药物分析学1维生素类药物分析(自学教学课件)

1、 各论第6章维生素类药物分析Analysis of Vitamins 1.掌握维生素类药物的结构与性质及分析方法之间的关系。2. 熟悉维生素类药物的鉴别试验、杂质检查和含量测定的方法原理与结果计算。3.了解维生素类药物分析方法的操作要点。Vitamins是维持人体正常代谢功能所必需的生物活性物质，是人们生活中必需的营养要素。从其结构来看，它们属于非蛋白质，非脂肪，非糖类的有机化合物。有些是醇、酯、有些是胺、酸，还有些是酚和醛类，它们具有各不相同的理化性质和生理活性。 按Vit在水中和油脂中的溶解度分为脂溶性和水溶性两大类。 Lipid-soluble 脂溶性Vit：A、D、E、K Water-

2、soluble 水溶性Vit：B族、C、烟酸（niconacid）、冷酸（pantothen）、叶酸(Folic Acid)Vit类的分析离采用化学和物理化学方法。具有一个共轭多烯醇侧链的环己烯 一、Vitamine ADEFINITIONVitamin A refers to a number of substances of very similar structure (including (Z)-isomers)found in animal tissues and possessing similar activity. The principal and biologically

3、mostactive substance is all-(E)-retinol (all-(E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-enyl)nona- 2,4,6,8-tetraen-1-ol; C20H30O). Vitamin A is generally used in the form of esters such as the acetate, propionate and palmitate.Synthetic retinol ester refers to an ester (acetate, propionate or pal

4、mitate) or a mixture of synthetic retinol esters.The activity of vitamin A is expressed in retinol equivalents (R.E.). 1 mg R.E. corresponds to the activity of 1 mg of all-(E)-retinol. The activity of the other retinol esters is calculated stoichiometrically, so that 1 mg R.E. of vitamin A correspon

5、ds to the activity of: 1.147 mg of all-(E)-retinol acetate; 1.195 mg of all-(E)-retinol propionate; 1.832 mg of all-(E)-retinol palmitate.International Units (IU) are also used to express the activity of vitamin A. 1 IU of vitamin A is equivalent to the activity of 0.300 g of all-(E)-retinol. The ac

6、tivity of the other retinol esters is calculated stoichiometrically, so that 1 IU of vitamin A is equivalent to the activity of: 0.344 g of all-(E)-retinol acetate; 0.359 g of all-(E)-retinol propionate; 0.550 g of all-(E)-retinol palmitate;1 mg of retinol equivalent is equivalent to 3333 IU.CHARACT

7、ERSAppearanceRetinol acetate: pale-yellow crystals (mp: about 60 C). Once melted retinol acetate tends to yield a supercooled melt.Retinol propionate: reddish-brown oily liquid.Retinol palmitate: a fat-like, light yellow solid or a yellow oily liquid, if melted (mp: about 26 C)SolubilityAll retinol

8、esters are practically insoluble in water, soluble or partly soluble in anhydrous ethanol and miscible with organic solvents.Vitamin A and its esters are very sensitive to the action of air, oxidising agents, acids, light and heat.Carry out the assay and all tests as rapidly as possible, avoiding ex

9、posure to actinic light and air, oxidising agents, oxidation catalysts (e.g. copper , iron), acids and heat; use freshly prepared solutions. VitA(部分A1)是鱼肝油的主要成分，但目前主要来源是人二合成品。VA不溶于水，但易溶于ether(Et2O)、Chloroform(CHCl3)、isopropyl alcohol、cyclohexane、fat and oil。主要有油剂、丸剂。 VitA尚有许多异构体，它们各具不同的理化性状及生物效价。鱼肝油

10、中还存在一些VitA2，其生物效价仅为VitA1的40%，去水VitA效价亦低于A1；鲸醇（系VitA醇的二聚物）则为非生物活性物质；但它们也有紫外吸收或可与显色剂反应，产生与VitA相同的颜色。因此，测定VitA时须考虑这些因素。 VA的结构特点与性质： 1溶解度 维生素A与氯仿、乙醚、环己烷或石油醚能任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶。2.聚多烯结构，易氧化性 VA分子中含有共轭多烯醇侧链，因此VA性质活泼，不稳定，（1）易被紫外光裂解，易被空气中的氧氧化，尤其是在加热和金属离子存在时更容易氧化变质，生成无生物活性的环氧化物，进一步氧化生成相应的醛及酸。所以VA需避光保存，并且常上加入合适

