ES细胞的诱导与应用课件

1、ES细胞的诱导与应用 第1页，共37页。本次课的主要内容ES细胞的定义，及其研究发展史。ES细胞的分离培养和生理特性。ES细胞的自我更新，诱导分化。ES细胞的应用前景和所面临的挑战。第2页，共37页。一、什么是ES细胞一般来讲，ES细胞是指从早期的囊胚中的内细胞团（inner cell mass, ICM)分离得到的具有无限增殖能力和多分化潜能的一类干细胞。两个重要特性： （1）多潜能性分化，可分化成三胚层以内的所有细胞。 （2）可无限的保持未分化状态，扩增传代。第3页，共37页。有关干细胞的概念一、定义：具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成 各种功能细胞。二、分类： (1)全能干细胞：

2、具有全能性，可以分化成全身200多种 细胞类型，进一步形成机体的任何组织和器官， 该类细胞包括，胚胎干细胞（embryonic stem cells)和生 殖干细胞（embryonic germ cells). (2)多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却 失去了发育成完整个体的能力。 (3)转能干细胞：只能向一种或密切相关的两种细胞类型 的细胞分化。第4页，共37页。第5页，共37页。二、胚胎干细胞研究的进展情况：1981年，Evans和Martin 分别成功的分离和体外培养了小鼠的胚胎干细胞。1995年，Thomson等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎干细胞。1998年，Tho

3、mson等建立了第一株人类胚胎干细胞。1998年，Shamblott等建立了第一株人类生殖干细胞。2006年，Yamanaka建立诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, IPS） 第6页，共37页。胚胎干细胞系的建立过程分离囊胚的内细胞群IPS 与成纤维细胞共培养，ES细胞 非分化增殖分离胚胎生殖腺脊细胞 -胚胎干细胞的鉴定-定向诱导分化-成体干细胞-功能细胞第7页，共37页。ES细胞培养过程第8页，共37页。利用体细胞核移植技术获取ESC第9页，共37页。ES与EG细胞第10页，共37页。ES细胞培养过程第11页，共37页。小鼠胚胎成纤维细胞的处理方法：

4、1、-射线照射法。2、丝裂霉素处理法。目的：使得作为饲养层的成纤维细胞停止分裂，但又不至于马上死亡，在体外维持一段时间生命，为ES细胞提供维持其生长和未分化状态的诸多细胞因子。第12页，共37页。IPS第13页，共37页。三、ES细胞的细胞特性1、细胞形态： 与早期胚胎细胞相似的形态结构特征，胞体体积小，核大，有一个或多个核仁，核仁清晰，多为常染色质，胞质结构简单，散布大量核糖体和线粒体。核型正常，具有稳定的整倍体核型。 第14页，共37页。三、ES细胞的细胞特性2、生长特性： ES细胞在体外分化抑制培养时，呈克隆状生长，细胞紧密的聚集在一起，圆形或卵圆形，细胞均呈单层或多层紧密堆积，形成岛状

5、或巢状的群体细胞克隆，细胞之间的界限不清，克隆周围可见单个ESC和分化的扁平状上皮细胞。第15页，共37页。第16页，共37页。第17页，共37页。四、ES细胞的分子生物学标志1、碱性磷酸酶（AKP） ES细胞含有丰富的碱性磷酸酶，活性高。但在已经分化的ES细胞中碱性磷酸酶则呈弱阳性或阴性，因此常作为ES细胞鉴别和区分ES细胞分化与否的重要标志之一。2、端粒酶 ES细胞表现出高水平的端粒酶活性，不同于正常的二倍体细胞，可能是其复制生命期限远比体细胞长的原因。研究发现，端粒酶的减少是细胞衰老的重要机制之一，但在ES细胞、生殖细胞和肿瘤细胞中，端粒酶呈高水平表达，具有高活性，在细胞每次分裂之后，可

