构，故必须采用变性凝胶电泳；二是电泳过程中始终要有效抑制RNase的作用,防止RNA分子被降解破坏。上述两种杂交技术外，还有用于蛋白质分子杂交的方法，称为Western 杂交，是将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素125I标记的特定蛋白质抗体进行反应。原位杂交原位是指生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑，按照其原来的位置不变的