11、的抗氧剂。 （2）无空气时，见光聚合成二聚体 （3）长期放置发生异构化3丙烯醇型结构 （1）遇酸易脱水（质子酸HX，刘易斯酸SbCl3） （2）遇酸异构化 3V最大吸收 共轭多烯醇侧链结构，在325nm-328nm有最大吸收。共轭烯类化合物的V最在吸收，常用Woodward-Fieser规则计算，但这个规则仅适用于2-4个共轭双键体系，对于较高程度的共轭体系不太理想。于是Fioeser-Kuhns规则应运而生，这个规则可用于多烯共轭体系。 max（已烷）=114+5M+n（48.0-1.7n）-16.5Rendo-10Rexo M：烷基取代数目； n：共轭双键数目； Rendo：具有环内双键的

12、环数目； Rexo：具有环外双键的环数目。例：max（已烷） VA=114+56+5(48.0-1.75)-16.51-100 =325 （实测值326.5nm环已烷）IDENTIFICATIONA. Thin-layer chromatography (2.2.27).Test solution Prepare a solution containing about 3.3 IU of vitamin A per microlitre in cyclohexane R containing 1 g/l of butylhydroxytoluene R.Reference solutionPr

13、epare a 10 mg/ml solution of retinol esters CRS (i.e. 3.3 IU of each ester per microlitre) in cyclohexane R containing 1 g/l of butylhydroxytoluene R. PlateTLC silica gel F254 plate R.Mobile phaseether R, cyclohexane R (20:80 V/V).Application 3 l.Development Over 2/3 of the plate.DryingIn air.Detect

14、ionExamine in ultravioletTLC System suitabilityReference solution: the chromatogram shows the individual spots of the corresponding esters. The elution order from bottom to top is: retinol acetate, retinol propionate and retinol palmitate.ResultsThe composition of esters is confirmed by the correspo

15、ndence of the principal spot or spots of the test solution with those obtained with the reference solution.B. It complies with the test for related substances. 一、Identificationn （一）Carr-Price反应(SbCl3反应) VA在饱和无水SbCl3的无醇CHCl3 Soln中呈现不稳定蓝色，逐渐变成紫红色max620nm。To 1 mL of a chloroform solution of it containi

16、ng the equivalent of approximately 6 g of retinol, add 10 mL of antimony trichloride TS: a transient blue color appears at once. 蓝色 紫红色max620nm无醇CHCl3（二）V吸收光谱 植物油制成的油Soln，需检查酸值,过氧化值，溶剂无水乙醇-盐酸（100：1）max326 继续在水溶上加热30,迅速冷却，这时VAabs-alc中，在微量矿酸的催化下，失去一分子水而形成去水VA，并增加一个共轭双键，吸收峰长移（red shift)。吸收波长为348、367、38

17、9nm。Test solution for liquid form of vitamin a Dissolve a volume equivalent to about 15,000 USP Units in chloroform to obtain 10 mL of solution. for solid form of vitamin a Weigh a quantity equivalent to about 15,000 USP Units, place in a separator, add 75 mL of water, shake vigorously for 1 minute,

18、 extract with 10 mL of chloroform by shaking for 1 minute, and centrifuge to clarify the chloroform extract. Standard solution Dissolve the contents of 1 ampul of USP Vitamin A RS in chloroform to obtain 25.0 mL. Developing solvent system: a mixture of cyclohexane and ether (4:1). Procedure Apply at

19、 the starting point of the chromatogram 0.015 mL of the Standard solution and 0.01 mL of the Test solution, and proceed as directed for Thin-Layer Chromatography under Chromatography 621 . Allow the solvent front to move a distance of 10 cm, remove the plate, and air-dry. Spray with phosphomolybdic

20、acid TS: the blue-green spot formed is indicative of the presence of retinol. The approximate RF values of the predominant spots, corresponding to the different forms of retinol, are 0.1 for the alcohol form, 0.45 for the acetate, and 0.7 for the palmitate. （三）TLC固定相同硅胶，展开剂；环已烷-Et2O（4：1）；显色剂：SbCl3液、

