AD转基因小鼠的鉴定

1、转基因小鼠的鉴定剪鼠尾剪鼠尾的时间 当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。分辨小鼠的年龄a 当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生；b当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生23 天；c 当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生34 天；d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10 天左右；e 当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12 天左右；f 当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14 天左右。剪鼠尾后对小鼠的标记 ：打耳孔法从鼠尾中提取DNA采用鼠尾基因组DNA1取试剂盒（康为世纪：cw2094）提取DNA操作如下：剪

2、取小鼠长度为0.4-0.6cm的尾巴，放入灭菌后的离心管中，力口入180仙L BufferGTT震荡混匀。加入20（! L proteinase K ,涡旋震荡，彻底混匀。置于 56 水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化 6-8h ，赋予过程中涡旋震 荡，使样品均匀分离。一、/-.、二注意：1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20仙lproteinase K 消化，不会影响后续操作。2）如需去除RNA可在上述步骤完成后，加入 4屋 浓度为100mg/N l的RNase A 溶液，震荡混匀，室温放置5-10min 。14000rpm 离心 1min ，以消除未消化的类似

3、于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌的离心管中。力口入200仙l Buffer GL ,涡旋震荡，充分混匀，加入 200仙l无水乙醇，涡旋振 荡，充分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。一、/-.、二注意：1）加入 Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。如果多个样品一起操作， Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。将步骤 5 中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中， 若以此不能加完溶液，可分多次转入。 10000rpm 离心 1min ，倒掉收集管中的废液，将吸附

4、柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入 500履Buffer GW 1使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm离心 1min ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入 500履Buffer GW2使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm离心 1min ， 倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中。 如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤8。12000rpm 离心 2min ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切，PCR）0将吸附柱置于一个新的灭过菌的离心管中，

5、向吸附柱的中间部位悬空加入50-200屋Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5min , 10000rpm离心1min ,收集DNA 溶液， -20保存 DNA。注意：1）如果下游实验对PH值或EDTAs感，可以用灭菌水洗脱，洗脱液的 PH值对洗脱 效率有很大影响，若用水作洗脱液应保证其 PH值在7.0-8.5直接，PH值低于7.0 时洗脱效率不高。2）离心前室温孵育5min 可增加产量。3）用另外的50-200L Buffer GE 或灭菌水再次洗脱可以增加产量。4）如果需要提高DNA勺终浓度，可以将步骤10所得的DNA1脱液重新加至吸附膜 上，重复步骤10;若洗脱体积小于200仙L,可

6、以增加DNA勺终浓度，但可能会减 少总产量。PCRPCR序设定：1 = 94.0 C for 5:00 2= 94.0 C for 1:00 3= 59.0 C for 0:50 4= 72.0 C for 1:00 5= Goto 2 2times 6= 94 c for0:50 7= 58 c for 0:50 8 = 72C for 1:00 9= Goto 6 2times 10= 94.0 C for 0:50 11 = 56.0 C for 0:50 12= 72.0 C for 1:00 13= Goto10 32times 14= 72.0 C for 10:00 15= 4.

7、0 C for 5:00 16= END目前实验室的双转基因小鼠 AD体系采用： PCRS应的体系（12膜）：APP TOC o 1-5 h z Primer APP-1 1.3履Primer APP-2 1.3履ddHO2 仙 lmix （CW0682 6 a l DNA 1 仙 1PCRS应的体系（12膜）：PS1Primer PS1-1 1.3履Primer PS1-2 1.3履内参-11川内参-21LI 1mix （CW0682 6 a lDNA 1 仙1先在1.5ml的EP管中加入总的体系再平均分装入各个 PCRt中（一般多加两小管的 量），将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP

8、管中缓慢抽吸若干次（尽量避免产生气 泡）以便Taq酶混合均匀，最后再在各 PCRt中依次加入DNA羊品。引物处理方法：引物在安基生物有限公司合成后，EP管上会有标记，一般为x nmol, 使用前先用12000rpm离心1min，加入10 x叱l ddHO,涡旋振动混匀，微型离心机离心， 即可得到100仙M的母液，取10仙l的母液，用ddH2O稀释10倍，即加入90仙l ,混匀后 即可得到10M的引物工作液。电泳 配胶：鉴定用的胶板有大、中、小 3 种，分别用的梳子为50、 25、 11 齿。分别用的0.5*TBE的量为90ml、45ml、25ml。用1.5%的琼脂糖凝胶。点样：12屋 的DNA Marker加5仙l。点样时注意逐个