(甘博士)分子伴侣在胰岛素生产中的应用

1、分子伴侣理论在制造胰岛素中的应用甘李药业有限公司 甘忠如博士1主要内容胰岛素的生产胰岛素的质量控制探讨2胰岛素制造的历史进展年代胰岛素种类主要分离纯化方法胰岛素纯度20年代至40年代动物胰岛素结晶和重结晶约80%50年代至70年代动物胰岛素常规层析法离子交换层析分子筛约95%80年代至90年代重组人胰岛素生产型高效液相层析（HPLC）应用于胰岛素纯化99%90年代末至今胰岛素类似物表达系统的改进分子伴侣应用于胰岛素生产99%将来吸入胰岛素、开发胰岛素、基因治疗3重组人胰岛素表达方法的进展80年代初，A、B链分别表达，分别纯化80年代末：胰岛素原法90年代：分子伴侣理论的应用4SSSSSSCNB

2、r切开纯化表达表达CNBr切开纯化复性保护肽保护肽A链A链B链B链B链A链A、B链分别表达法5胰岛素原法表达CNBr切开纯化复性酶切纯化A链B链C肽保护肽6胰岛素原法的缺点工艺复杂复性率低：人胰岛素原有6个巯基要形成3个二硫键，有15种可能的组合，其中只有一种构象具有活性7人体内胰岛素表达图示DNAmRNAA链B链C肽分子伴侣复性表达翻译酶切8分子伴侣(Molecular Chaperone)分 子 伴 侣: 是一类蛋白质,其功能是帮助新合成 的蛋白质形成正确的二硫键及正确的 构象。(全过程称为蛋白质复性)分子伴侣分为: 分子间伴侣和分子内伴侣；二 者 区 别: 分子间伴侣和被复性的蛋白质没有

3、化 学键连接;而分子内伴侣则是和被复性 的蛋白质通过共价键连在一起,待复性 完毕后再切开。9SHSHSHSH甘李药业分子内伴侣理论在胰岛素生产中的应用复性SSSSSSB链A链融合蛋白酶切SHSHA链B链分子内伴侣分子内伴侣10SSSSSS胰岛素类似物或胰岛素分子内伴侣酶切纯化SSSSSSB链A链B链A链11分子内伴侣在胰岛素和类似物生产中的作用保护胰岛素在大肠杆菌内不被分解提高胰岛素表达量提高复性收率简化胰岛素和类似物的生产步骤12甘李公司生产工艺和国外公司的比较胰岛素原粗品胰岛素纯品胰岛素粗品还原和氧化纯化酶切,解离A、B链胰岛素原纯品纯化胰岛原融合蛋白无序胰岛素原胰岛素原（SSO3)6粗品

4、胰岛素原（SSO3)6纯品发酵裂解,去除保护多肽亚硫基化粗品纯化国外公司工艺无C肽胰岛素原融合蛋白发酵正确构象无C肽胰岛原纯品胰岛素粗品胰岛素纯品 复性酶切,解离A、B链纯化甘李公司工艺正确构象无C肽胰岛原粗品纯化共31步共17步13 Drug Biotechnology Regulation edited by Yuan-yuan H. Chiu, John L. Gueriguian P221-262 Production-Scale Purification Processes Walter F. Prouty Lilly Research Laboratories, Eli Lilly

5、 and Company, Indianapolis, Indiana引自1415判别胰岛素质量的标准通用标准（药典标准）纯度标准胰岛素制造过程中的金标准16项目/标准依据欧洲药典标准美国药典标准甘李公司标准相关物质不得过2.0%(包含A21)不得过2.0%(包含A21)不得过2.0%(包含A21)高分子蛋白不得过1.0%不得过1.0%不得过1.0%细菌内毒素不得过10EU/mg不得过10EU/mg不得过10EU/mg微生物限度不得过100CFU/g不得过300CFU/g不得过100CFU/g宿主蛋白不得过10PPM不得过10PPM不得过10PPM残余DNA无具体量的要求无具体量的要求不得过1

6、0ng/剂量效价测定按照干燥品计算,含人胰岛素不得少于27.5IU/mg按照干燥品计算,含人胰岛素不得少于27.5IU/mg按照干燥品计算,含人胰岛素不得少于27.5IU/mg17判别胰岛素质量的标准通用标准（药典标准）纯度标准胰岛素制造过程中的金标准18胰岛素制造的历史进展年代胰岛素种类主要分离纯化方法胰岛素纯度20年代至40年代动物胰岛素结晶和重结晶约80%50年代至70年代动物胰岛素常规层析法离子交换层析分子筛约95%80年代至90年代重组人胰岛素生产型高效液相层析（HPLC）应用于胰岛素纯化99%90年代末至今胰岛素类似物表达系统的改进分子伴侣应用于胰岛素生产99%将来吸入胰岛素、口服

7、胰岛素、基因治疗19用HPLC测定胰岛素效价误差小于5%（传统的小鼠惊厥法，误差20%）HPLC能检测出小于0.1%的杂质分析型高效液相层析（HPLC）是胰岛素质量控制的最重要的工具20分析型HPLC21 不同厂家胰岛素及类似物HPLC图谱比较原图谱22不同厂家胰岛素及类似物HPLC图谱比较8倍放大图谱23不同厂家胰岛素及类似物HPLC图谱比较80倍放大图谱24传统胰岛素纯度分类方法单峰胰岛素单组分胰岛素25探讨胰岛素价格与国家经济水平没有相关性不同剂型胰岛素的使用量与当地糖尿病治疗水平的相关性26重组人胰岛素在一些国家的零售价国家规格价格（$）每400单位价格 （人民币）巴西1000IU/瓶

8、4.514.9埃及400IU/瓶1.3511.2美国1000IU/瓶20.0867.0中国400IU/支8.8473.1跨国公司在各国的胰岛素销售价格和当地的经济水平无关系中国市场进口人胰岛素的价格和美国相近，但高于其他发展中国家5-6倍27埃及购买胰岛素发票1埃镑1.6人民币282005年第一季度天津海关胰岛素进口量进口胰岛素制剂23.2吨，价值2519万美元分别比去年同期增长61%和84.6摘自中国医药报：2005.5.10292003年中国胰岛素市场份额2003 IMS data302003年中国市场人胰岛素不同类别制剂市场份额（）2003 IMS data312003年上海市场人胰岛素不同类别制剂市场份额（）2003 IMS