21、磷钼酸. TLC 可分离醇式、乙酸酯、棕榈酸酯。 （四）加活性甘油1，3-二氯丙醇，显蓝色max555nm； （五）与H2SO4反应显蓝色TESTSRetinolThin-layer chromatography (2.2.27).Test solutionPrepare a solution in cyclohexane R, stabilised with a solution containing 1 g/l of butylhydroxytoluene R, containing about 330 IU of vitamin A per microlitre.Reference so

22、lutionShake 1 ml of the test solution with 20 ml of 0.1 M tetrabutylammonium hydroxide in 2-propanol for 2 min and dilute to 100 ml with cyclohexane R, stabilised with a solution containg 1 g/l of butylhydroxytoluene R.PlateTLC silica gel F254 plate R.Mobile phaseether R, cyclohexane R (20:80 V/V).A

23、pplication3 l. DevelopmentOver a path of 15 cm. DryingIn air.DetectionExamine in ultraviolet light at 254 nm.System suitability Reference solution: in the chromatogram obtained no or only traces of the retinol esters are seen.Limit Any spot corresponding to retinol in the chromatogram obtained with

24、the test solution is not more intense than the spot in the chromatogram obtained with the reference solution (1.0 per cent).Related substancesUltraviolet and visible absorption spectrophotometry (2.2.25).Test solutionThe solution described under Activity.Absorption maximumAt 325 nm to 327 nm.Absorba

25、nce ratios: A300/A326 = maximum 0.60; A350/A326 = maximum 0.54; A370/A326 = maximum 0.14.The thresholds indicated under Related substances (Table 2034.-1) in the general monograph Substances for pharmaceutical use (2034) do not apply.二、Assay1.计算V分光的度法 VA醇和其醋酸分子中具有五个双键组成的色烯其轭体系因而，在325-328nm间呈现选择性吸收峰，

26、故可用V分光的度法测VA的含量，Ch.P以及其他国家药典都采用本法测定VA。 但由于不同品种的肝油及VA合成品中，常含有其他异物体、中间体、副产物、氧化产物等其他不相关物质以及VA制剂中含有的稀释用油在325-328nm处也有吸收，干扰测定，甚至经过皂化，提取，精制，仍有杂质存在，为了消除不相关物质的干扰，Morton和Stubb等人经过研究提出了一个校正公式，简称M-S公式，用以消除杂质的影响。 B. (3E,5E,7E)-3,7-dimethyl-9-(1Z)-2,6,6-trimethylcyclohex-2-enylidenenona-1,3,5,7-tetraene (anhydro

27、-vitamin A)C. (3E,5E,7E)-3,7-dimethyl-9-(1Z)-2,6,6-trimethylcyclohex-2-enylidenenona-3,5,7-trien-1-ol(retro-vitamin A)D. oxidation products of vitamin A.测定方法与计算方法： 合成VA和天然鱼肝油中的VA是酯式VA。如供试品中干扰测定的杂质较少，符合下列方法测定规定时，可直接用溶媒溶解供试品后测定；否则应按第二法，经皂化提取，除去干扰后测定。含量以单位表示，每单位相当于全反式VA醋酸酯0.344g或醇0.300g 第一法 取酯式VA，精密稳定，

28、加环已烷制成1ml含9-15单位的溶液，照分光光度法，测定其吸收峰的波入，并在下列各波长处测定吸光度，计算测得的吸收度与波长328nm处的吸光度的比值和波长328nm处的 值。 nm 吸光度比值 300 0.555 316 0.907 328 1.000 340 0.811 360 0.299（1）如果吸收峰波长max在326-9nm之间，且所测得各波长的吸光度比值不超过表中规定的比值0.02。可用下式计算含量： 每1g供试品中含有VA的单位= （328nm）1900（2）如果吸收峰波长在326329nm之间，但所测得的各波长吸光度比值有的超过表中规定的0.02，则按下式求出校正后的吸光度，

29、A328（校正）=3.52(2A3282A316A340)（a）如果校正吸光度与未校正吸光度相差不超过3.0%，则不用校正吸收度，仍发来经校正的吸光度计算含量。 （b）如果校正吸光度与未校正吸光度相差在-15%-30%之间，则以校正吸光度计算含量。 （c）如果校正吸光度超过未校正吸光度的-15%或+3%，或吸收峰波长不在326-9nm之间，则供试品须按下述第二法测定。 例题：将某厂生产的维生素A醋酸酯，以环已烷为溶剂，配成10U/ml，然后按照Ch.P方法测定，其结果如下试计算该样品中的VitA醋酸的百分含量。 300 0.252 0.586 解：1. max位于326-9nm， 316 0.

