玉米顶腐病检验鉴定技术规程（征求意见稿）

1、PAGE 26PAGE 6ICS DB 62 甘 肃 省 地 方 标 准 DB62/T-2022玉米顶腐病检验鉴定技术规程（征求意见稿）-发布 -实施 甘肃省市场监督管理局 发布 目 次前言1.范围 12.规范性引用文件 13.术语与定义 14.原理 15.试剂与材料 16.仪器与用具 27.取样方法 28.田间症状鉴定 29.检验方法 310.结果判定411.样品保存与处理4附录A 培养基配方及制作方法5附录B 玉米顶腐病菌菌体形态特征6前 言本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则规定起草。 本文件由甘肃省农业农村厅提出并监督实施。 本文件由甘

2、肃省粮油作物栽培标准化技术委员会归口。 本文件主要起草单位：河西学院本文件参与起草单位：甘肃前进生物科技发展有限公司、甘肃省农业信息中心、高台县农业技术服务中心、临泽县农业技术推广中心、张掖国家级玉米种子生产基地种子质量监督检验中心、张掖市建国作物种质创新育种工作室、酒泉市通盈种苗有限公司本文件主要起草人：雷玉明、马金、张婧、郑天翔、公晓佳、刘晓刚、孙志、马丽娟、濮超、李自峰、李涛、杨国振、石建国、张琪 本文件由河西学院负责解释。各单位或个人在执行本文件过程中如发现需要修改和补充之处，请随时将意见和建议反馈至玉米顶腐病检验鉴定技术规程编制组（地址：甘肃省张掖市甘州区北环路846号河西学院，邮政

3、编码：734000，E-mail:,联系电话玉米顶腐病检验鉴定技术规程1.范围本文件规定了玉米顶腐病检验取样方法、田间症状识别、实验室检验、结果判断及样品保存与处理的技术要求。本文件适用于玉米制种亲本材料、杂交种玉米顶腐病的检验和鉴定。2.规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改单）适用于本标准。 本文件中未引用相关标准文本。 3.术语与定义 以下术语与定义适用于本文件。3.1亚粘团镰孢霉一种引起玉米顶腐病的真菌，属半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、瘤座

4、孢科、镰孢霉属的一种真菌。3.2 菌落筛选需要从分离培养基培养生长出的大量菌落中，根据菌落形状、颜色、大小、菌丝形态等的各种特征，从中挑选出具有明显表型特征的目标菌落的过程。3.3 转接 在无菌条件下，将目标菌落转移到适宜其生长的人工合成培养基而形成单一菌株的过程。4.原理 玉米顶腐病是一种土壤、种子传播的真菌性病害，其病原菌亚粘团镰孢霉主要在土壤、病残体、种子中越冬。玉米植株叶片、叶鞘、茎秆、果穗表现症状特征是玉米顶腐病田间诊断的初步依据；采用PSA培养基，从不同的带菌材料中分离出亚粘团镰孢霉根据病原菌形态特征最终进行玉米顶腐病鉴定。5.试剂与材料5.1 0.1%升汞 HgCl2称取升汞0.

5、1g，用少许酒精溶解，再加蒸馏水至100mL。5.2 乳酚油 将苯酚结晶加热熔化后取20mL加入20mL乳酸中搅拌均匀，再先后加入20%甘油40mL和蒸馏水20mL搅拌均匀。5.3 硫酸链霉素 C21H41N7O16S5.4 蔗糖 C12H22O11。5.5 琼脂 Agar5.6 马铃薯 potato6. 仪器及用具天平、高压灭菌锅、培养箱、生物显微镜、微量移液器、移液器、离心机、解剖刀、接种棒、培养皿、烧杯、载玻片、盖玻片、吸管等。7.取样方法7.1种子取样每个品种随机选取100粒种子，放入新种子袋，填写完整的取样标签，送实验室检验。7.2 组织取样7.2.1叶片、叶鞘取样出苗期至抽穗前、抽