6、保持端粒长度，进而维持细胞的长期存活。第18页，共37页。四、ES细胞的分子生物学标志3、胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA） SSEA是一种糖蛋白，常表达于胚胎发育早期的细胞，ES细胞中SSEA表达阳性，可作为ES细胞的标记分子之一，用于鉴别。 然而，不同种属的动物，其表面抗原组成并不完全一致。第19页，共37页。第20页，共37页。五、ES细胞的诱导分化 当鉴别一株细胞是不是ES细胞时，除了要经过以上的检测：形态和生长特性，染色体核型分析，特异性表面抗原等。更重要的是要看其是否具有多分化潜能。 ESC的诱导分化一般可分为：（1）体外诱导分化（2）定向诱导分化（3）体内分化第21页，共37页。

7、五、ES细胞的诱导分化干细胞诱导分化的常用方法：（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如 VGEF、bFGF 、DMSO和RA等。（2）将ES细胞与特定的细胞共培养。 （3）将某种分化诱导因子的基因转入ES 细胞内。 第22页，共37页。五、ES细胞的诱导分化（1）体外诱导分化： 其又可分为两种：去除抑制因子的细胞单层培养法。将ESC消化后不贴壁的悬浮或悬滴培养法：可形成EB，其在体外可诱导分化成各类细胞。常用的诱导剂：维甲酸（RA）、二甲基亚砜（DMSO）和环六甲基双乙胺（HMBA）等。第23页，共37页。五、ES细胞的诱导分化（1）定向诱导分化： 即是将ES细胞定向向某一种类型的细胞分化

8、，如向上皮细胞或成纤维细胞方向等。其成功与否，受到基因表达调控方面不同诱导调节因子、靶细胞状态及局部微环境等多因素的影响。其实质是细胞特异性基因在时间和空间上差次表达的结果，这种细胞间差异主要取决于哪些基因被激活和在什么时间与位点被激活。第24页，共37页。五、ES细胞的诱导分化（1）定向诱导分化： 例如，ESC在含DIA的条件培养基中呈未分化生长，去除DIA后，细胞则向中胚层分化，而在DIA和RA同时存在时，ESC可被诱导分化成体壁细胞。 ESC在高密度条件下生长时，可分化成多种不同类型的细胞，而在低密度条件下生长时，则只是分化成少数几种类型细胞。第25页，共37页。第26页，共37页。五、

9、ES细胞的诱导分化（3）体内分化： 将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成复杂的混合组织瘤，组成包含三个胚层。 Thomson将所建立的5个ESC系分别注射到重症联合免疫缺陷小鼠皮下，所形成的畸胎瘤中，包括胃上皮（内胚层）、软骨骨髓、平滑肌和横纹肌（中胚层）、多层鳞状上皮细胞（外胚层）。 第27页，共37页。A:神经上皮组织；B：软骨组织C：肌肉组织； D：消化道上皮组织第28页，共37页。五、ES细胞的诱导分化（4）嵌合体动物实验： 参与宿主胚胎发育，并形成嵌合体动物，包括生殖系嵌合体后代，是ESC的最基本特征。第29页，共37页。五、ES细胞的诱导分化（4）嵌合体动物实验： ESC与正常胚胎

10、嵌合，如能产生包括生殖系在内的各个组织器官，且能长生功能性配子的嵌合体（种系嵌合体），则可证实所分离得到的是具有发育全能性的ES细胞系。嵌合体实验通常有两种方法：胚胎聚集法。显微注射法。第30页，共37页。BALB/C-C57胚胎嵌合体小鼠第31页，共37页。六、ES细胞的应用 人体发生过程： 受精 卵裂 受精后72h 受精后5-7天精子+卵子 合子 卵裂球 桑椹胚 囊胚 滋养层胎盘及胎儿附属结构囊胚 内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。 内细胞群 中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层体表结构；神经系统第32页，共37页。六、ES细胞的应用第33页，共37页。七、ES细胞研究所面临的挑战和前景 存在问题：技术问题：基因机制不清，诱导分化不纯，移植不理想。安全性问题：肿瘤性伦理问题：全球性大讨论第34页，共37页。伦理问题 ES细胞研究涉及到人类胚胎、生命的权利、器官再造等一系列伦理学、宗教等敏感问题，使其一直为宗教和人权等组织所反对。美国有7个州禁止任何形式的克隆人行为，11 个州立法抵制胚胎干细胞研究。布什政府在，2001年批准联邦财政可以支持政府批准的干