30、385 0.907 2. A-A规定=0.586-0.555=0.0310.02 328 0.430 1.000 3. A328（校正）=3.52(20.43-0.385-0.35)=0.440 340 0.350 0.811 4. 100% = 100%=2.3% 360 0.129 0.299 在3%以内不用校正值。 5. VA%= 100%=81.7%max(nm) Ratio of A/A328nm Calculation 326-329 0.02 A328（correct）=3.52(2A328-A316-A340) 326-9 Method (A correctA)/A 计算IU/

31、g 3.0% E （328nm）1900 -15%-3.0% E （校正）1900 +3.0% Method 第二法 按Ch.P附录规定，精密称取500单位以上（2g）VA经皂化，提取后，制成含VA9-15单位的异丙醇Soln，在300，310，325，334nm处测定吸光度，并测定吸收峰波长。max323-327nm，且A300/A3250.73，则采用VD测定法第二法项下的纯化用色谱系统，准确收集流出的VA，N2吹干，再加异丙醇溶解，依法操作。 本法是用紫外分光光度法测定VA在特定波长处的吸光度来计算含量，以国际单位表示，每国际单位相当于0.344g的全反式VA醋酸酯或0.300g的全反式

32、VA醇。换算因数：换算因数=效价（IU/g）/E max所以 VA醋酸酯效价（IU/g）=106/0.344=2907000(IU/g) 换算因数=2907000/1530=1900VA醇效价（IU/g）=106/0.300=3330000(IU/g) 换算因数=3330000/1820=1830Note：本法校正公式系采用三点法，除其中一点是在吸收峰波长处测得外，其他两点分别在吸收峰两侧波长处测定，因此，仪器波长若不够准确时，即会有较大误差，故重测定前应校正仪器波长。 测定应在半暗室中尽快进行。ACTIVITYThe activity of the substance is determin

33、ed in order to be taken into account for the production of concentrates.Dissolve 25-100 mg, weighed with an accuracy of 0.1 per cent, in 5 ml of pentane R and dilute with 2-propanol R1 to a presumed concentration of 10 IU/ml to 15 IU/ml. Measure the absorbance (2.2.25) at the absorption maximum at 3

34、26 nm. Calculate the activity of vitamin A in International Units per gram from the expression:A326=absorbance at 326 nmm=mass of the substance to be examined, in gramsV=total volume to which the substance to be examined is diluted to give 10 IU/ml to 15 IU/ml1900=factor to convert the specific abso

35、rbance of esters of retinol into International Units per gramCHROMATOGRAPHIC METHOD Mobile PhaseUse n-hexane. System Suitability PreparationDissolve an accurately weighed quantity of retinyl palmitate and USP Vitamin A RS in n-hexane to obtain a solution containing about 7.5 g per mL of each. Standa

36、rd PreparationDissolve an accurately weighed quantity of USP Vitamin A RS in n-hexane, and dilute quantitatively, and stepwise if necessary, to obtain a solution having a known concentration of about 15 g of retinyl acetate per mL. Assay PreparationTransfer about 15 mg of ester (retinyl acetate or r

37、etinyl palmitate), accurately weighed, to a 100-mL volumetric flask, dissolve in and dilute with n-hexane to volume, and mix. Pipet 5.0 mL of this solution into a 50-mL volumetric flask, dilute with n-hexane to volume, and mix. Chromatographic System (see Chromatography 621 )The liquid chromatograph

38、 is equipped with a 325-nm detector and a 4.6-mm 15-cm column that contains packing L8. The flow rate is about 1 mL per minute. Chromatograph the System Suitability Preparation, and record the peak responses as directed for Procedure: the resolution, R, between retinyl acetate and retinyl palmitate

39、is not less than 10; and the relative standard deviation for replicate injections is not more than 3.0%. ProcedureSeparately inject equal volumes (about 40 L) of the Standard Preparation and the Assay Preparation into the chromatograph, record the chromatograms, and measure the responses for retinyl

40、 acetate obtained from the Standard Preparation and the peak area for retinyl acetate or retinyl palmitate in the chromatogram of the Assay Preparation. Calculate the quantity, in mg, of vitamin A as the retinol equivalent (C20H30O) in the portion of vitamin A taken by the formula: 0.872CD(rU / rS)i