6、穗后，进行田间调查，发现具有玉米顶腐病疑似叶片，取新鲜整个叶片、叶鞘，放入保鲜塑料袋或乳酚油的标本瓶中，送入实验室检验。7.2.2根系取样玉米16叶期，进行田间调查，挖下玉米顶腐病疑似植株，将发病根系剪下，放入保鲜塑料袋或乳酚油的标本瓶中，送入实验室检验。7.2.3茎杆取样 玉米抽穗前后，进行田间调查，取穗位节或穗位节以下玉米顶腐病疑似茎杆，放入保鲜塑料袋或乳酚油的标本瓶中，送入实验室检验。7.3土壤取样7.3.1定点取样对具有玉米顶腐病典型症状或疑似症状的植株，直接取植株根部周围0.2m20.3m2范围内、5cm深的表土，四分法制样后，取土样约500g送实验室检验。7.3.2随机取样对玉米顶

7、腐病发生田块进行整田病原调查时，对角线5点取样，每点在2m2 范围内取5cm深的表土约1000g，将各点土样混和后，四分法制样，取土样约500g送实验室检验。8 田间症状鉴定8.1畸形或枯死苗型出苗期，植株生长缓慢，叶片边缘失绿，出现黄色条斑，叶片皱缩、扭曲，叶缘出现“刀切状”缺刻，严重时幼苗基部变灰、变黄、变黑而形成枯死苗8.2叶缘缺刻型玉米抽穗前，玉米植株上部叶片基部或边缘出现缺刻状，其上下叶缘呈黄亮色条斑，严重时12个叶片的沿中脉半边或全叶脱落，仅剩中脉及中脉上残留的少量叶肉组织。8.3断叶状或枯死型玉米抽穗前，玉米植株上部叶片尖端呈黄褐色斑块，有时撕裂或呈断叶状，严重时顶端45叶尖端或

8、全叶枯死。8.4扭曲卷裹型玉米抽穗前，玉米植株顶端叶片扭曲卷缩呈鞭状直立或倾斜，有的形成鞭状时将新抽叶片卷裹不能伸展形成弓状，或缩成一团,缠结的叶片撕裂、皱缩。8.5弯头型玉米抽穗前，穗位节叶基和叶鞘发病变黄，叶基部缺刻状或撕裂，茎秆组织变黄软化，并向一侧倾斜，形成弯头。8.6顶叶丛生型玉米抽穗前，玉米植株顶端叶片丛生、直立。8.7叶片基部腐烂抽穗后，在穗位节上下叶片边缘产生灰褐色腐烂，并逐步向中脉扩展，叶基部出现不均匀褪绿，严重时叶肉全部腐烂或脱落，只留中脉。8.8叶鞘、茎秆腐烂 抽穗后，穗位节叶片基部变褐色腐烂的常在叶鞘和茎秆髓部也出现腐烂，鞘内侧和紧靠茎秆皮层呈铁锈色腐烂，剖开茎部，部维

9、管束和茎节出现淡褐色或红褐色病点或呈片状腐烂，重时从树干基部至穗位节呈黑褐色腐烂，的茎秆中空,内生灰白色霉状物，风时容易折倒。8.9空秆畸形型 抽穗后，玉米植株生长低矮、扭曲。雌、雄穗败育畸形或空秆，叶皱缩扭曲，抽穗结实，雌穗短小，籽少而不实。9检验方法9.1种子检验9.1.1吸水纸检验法将测定的玉米品种的种子先用蒸馏水冲洗2次,链霉素消毒，无菌水冲洗2次,然后,将种子放入垫有三层消毒吸水纸的90mm或120mm玻璃培养皿内，每皿放入10粒，每个品种测定10粒种子。重复4次，然后将种子放在2425恒温箱内培养8d10d，最后,用体视显微镜和高倍显微镜相结合观察种子上真菌菌落生长习性及形态特点。