41、n which 0.872 is the factor used to convert retinyl acetate, obtained from USP Vitamin A RS to its retinol equivalent; C is the concentration, in mg per mL, of USP Vitamin A RS in the Standard Preparation; D is the dilution factor, in mL, for the Assay Preparation; and rU and rS are the peak respons

42、es of the retinyl ester obtained from the Assay Preparation and the Standard Preparation, respectively. noteThe molar responses of retinyl acetate and retinyl palmitate are equivalent. 。SbCl3比色法 VA与SbCl3的无水CHCl3 Soln作用，呈现蓝色，在618-620nm有最大吸收，在一定范围内符合Beer定律。 注意：操作必须迅速；这是由于形成的蓝色稳定时间很短； 所用器皿必须干燥，若反应有痕量水分

43、存在，可使溶液变浑浊（系水解形成SbOCl所致）； 严格控制温度，呈现的蓝色与温度关系甚大，温度超过1，需要重作标准曲线。 测定天然VA，结果往往偏高，这个反应对VA不是专属反应，其他物质如新VA、去水VA及胡萝卜素等，均能与SbCl3显色。因此，药物分析中已被基本不用。但本法比较简便，目前，仍用于食品或饲料中VA的测定。 。共他方法（1）荧光法： 利用VA的环已烷Soln，在V光照射下发生绿色荧光，可用荧光分光光度法测定VA。 （）HPLC 近年来国外相继有人用HPLC测定VA，stationary phase：C18; mobile phase:0.4%正戊醇的正已烷Soln，Flow R

44、ate 1ml/min，Detect wavelength；254nm以邻苯二甲酸二甲酯为内标，方法测定了VAD乳剂中全反式VA的含量，VD没有干扰。 1。维生素A具有易被紫外光裂解、易被空气中氧或氧化剂氧化的性质，是由于分子中含（ ）A、环己烯基 B、2，6，6-三甲基环己烯基 C、伯醇基 D、乙醇基 E、共轭多烯醇侧链2。称取标示量为1g含维生素A100万单位的供试品0.1750g，用环己烷配成100ml溶液，精密量取此溶液1ml，用环己烷稀释至200ml。按药典规定测定300、316、328、340、和360nm波长处的吸光度，并计算与328nm处吸光度的比值，发现吸收峰波长在326-3

45、29nm之间，各波长吸光度比值超过药典规定的0.02，在波长316,328和340nm处的吸光度分别为0.4396，0.4737和0.3795，求该供试品含占标示量的百分含量。3按上题所述内容，当波长316，328和340nm波长处的吸光度分别为0.4396，0.4737和0.3750时，是否需要校正后的吸光度计算含量？求该供试品含占标示量的百分含量。 二、VitD族： R=-CH=CH=-CH（CH3）2 VitD2 R=-CH2CH2CH2CH（CH3）2 VitD3VD族都是甾醇衍生物，一般多用VitD2、D3。Vitamin D is a group of fat-soluble se

46、costeroids, the two major physiologically relevant forms of which are vitamin D2 (ergocalciferol) and vitamin D3 (cholecalciferol). Vitamin D without a subscript refers to either D2 or D3 or both. Vitamin D is produced in the skin of vertebrates after exposure to ultraviolet B light, and occurs natu

47、rally in a small range of foods. 1性状 维生素D2, D3均为无色针状结晶或者白色结晶性粉末；无臭、无味；遇光或者空气均易变质。2溶解性 维生素D2在氯仿中极易溶解，在乙醇，丙酮或者乙醚中易溶；维生素D3在乙醇，丙酮或者乙醚中极易溶解；二者均在植物油中略溶，在水中不溶。3不稳定性 维生素D2、D3因含有多个烯键，所以极不稳定，遇光或者空气及其他氧化剂均发生氧化而变质，使效价变低，毒性增强。本品对酸也不稳定。4旋光性 维生素D2具有六个手性碳原子，而维生素D3有5个手性碳原子，所以二者均具有旋光性。5甾类显色反应 本品的氯仿溶液，加醋酐与硫酸，显黄色，渐变红色，