10、9.1.2培养基检验法将玉米种子在70%酒精中浸15s20s，然后移入0.1%升汞液中杀菌0.5 min1min，再用无菌水冲洗3次。将经表面杀菌的玉米籽粒置于盛有PSA平板上，每皿摆放10粒，每一品种重复3次。于251温箱中培养4d5d，当种子周围长出菌丝体或种子表面有紫色霉层时，将菌丝或霉层移入PSA培养基上进行纯化培养，待长出子实体后进行真菌鉴定。PSA培养基配方及制作方法见附录A9.1.3菌落筛选和转接检查培养5d后的平板，若出现紫红菌落，将其转接至PDA培养基上，并在251黑暗培养4d5d。9.1.4病原菌鉴定观察微菌落的形成情况，并挑取种子周围菌体、PSA平板上的培养物进行显微镜检

11、查，根据附录B描述的病原菌形态特征进行鉴定。9.2组织检验9.2.1制样选取有典型症状的植株材料，叶片、叶鞘材料取病健交界处组织，切成大小为0.1cm0.2cm0.1cm0.2cm见方的组织块；根、茎杆材料直接切取维管束变色部分组织每个长约0.5cm。9.2.2病原菌分离培养将取得的植物组织置于PSA培养基平板上，每个平板放置10个，每个样品设3个重复。平板置于251黑暗培养5d，若组织周围出现紫红色菌落，将其转接至PSA培养基上获纯培养物，以备鉴定。9.2.3菌落筛选和转接方法同9.1.3。9.2.3病原菌鉴定 方法同9.1.4。9.3土壤检验9.3.1制样取待检土壤每个样100g放入500

12、ml烧杯中，加入100ml无菌水，充分搅拌1min，静止30s。取上层悬浮液备用。9.3.2病原菌分离培养取200l土壤悬浮液滴加于PSA培养基平板上，用接种棒涂抹均匀，每个样品设3个重复。平板置于251黑暗培养10d。9.3.3菌落筛选和转接方法同9.1.3。9.3.4病原鉴定 方法同9.1.4。10结果判定符合8中规定任何一种症状，且显微镜下观察其形态特征，符合附录B描述的亚粘团镰孢霉形态特征，培养物为引起玉米顶腐的病原菌，判断样品为玉米顶腐病。11样品保存与处理完成检验后，样品和分离物制成斜面试验菌种低温保存，制成浸渍标本或玻片标本，并妥善保存。使用的材料和用具，在使用完毕后进行煮沸、焚

13、烧等消毒除害处理。附录：附录A （规范性附录）培养基配方及制作方法A.PSA培养基配方及制作方法A.1配方 马铃薯200g，蔗糖10g20g，琼脂17g20g，硫酸链霉素，水1000ml。A.2 制作方法 将洗净去皮的马铃薯切碎，加水1000ml煮沸约20min30min，用纱布滤去马铃薯，加水补足1000ml；加入蔗糖和琼胶，加热使琼脂完全熔化后，分装，120125高压灭菌30min。附录B（规范性附录）玉米顶腐病菌菌体形态特征B.1 PSA培养基菌落特征B.1.1菌落形态 气生菌丝绒毛状至粉末状。B.1.2菌落颜色菌落2d3d为粉白，4d5d渐变为淡紫色，中部淡紫色，背面菌落淡黄色，边缘略呈淡紫色。B.2产孢方式产孢细胞内壁芽生，单、复瓶梗式产孢，以单瓶梗居多。B.3 小型分生孢子特征B.3.1形状特征小型分生孢子长椭圆形或拟纺锤形，较小，呈假头状不呈串珠状着生。B.3.2大小 大小5.7m13.5m2.3m5.1m，无隔或1隔。B.4大型分生孢子特征B.4.1形状特征镰刀形，较直而细长，脚胞足跟不十分明显，顶端渐尖。B.4.2大小具25隔