48、迅速变为紫色，最后变为绿色。本反应为甾类化合物的共有反应。6紫外吸收特性 取本品，加无水乙醇溶解并定量稀释至每2ml中约含10g的溶液。照分光光度法，在265nm的波长处测定吸光度，维生素D2的吸收系数为460-490；维生素D3的吸收系数为465-495。Identifaction Tests（一）显色反应1. Conc. H2SO4-Ac2O反应：将VitD2、D3溶于CHCl3，加Ac2O和con.H2SO4强列振摇，维生素D2初显黄色，渐变红色，迅速变为紫色，最后成绿色。维生素D3初显黄色，逐渐变为红色，迅速变为紫色，蓝绿色，最后变为绿色。2.与三氯化锑反应 取本品适量（约1000单位

49、），加1，2-二氯乙烷1ml溶解，加三氯化锑4ml，溶液即显橙红色，逐渐变为粉红色。Detection of Impurities麦角甾醇的检查 ChP规定维生素D2检查麦角甾醇，而维生素D3则不作要求。 取本品10mg，加90%乙醇2ml溶解后，加洋地黄皂苷溶液（取洋地黄皂苷20mg，加90%乙醇2ml，加热溶解制成）2ml，混合放置18h，不得发生浑浊或沉淀。 Assay维生素D的含量测定方法各国药典各异。USP关于维生素D的测定方法有化学法、色谱法和微生物法；BP有化学法、光谱法和色谱法；而ChP采用NP-HPLC测定。维生素D（包括维生素D2和D3）及其制剂、维生素AD制剂或者鱼肝油中

50、所含维生素D及前维生素D经折算成维生素的总量，以单位表示，每单位相当于维生素D0.025g。无维生素A醇及其他杂质干扰的供试品可用第一法测定，否则应按第二法处理后测定；如果按第二法处理后，前维生素D峰仍受杂质干扰，仅有维生素D峰可以分离时，则应按第三法测定。 （一）第一法 色谱条件与系统适用性实验：用硅胶为填充剂，正己烷-正戊烷（9973）为流动相，检测波长为254nm。（二）第二法1.皂化提取 2. 色谱柱系统分离净化维生素D3.含量测定 三、VE（dl-Tocopheryl Acetate，消旋-生育酸醋酸酯） VE是与生殖功能有关的一类维生素的总称，在苯环上有一个酚羟基，故又称作业生育酚

51、，维生素E类已知有八种之多，主要有： 天然VE为右旋体，合成的为消旋体，一般药用为合成品。all-rac-2,5,7,8-Tetramethyl-2-(4,8,12-trimethyltridecyl)-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-6-ol.CHARACTERSAppearanceClear, colourless or yellowish-brown, viscous, oily liquid.SolubilityPractically insoluble in water, freely soluble in acetone, in anhydrous etha

52、nol, in methylene chloride and in fatty oils.维生素E为苯并二氢吡喃醇衍生物，苯环上有一个乙酰化的酚羟基，故又称生育酚（tocopherols）。化学名称为（）-2, 5, 7, 8-四甲基-2-（4, 8, 12-三甲基十二烷基）-6-苯并二氢吡喃醇醋酸酯。 物理性质VE为黄色或金黄粘稠透明液体，不溶于水，易溶于absolute alcohol, 丙酮，CHCl3，Et2O和石油醚。化学性质1.水解性：VE是苯骈二氢吡喃衍生物，苯环上有一个乙酰化的酚羟基具有水解性；。氧化性：本品在无氧或其他氧化剂存在时，在酸性或其他氧化剂存在时，则进一步氧化成醌式

53、化合物，在碱性条件下，加热时，这种氧化作用更易发生。光敏性：游离-生育酚，后暴露于空气和光线下，极易被氧化，其酯较稳定。4.紫外吸收特性 本品结构中苯环上有酚羟基，故有紫外吸收，其无水乙醇液在284nm的波长处有最大吸收，其吸收系数（E）为41.0-45.0。 （一）Identification Tests 1维生素E在硝酸酸性条件下，水解生成生育酚，生育酚被硝酸氧化为邻醌结构的生育红而显橙红色。 2VE遇弱氧化剂，如：FeCl3或O2，苯骈氢化吡喃环可被化开裂生成黄色的-生育酸对苯醌。生成的Fe2+与2，2-联吡啶反应生成深红色配位离子。 橙红色 红色3V 0.01%（W/V）abs-alc

54、. Soln. max284nm；min254nm 4硅胶G，环已烷-Et2O（4：1）;浓H2SO4，105-5min;可分离-生育醌。-生育酚、-生育酚醋酸酯和-生育醌的 Rf=0.5、0.7、0.9。. GC, IRIDENTIFICATIONFirst identification A, B.Second identification A, C.A. Optical rotation (2.2.7) : - 0.01 to + 0.01. Dissolve 2.50 g in anhydrous ethanol R and dilute to 25.0 ml with the same

55、 solvent.B. Infrared absorption spectrophotometry (2.2.24) . Comparison a-tocopherol CRS .C. Thin-layer chromatography (2.2.27) .Test solution Dissolve 10 mg of the substance to be examined in 2 ml of cyclohexane R .Reference solution Dissolve 10 mg of a-tocopherol CRS in 2 ml of cyclohexane R .Plat

56、e TLC silica gel F254 plate R.Mobile phase ether R, cyclohexane R (20:80 V/V).Application 10 l.Development Over 2/3 of the plate.Drying In a current of air.Detection Examine in ultraviolet light at 254 nm.Results The principal spot in the chromatogram obtained with the test solution is similar in po

57、sition and size to the principal spot in the chromatogram obtained with the reference solution.（二）Detection1.铈量法检查制备过程中未酯化的游离生育酚 由于游离VE在碱性条件下易被空气中的氧氧化，另一方面铈量法也要求在酸性Soln中进行，所以，用硫酸较为合适。 游离生育酚检查:0.1g +0.01mol/L Ce(SO4)21.0ml 计算L2.15%Ch.P ; BP(93)2，内标正三十二烷.VE原料、片、注射液、胶片、粉。 （二）HPLC（外标法）1色谱条件 十八烷基硅烷键合硅胶为固

58、定相,流动相为甲醇-水（491）；UV检测波长为292nm。生育酚和醋酸生育酚两峰的分离度应大于2.6，生育酚先出峰。峰高的RSD应小于0.8%。2分别测定维生素E的峰高Hx和Hr,按下列公式计算含量： 供试品中生育酚的量(mg)=mr式中mr为生育酚对照品的量(mg); Hx 和Hr分别为供试品和对照品中生育酚的峰高。3FeCl3-联吡啶比色法 原理利用碱性水解产生游离VE，再用Et2O提取，除尽Et2O，残渣溶于abs. alc，加FeCl3无水alc.试液和2、2-联吡啶 T.S，于520nm处测定吸光度。 本法适用于复合V制剂中VE的测定，还原性物质如抗氧剂和VA干扰测定。VA可预先经

59、氢化除去。4羟胺酸铁比色法 VE醋酸酯与盐酸羟胺、FeCl3，生成羟胺酸铁络合物，在480及510nm处有最大吸收，可用于比色测定。 5V、荧光法 Water Soluble（水溶性维生素） 一、VB1（Thiamine hydrochloride,盐酸硫胺） 维生素B1亦称盐酸硫胺是由氨基嘧啶环和噻唑环通过亚甲基连接而成的季氨类化合物，噻唑环上季氨及嘧啶环上上氨基，为两个碱性基团，可于酸成盐。 化学名为氯化4-甲基-3(2-甲基-4氨基-5-嘧啶基)甲基-5-(2-羟基乙基)噻唑翁离子酸盐。 本品是由氨基嘧啶和噻唑环通过次甲基连接而成季铵化合物，理化性质：1. 水溶性，水溶液pH3；2. 具

60、特殊的臭，味苦，3. 在中性或碱盐性环境中不稳定，易氧化；4. 氨基和杂环反应：生物碱沉淀试剂；5. 硫元素反应；6. Cl- 各国药曲收载有盐酸盐、硝酸盐、氢溴酸盐。（一）Identn. 1硫色素反应（Thiochrome） VB1在碱性SolN中可被铁氯化钾（或Hg Cl2，HgO等）氧化剂氧化形成硫色素。Thiochrome溶于正丁醇中显蓝色荧光，加酸荧光消失，再加碱，则荧光又会复现。 其原理是：噻唑环在碱性介质中被氧化，然后与嘧啶环上的氨基缩合生成硫色素。由于形成了杂环的积聚，闭合共轭体系伸长，最高吸收波长向波方向移动而产生荧光。 本反应为VB1所特有，各国药典以此作为鉴别和含量测定依